第八章 蛋白表達(dá)系

1、第八章第八章 蛋白表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)系統(tǒng) 基因工程意味著重要的植物或動物蛋白基因可以從宿主中分離出來，插入載體， “carriers”將運載外源基因到宿主細(xì)胞中，然后被轉(zhuǎn)化成蛋白。經(jīng)過許多年的發(fā)展，蛋白生產(chǎn)能力的提高已經(jīng)在進一步理解基因的功能和所編碼蛋白的功用和相互作用等方面起到了積極作用。8.1 大腸桿菌中表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中表達(dá)系統(tǒng) 如果將外源基因插入標(biāo)準(zhǔn)的克隆載如果將外源基因插入標(biāo)準(zhǔn)的克隆載體，不可能合成重組蛋白，因為基因體，不可能合成重組蛋白，因為基因的表達(dá)依賴于基因周圍的一組信號，的表達(dá)依賴于基因周圍的一組信號，這些信號必須能被細(xì)菌識別。這些信這些信號必須能被細(xì)菌識別。這些信號都是一些短

2、的核苷酸序列，為轉(zhuǎn)錄號都是一些短的核苷酸序列，為轉(zhuǎn)錄和翻譯提供信號：和翻譯提供信號： 8.1.1外源基因在大腸桿菌中外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理高效表達(dá)的原理三個最重要的信號：三個最重要的信號： l1 1） promoter: promoter: 是轉(zhuǎn)錄起始信號，在是轉(zhuǎn)錄起始信號，在E. E. colicoli中，啟動子必須能被中，啟動子必須能被RNARNA聚合酶的聚合酶的sigmasigma亞亞基所識別?；R別。l2 2） TeminatorTeminator：轉(zhuǎn)錄結(jié)束的位點，終止子：轉(zhuǎn)錄結(jié)束的位點，終止子一般是可以自我配對形成一般是可以自我配對形成stem-loopstem-loo

3、p的核苷的核苷酸序列。酸序列。l3 3） 核糖體結(jié)合位點：能被核糖體識別的位核糖體結(jié)合位點：能被核糖體識別的位點，轉(zhuǎn)錄成點，轉(zhuǎn)錄成mRNAmRNA分子后，核糖體在這一分子后，核糖體在這一位點上結(jié)合。位點上結(jié)合。 圖圖8-1 8-1 基因表達(dá)的信號基因表達(dá)的信號 1. 1. 啟動子啟動子 啟動子是表達(dá)載體的最重要的組成啟動子是表達(dá)載體的最重要的組成成分，這是因為啟動子控制了基因表成分，這是因為啟動子控制了基因表達(dá)的第一個階段，決定了達(dá)的第一個階段，決定了mRNAmRNA合成合成的速度。獲得重組蛋白的數(shù)量很大程的速度。獲得重組蛋白的數(shù)量很大程度上取決于表達(dá)載體所攜帶的啟動子。度上取決于表達(dá)載體所攜

4、帶的啟動子。幾種使用頻率最高的啟動子：幾種使用頻率最高的啟動子： l1) 1) laclac啟動子：控制編碼啟動子：控制編碼-乳糖苷酶的乳糖苷酶的lacZlacZ基因轉(zhuǎn)錄的序列，可以被基因轉(zhuǎn)錄的序列，可以被IPTGIPTG所誘導(dǎo)，所所誘導(dǎo)，所以加入誘導(dǎo)物后，可以誘導(dǎo)啟動子下游的以加入誘導(dǎo)物后，可以誘導(dǎo)啟動子下游的外源基因的表達(dá)。外源基因的表達(dá)。l2) 2) trptrp啟動子：色氨酸啟動子可以被色氨酸啟動子：色氨酸啟動子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被抑制，也可以很容易的被3-3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸誘導(dǎo)。誘導(dǎo)。幾種使用頻率最高的啟動子：l3) 3) tactac啟動子：是啟動子：是lacl

5、ac和和trptrp啟動子的雜啟動子的雜交分子，比兩者都要強，同樣可以被交分子，比兩者都要強，同樣可以被IPTGIPTG所誘導(dǎo)。所誘導(dǎo)。l4) PL4) PL啟動子：是負(fù)責(zé)啟動子：是負(fù)責(zé) DNA DNA分子轉(zhuǎn)分子轉(zhuǎn)錄的啟動子之一。錄的啟動子之一。 2. 2. 終止子終止子l外源基因在強啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生外源基因在強啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNARNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNADNA序列，形成長短序列，形成長短不一的不一的mRNAmRNA混合物?；旌衔?。目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子目前

