第六章：以大腸桿菌為宿主的克隆載體

1、第六章：以大腸桿菌為宿主的克隆載體第二章中我們已經介紹了克隆載體的種類及特性：克隆載體的種類及特性：（1）質粒（plasmid）載體（又可分為：克隆載體、中間載體、穿梭載體和表達載體）（2）噬菌體（phage）載體 A、噬菌體 B、考斯質粒（粘性質粒）（cosmid) C、M13DNA（單鏈絲狀噬菌體）（3）酵母人工染色體載體（YAC）（4）細菌人工染色體載體（BAC）（5）其他載體在細菌質粒、細菌噬菌體載體、細菌人工染色體載體（在細菌質粒、細菌噬菌體載體、細菌人工染色體載體（BAC）中，）中，有許多是以大腸桿菌為宿主（寄主或受體）的載體。有許多是以大腸桿菌為宿主（寄主或受體）的載體。如：如：

2、細菌質粒中的：細菌質粒中的：1、pBR322、 2、pBR325、pBR327 3、pUC質粒質粒、4、pGEM3Z、5、pCAMBIA1391、 pCAMBIA1300 細菌噬菌體載體中的：細菌噬菌體載體中的： 噬菌體載體噬菌體載體（lambda phage vector) 絲狀噬菌體絲狀噬菌體：M13等本章將列舉幾個具有代表性的以大腸桿菌為宿主的載體，詳細介紹本章將列舉幾個具有代表性的以大腸桿菌為宿主的載體，詳細介紹大腸桿菌的克隆載體（大腸桿菌的克隆載體（pBR-和和pUC-系列，系列，M13和和噬菌體載體）的噬菌體載體）的結構、特征、來源、命名以及這些載體的特殊用途。結構、特征、來源、命

3、名以及這些載體的特殊用途。6.1 以大腸桿菌質粒為基礎的質?？寺≥d體以大腸桿菌質粒為基礎的質?？寺≥d體 6.1.1 質?？寺≥d體的命名 6.1.2 pBR322的優(yōu)點 6.1.3 pBR322的家譜 6.1.4 其他典型的大腸桿菌質粒克隆載體6.2 基于基于M13 噬菌體的克隆載體噬菌體的克隆載體 6.2.1 M13mp2克隆載體的構建 6.2.2 M13mp7 -另一種具有對稱的克隆位點的簡單的克隆載體 6.2.3 其它M13系列載體 6.2.4 質粒和M13的雜交載體6.3 -細菌噬菌體克隆載體細菌噬菌體克隆載體 6.3.1 細菌噬菌體基因組結構分析 6.3.2 通過自然選擇可以分離出缺少

4、一定的限制性位點的-噬菌體 6.3.3 插入載體（insertion）和置換載體（substitution vector） 6.3.4 使用-插入載體或者置換載體進行的克隆實驗 6.3.5 柯斯質粒載體(cosmid vectors) 6.3.6 用-載體進行基因文庫篩選6.1 以大腸桿菌質粒為基礎的以大腸桿菌質粒為基礎的質?？寺≥d體質粒克隆載體 DNA克隆中使用最多的、最簡單的克隆載體是由小的細菌質粒演化來的。 利用E.coli作為宿主的質粒載體種類很多。 它們具有許多有用的特性：容易提取、轉化效率高、攜帶篩選標記（轉化體和重組體） ，還可用它來克隆很大的DNA-片段（達8kb）。這樣的載體

5、在大多數常規(guī)克隆實驗中都會使用。 pBR322是最早被構建至今仍被廣泛使用的載體。 6.1.1 質?？寺≥d體的命名質?？寺≥d體的命名 pBR322這個名字符合載體命名法的標準規(guī)則。 “p” ” plasmid的首字母，說明是一個質粒。 “BR”指組建這個質粒的實驗室（ BR代表了兩個構建人的名字：Bolivar和Rodriguez）。 “322”是將該質粒與同一個實驗室中發(fā)展的其它質粒區(qū)分開的編號（比如還有pBR325，pBR327，pBR328等）。質粒載體的基因和物理圖分析（以pBR322為例）6.1.2 pBR322的優(yōu)點： 1、具有較小的相對分子質量：只有4363bp（一個克隆載體的大