6、外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子l來自大腸桿菌來自大腸桿菌rRNArRNA操縱子上的操縱子上的rrnT1T2rrnT1T2lT7T7噬菌體噬菌體DNADNA上的上的T T 3.3.核糖體結(jié)合位點l外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNAmRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。的翻譯起始效率密切相關(guān)。lmRNAmRNA翻譯的起始效率主要由翻譯的起始效率主要由其其5 5 端的結(jié)構(gòu)端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBSRBS）Shine-Shi

7、ne-DalgarnoDalgarno（SDSD）序列）序列l(wèi)位于翻譯起始密碼子上游的位于翻譯起始密碼子上游的6-86-8個核苷酸序列個核苷酸序列5 5 UAAGGAGG 3UAAGGAGG 3，即，即Shine-Shine-DalgarnoDalgarno（SDSD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S 16S rRNArRNA 3 3端區(qū)域端區(qū)域3 AUUCCUCC 53 AUUCCUCC 5并與并與之專一性結(jié)合，之專一性結(jié)合，將將mRNAmRNA定位于核糖體上，從定位于核糖體上，從而啟動翻譯。而啟動翻譯。8.1.2 E. coli中重組蛋

8、白的問題中重組蛋白的問題 在在E. E. colicoli中生產(chǎn)蛋白仍然存在許多問題中生產(chǎn)蛋白仍然存在許多問題這些問題可以分為兩大類：這些問題可以分為兩大類：l外源基因的序列；外源基因的序列；lE. E. colicoli合成重組蛋白存在限制。合成重組蛋白存在限制。 1. 1.外源基因序列導(dǎo)致的問題外源基因序列導(dǎo)致的問題 有三種方式可能導(dǎo)致核苷酸序列阻止外源有三種方式可能導(dǎo)致核苷酸序列阻止外源基因在基因在E. E. colicoli中的高效表達(dá)：中的高效表達(dá)：l1 1） 外源基因可能含有內(nèi)元。外源基因可能含有內(nèi)元。E. E. colicoli缺乏切除內(nèi)缺乏切除內(nèi)元的機制。元的機制。l2 2）

9、外源基因可能含有在外源基因可能含有在E. E. colicoli作為終止子的序作為終止子的序列。列。l3 3） 基因的密碼子可能不適合于基因的密碼子可能不適合于E. E. colicoli中翻譯。中翻譯。 解決方法：解決方法：l如果克隆的基因含有內(nèi)元，可以使用如果克隆的基因含有內(nèi)元，可以使用mRNAmRNAl定點突變的方法改變可能的終止序列。定點突變的方法改變可能的終止序列。l用用E. E. colicoli偏愛的密碼子。另外一個方法，對偏愛的密碼子。另外一個方法，對于小于于小于2kb2kb的基因可以利用化學(xué)合成的片段的基因可以利用化學(xué)合成的片段來代替，利用氨基酸序列作為參考，使用來代替，利用

10、氨基酸序列作為參考，使用E. E. colicoli偏愛的密碼子，并保證不會有提前存在偏愛的密碼子，并保證不會有提前存在的終止序列。的終止序列。 偏愛密碼子的問題偏愛密碼子的問題 2. E. 2. E. colicoli合成重組蛋白的限制合成重組蛋白的限制 利用利用E. E. colicoli作為寄主細(xì)胞合成重組蛋白作為寄主細(xì)胞合成重組蛋白可能遇到的問題與細(xì)菌的遺傳特性有關(guān)可能遇到的問題與細(xì)菌的遺傳特性有關(guān) l1 1） E. E. colicoli不能加工成正確的重組蛋白。不能加工成正確的重組蛋白。 l2 2） E. E. colicoli不能正確的折疊蛋白，形成無活不能正確的折疊蛋白，形成無

11、活性蛋白。性蛋白。 l3 3） E. E. colicoli可能降解重組蛋白?？赡芙到庵亟M蛋白。 解決方法解決方法l最主要的問題是糖基化的問題，到目最主要的問題是糖基化的問題，到目前為止仍然是無法解決的問題前為止仍然是無法解決的問題 l正確折疊也可以通過選擇特異的寄主正確折疊也可以通過選擇特異的寄主品系來解決。品系來解決。l重組蛋白降解的問題可以使用一個或重組蛋白降解的問題可以使用一個或多個蛋白酶突變多個蛋白酶突變E. E. colicoli來解決。來解決。8.1.38.1.3真核基因在原核生物中表達(dá)真核基因在原核生物中表達(dá)可能遇到以下幾個問題：可能遇到以下幾個問題：l細(xì)菌的細(xì)菌的RNARNA

12、聚合酶不識別真核啟動子；聚合酶不識別真核啟動子；l真核基因轉(zhuǎn)錄真核基因轉(zhuǎn)錄出出mRNAmRNA無與原核核糖體無與原核核糖體結(jié)合的結(jié)合的S-DS-D序列；序列；l真核基因產(chǎn)生真核基因產(chǎn)生的的mRNAmRNA有內(nèi)含子，細(xì)菌有內(nèi)含子，細(xì)菌無剪接機制；無剪接機制；l真核基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)加工，糖基化，而真核基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)加工，糖基化，而原核生物無；原核生物無；l真核基因產(chǎn)物被原核蛋白酶識別降解。真核基因產(chǎn)物被原核蛋白酶識別降解。解決的辦法：解決的辦法：l將真核生物的基因放在原核生物強將真核生物的基因放在原核生物強啟動子之下；啟動子之下；l在接在接S-DS-D序列；序列；l克隆克隆cDNAcDNA；l在細(xì)菌

13、中合成無活性蛋白，在體外在細(xì)菌中合成無活性蛋白，在體外加工；加工；l 用特定的變種宿主減少降解。用特定的變種宿主減少降解。 8.2 8.2 真核生物表達(dá)系統(tǒng)真核生物表達(dá)系統(tǒng) 8.2.1酵母菌表達(dá)系統(tǒng)酵母菌表達(dá)系統(tǒng)8.2.2昆蟲表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)8.2.3哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)8.2.1酵母菌表達(dá)系統(tǒng)酵母菌表達(dá)系統(tǒng) 酵母表達(dá)系統(tǒng)擁有轉(zhuǎn)錄后加工修飾功能，酵母表達(dá)系統(tǒng)擁有轉(zhuǎn)錄后加工修飾功能，操作簡便，成本低廉，適合于穩(wěn)定表達(dá)有操作簡便，成本低廉，適合于穩(wěn)定表達(dá)有功能的外源蛋白質(zhì)，而且可大規(guī)模發(fā)酵，功能的外源蛋白質(zhì)，而且可大規(guī)模發(fā)酵，是最理想的重組真核蛋白質(zhì)生產(chǎn)制備用工是最理想的重組真核蛋

14、白質(zhì)生產(chǎn)制備用工具。具。1.酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點 l酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。1.酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點l酵母表達(dá)外源基因具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質(zhì)具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質(zhì)較原核表達(dá)的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定，特別適合于表達(dá)真核生物基因和制備有功能的表達(dá)蛋白質(zhì)。1.酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點l某些酵母表達(dá)系統(tǒng)具有外分泌信號序列，能夠?qū)⑺磉_(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，因此很容易純化。1.酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點l應(yīng)用酵母表達(dá)系

15、統(tǒng)生產(chǎn)外源基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物時也有不足之處，如產(chǎn)物蛋白質(zhì)的不均一、信號肽加工不完全、內(nèi)部降解、多聚體形成等，造成表達(dá)蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的不一致。l另外，還時常遇到表達(dá)產(chǎn)物的過度糖基化情況。解決內(nèi)部降解的方法有三：解決內(nèi)部降解的方法有三：l一是在培養(yǎng)基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通過增加酶作用底物來緩解蛋白水解作用；l二是將培養(yǎng)基的pH值調(diào)成酸性(酵母可在pH3.08.0的范圍內(nèi)生長)，以抑制中性蛋白酶的活性；l三是利用蛋白酶缺失酵母突變體進行外源基因的表達(dá)。2.常用酵母表達(dá)系統(tǒng)常用酵母表達(dá)系統(tǒng)(宿主宿主-載體系統(tǒng)載體系統(tǒng)) l（1）釀酒酵母(Saccharomyces cerevi

16、siae)表達(dá)系統(tǒng)l（2）甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng) l（3）裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表達(dá)系統(tǒng)（1）釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)）釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)l釀酒酵母本身含有質(zhì)粒，其表達(dá)載體可以有自主復(fù)制型和整合型兩種。自主復(fù)制型質(zhì)粒自主復(fù)制型質(zhì)粒l自主復(fù)制型質(zhì)粒通常有30個或更多的拷貝，含有自動復(fù)制序列(automaticreplicating sequence，ARS)，能夠獨立于酵母染色體外進行復(fù)制 ，這些質(zhì)粒往往不穩(wěn)定。整合型質(zhì)粒不含整合型質(zhì)粒不含ARSl整合型質(zhì)粒不含ARS，必需整合到染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制。整合過程是高特異性的，但是拷貝數(shù)很低。為此，人們設(shè)計了pMIRY2(f