6、小應該小于10kb）。 2、兩個抗生素抗性選擇標記基因（ampR和TetR），而且每個抗性基因內都有限制性單酶切位點，可導致抗性基因插入失活。 3、相當高的拷貝數：通常在被轉化的E.coli中有大約15個pBR322質粒分子，而且在氯霉素存在下，經過擴增每個細胞中拷貝數可達1000-3000個。1)、 pBR322的的大小 pBR322長4363bp，一般情況下，一個克隆載體的長度應小于10kb，才能在純化過程中不會斷裂。長度為4363bp的pBR322有利于我們很容易地分離它，而且用它組建的重組DNA-分子也容易分離。即使要插入的DNA 有6kb長，這個重組的pBR322分子也在允許的范圍之

7、內。2)、兩個抗生素抗性基因、兩個抗生素抗性基因 pBR322的第二個特征是它攜帶氨芐青霉素和四環(huán)素氨芐青霉素和四環(huán)素兩個抗生素抗性基因。我們可以利用氨芐青霉素或四環(huán)素氨芐青霉素或四環(huán)素作為含有這種質粒的細胞標記。在這兩個基因里，只要有一個限制性酶切位點，就可以被克隆實驗所用。實際上在pBR322質粒載體中的兩個抗生素抗性基因編碼區(qū)存在許多限制性內切酶位點: PstI、PvuI和ScaI位于氨芐青霉素氨芐青霉素編碼區(qū)，Sal I、 Eag I 、BamHI和HindIII等則位于四環(huán)素四環(huán)素編碼區(qū)，將pBR322用限制性內切酶PstI、PvuI或ScaI切開后，加入一個新的DNA-片段，amp

8、R基因就失去活性。如果我們用位于TetR抗性基因編碼區(qū)中存在的任一種限制性內切酶（特別是BamHI或HindIII）處理，對四環(huán)素的抗性也就消失。這樣，許多不同的限制性位點可用作DNA-片段插入位置，根據抗性基因失活進行篩選；并且，還可以在pBR322中克隆具有各種不同粘性末端（8種酶中的任一種）的DNA-片段。3)、 pBR322的的拷貝數很多 一般，在一個轉化的E.coli細胞中有大約15個質粒DNA分子，這個數目可以通過使用一種蛋白質合成抑制物，如氯霉素氯霉素（chloramphenicol）而增加到1000-3000個。因此，一次E.coli培養(yǎng)就可提供大量的重組pBR322分子。pB

9、R322由3個在自然界存在的天然質粒拼接而成。 R1（ampR）：抗生素耐藥性質粒R1， R6-5（TetR）：抗生素耐藥性質粒R6-5， pMB1（復制起點）：ColE1菌株中生產大腸桿菌素的質粒。 pBR322的詳細建造過程見圖6-2a。6.1.3 pBR322的家譜：6.1.4 其他典型的大腸桿菌其他典型的大腸桿菌質粒克隆載體質粒克隆載體大腸桿菌質粒克隆載體很多，并且，許多大腸桿菌質粒克隆載體都與pBR322的特性和用途非常相似。我們重點介紹由pBR322改造來的四個載體：pBR325 、pAT153和pBR327、pUC8 。這些載體中，每個載體都有一個附加的特征，使它們在一定的克隆實

10、驗中比原來的質粒具有更明顯的優(yōu)點。 pBR325質粒圖譜質粒圖譜pBR325 具有三個可選擇的標記具有三個可選擇的標記pBR325很明顯地是一個具有附加DNA-片段的pBR322質粒，這個片段含有一個氯霉素-乙酰轉移酶（CAT），它可以使氯霉素失活，使質粒具有抗氯霉素抗性。在這個質粒中CAT-基因中有唯一的一個EcoRI切點。如果用這個切點進行克隆，就可根據對氯霉素抗性的喪失來識別重組體。與pBR322相比，pBR325有兩個優(yōu)點：1）多了一個用于克隆的限制性識別位點（pBR322也有一個EcoRI切點，但它既不在ampR,也不在tetR基因里）2）第三個用作選擇標記的抗生素抗性基因。pAT1