17、or multiple integration into ribosomal DNin yeast)質(zhì)粒，旨在將目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇為酵母基因組中串聯(lián)存在的150個重復(fù)序列)，因此利用pMIRY2質(zhì)粒可以得到100個以上的拷貝。l釀酒酵母表達(dá)的外源蛋白質(zhì)往往被高度糖基化，糖鏈上可以帶有40個以上的甘露糖殘基，產(chǎn)物的抗原性明顯增強。所以，釀酒酵母常常用來制備亞單位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。 （2）甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)）甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)甲醇營養(yǎng)型酵母包括l漢森酵母屬(Hansenula)l畢赤酵母屬(Pichia)l球擬酵母屬(Torulopsis)等 能在

18、以甲醇為唯一能源和碳源的培養(yǎng)基上生長，甲醇可以誘導(dǎo)它們表達(dá)甲醇代謝所需的酶，如醇氧化酶I(AOX1)，二羥丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脫氫酶(FMD)等。l甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)以巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)最為常用，它由野生型石油酵母Y11430突變而來，常用的3株宿主菌是GS115，KM71 和 MCIO0-3。lGS115和KM71是Y1 1430的組氨醇脫氫酶基因(histidinol dehydrogenase gene，h/s4)缺失突變體，不能合成 H/s4，因此質(zhì)粒載體需攜帶h/s4，轉(zhuǎn)染后的陽性重組子可以用h/s4缺陷 (h/s4-)平板進行篩選。

19、l巴斯德畢赤酵母包括自我復(fù)制型游離載體和整合型載體，前者極不穩(wěn)定，因此一般采用整合型載體。整合型載體含有一個啟動子、相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄終止密碼、篩選標(biāo)記、抗生素抗性基因、在細(xì)菌中進行拷貝增殖所必需的序列以及3 AOX1非編碼區(qū)序列P。l巴斯德畢赤酵母具有翻譯后修飾功能，如信號肽加工、蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵形成和糖基化作用等其與糖基化位點其他哺乳動物細(xì)胞相同，一般只有814個甘露糖殘基，特別適合于生產(chǎn)醫(yī)藥用重組蛋白質(zhì)。 （3）裂殖酵母表達(dá)系統(tǒng)）裂殖酵母表達(dá)系統(tǒng) l裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有許多與高等真核細(xì)胞相似的特性，它所表達(dá)的外源基因產(chǎn)物具有相應(yīng)天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象和活性。3.利用酵母菌表達(dá)外源基因的

20、步驟利用酵母菌表達(dá)外源基因的步驟 以巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因為例，包括如下步驟：l將目的基因克隆入畢赤酵母表達(dá)載體，收獲陽性重組表達(dá)質(zhì)粒l用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化陽性重組質(zhì)粒，使之線性化l將線性化的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人巴斯德畢赤酵母菌株(如GS1 15，KM71)l將轉(zhuǎn)化物接種HIS4缺陷平板進行第一輪篩選l用不同濃度的G418 （一種氨基糖苷類抗生素）平板進行第二輪篩選l挑選1020個克隆進行小規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)，鑒定外源基因的表達(dá)量l挑選高水平表達(dá)菌株進行大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)以制備外源基因的表達(dá)蛋白質(zhì)。 4.在酵母表達(dá)載體中高效表達(dá)外源基因的策略在酵母表達(dá)載體中高效表達(dá)外源基因的策略l（1）增加整合在酵母染色體上的目的基因劑量 適當(dāng)增加目的基因整合到酵母染色體上的拷貝數(shù)(即基因劑量)是有效提高外源基因表達(dá)量的基本策略。lClare等在利用畢赤酵母表達(dá)破傷風(fēng)毒素片段時發(fā)現(xiàn)，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量與外源基因片段表達(dá)單元整合到酵母染色體上的拷貝數(shù)直接相關(guān)。表達(dá)單元拷貝數(shù)越多，酵母分泌的重組蛋白質(zhì)量越高。lVassi|eva等叫在利用畢赤酵母研究乙肝表面抗原的表達(dá)時報道，基因劑量與表達(dá)水平呈明顯的依賴性關(guān)系，4個拷貝的基因劑量可以使表達(dá)水平提高4倍。（2）控制外源基因中的）控制外源基因中的AT含量含量l研究發(fā)現(xiàn)外源基因的AT含量直接影響其整合表達(dá)。Score等在研究HIV-1外殼蛋白的酵母表達(dá)時