11、53和和pBR327 pAT153和和pBR327都是多拷貝質粒都是多拷貝質粒 這兩種質粒均來自這兩種質粒均來自pBR322，在構建時，并非關系到新的，在構建時，并非關系到新的選擇標記或者附加限制性位點。組建這兩個質粒時，選擇標記或者附加限制性位點。組建這兩個質粒時，pBR322的一大段被切去，在的一大段被切去，在pAT153里切掉了里切掉了705bp，而在而在pBR327則切掉了則切掉了1089 bp。ampR和和tetR則完整保留則完整保留著。但質粒的復制特征和連接特征發(fā)生了變化。著。但質粒的復制特征和連接特征發(fā)生了變化。 pAT153、pBR327與與pBR322的區(qū)別的區(qū)別： pAT1

12、53和和pBR327與與pBR322有兩方面的區(qū)別有兩方面的區(qū)別：pAT153和和pBR327的拷貝數都多于的拷貝數都多于pBR322 在總的拷貝數上前兩者為30-45個分子。這個特性對質粒產量沒有多大意義，因為對所有這三種質粒來說，通過擴增其拷貝數可提高到1000個。在正常細胞中的較高的拷貝數利于在實驗室中研究克隆基因的功能。這種情況下，基因量（gendosis）很重要，因為拷貝數越高，實驗中克隆基因對宿主細胞的影響作用越容易觀察到。對此類研究，pAT153和pBR327就比pBR322更合適。在在pAT153和和pBR327中中pBR322的連接特性被破壞了的連接特性被破壞了。 pAT15

13、3和和pBR327成為非接合性質粒成為非接合性質粒，不能轉移到其它的E.coli細胞中。這對生物的安全有意義對生物的安全有意義，這一特性可避免重組的pAT153和pBR327分子從試管中泄漏，而侵入到工作馬虎的分子生物學工作者的腸道菌群里去。與此相反，pBR322理論上可以通過連接轉移到E.coli的自然種群里，實際上，這種質粒也具有保護功能，使這種轉移過程成為不可能。因此如果某個克隆基因在發(fā)生事故時會有危險，還是最好使用pAT153和pBR327。在在pBR322基礎上切掉了基礎上切掉了705bp(3273bp)在在pBR322基礎上切掉了基礎上切掉了1089 bp pUC8 pUC8可依靠

14、LacZ-基因通過藍白斑輔助篩選。 pUC8來自pBR322，僅保留了其復制起點和ampR基因。并且這個抗性基因的核苷酸序列也發(fā)生了改變：原來抗性基因里的限制性內切酶位點已不存在。在pUC8里這些酶切位點都集中于LacZ基因的序列中。pUC8具有兩個優(yōu)點具有兩個優(yōu)點： 首先首先，可以將含有重組pUC8分子的E.coli細胞在含氨芐青霉素和X-Gal的瓊脂糖板上只需一步就可識別出來。如果用介紹過的其它載體則需要兩個步驟：例如，如果用pBR322，就必須將復制板從一個含抗生素的基質轉到含另一種抗生素的基質上。找出在新的基質上不生長的對應的菌落即是含有重組質粒的菌落。 第二個優(yōu)點第二個優(yōu)點就是它眾多

15、的限制性酶切點，在具體操作中，我們可以用兩個具有不同限制性內切酶酶切末端的DNA-片段進行克?。ㄈ鏓coRI和BamHI末端），進行DNA-片段克隆時靈活性更大。 另外另外，這個載體中的酶切點的集中位點與相應的M13mp載體系列的位置相同。在pUC8中克隆DNA，也可以直接導入M13mp8，并以這種形式通過測序和體外突變進行分析。其它其它pUC系列質粒：系列質粒：pUC18和和pUC19同pUC8類似，pUC18和pUC19也來自于pBR322，優(yōu)點： ColE1復制起點，松弛性，高拷貝，Rop基因（控制拷貝數的基因）突變，松弛性更強。Amp(R) 在MCS（多克隆位點）處，pUC18和pUC

16、19具有更多種類的常用內切酶位點。 互補（在MCS中插入外源片段后，可通過互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質粒） 小分子質粒（小于3000bp)pUC18和pUC19是最常用的質粒載體，幾乎未含多余的DNA片段?？截悢担?00-2000裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記 lacZ用于基因克隆和測序重要的大腸桿菌質粒載體：pUC18/pUC19pGEM3Z載體載體 pGEM3Z載體也含有ampR 和lacZ基因,并且在lacZ基因內部有一個限制性內切酶位點，此外pGEM3Z載體中限制性內切酶位點兩邊還多了兩個短片段，每一個片段都可充當啟動子，可附著RNA聚合酶進行轉錄。外源DNA在限制性

17、內切酶位點被導入pGEM3Z載體后，重組后的pGEM3Z質粒和提純的RNA聚合酶在試管中可實現RNA的轉錄。pGEM3Z質粒攜帶的啟動子并不是被大腸桿菌RNA聚合酶識別的標準啟動子，而是被T7噬菌體編碼的RNA聚合酶及SP6噬菌體編碼的RNA聚合酶專一識別，因此體外RNA合成系統(tǒng)選擇的是病毒RNA聚合酶。6.26.2 基于基于M13 噬菌體的克隆載體噬菌體的克隆載體 噬菌體的DNA分子攜帶較多的復制必須的基因，包括噬菌體蛋白質衣殼組成部分和噬菌體專性復制酶的基因。如果這些基因中的任何一個改變或缺失，就防礙或破壞噬菌體DNA分子的復制能力。因此，噬菌體的DNA分子可被改變的余地就很?。ㄊ删w克隆

18、載體一般與原始的噬菌體分子的區(qū)別就很?。?。 正常的M13基因組為6.4kb長，僅10個相鄰的基因就占了大部分（圖6-6），這些基因對噬菌體的復制是必不可少的，不能被破壞。M13只在一個507個核苷酸長的序列中可以插入新的DNA，并且在這個區(qū)域里，還有一個復制起點（ori），它本身也必須完整存在不能被破壞。因此，改變M13基因組的可能性是有限的。 可插入可插入DNA片段片段的區(qū)域的區(qū)域 6.2.1 M13mp2克隆載體的構建克隆載體的構建 盡管M13基因組被改變的可能性是有限的，但通過對M13進行改造，人們仍得到了一些基于M13建造的載體。M13克隆載體的第一步就是將LacZ-基因插入到基因間的

19、序列中。這樣就產生了M13mp1，它在X-gal瓊脂糖板上形成藍色噬菌斑，M13mp1在LacZ-基因中沒有限制性切點，因此M13mp1不能用于基因克隆操作，但M13mp1載體中，在LacZ基因的起始點附近有6個核苷酸GGATTC，通過交換其中的一個就變成了GAATTC，剛好就是EcoRI的切點。這個改變我們可以通過體外突變來實現，結果就產生了基于M13mp1改造產生的最為簡單的M13mp2載體（圖6-7b）。 M13mp2的LacZ-基因的起始點附近GGATTC，變成了GAATTC后，這個序列位點三聯密碼子編碼的氨基酸由天冬酰胺變成了天冬氨酸。但這個變化并沒有影響到被M13mp2侵染的細胞生

20、產有功能的-半乳糖苷酶的能力。M13mp2是最簡單的M13克隆載體。在克隆位點可插入具有EcoRI粘性末端的DNA-片段，在X-Gal 瓊脂糖板上重組體呈現出透明的噬菌斑，我們可以據此進行重組體篩選。6.2.2 M13mp7 -另一種具有對稱的克隆位點另一種具有對稱的克隆位點的簡單的克隆載體的簡單的克隆載體： M13mp2是最簡單的M13克隆載體。在克隆位點可插入具有EcoRI粘性末端的DNA-片段，這樣的載體由于只具有單一的EcoRI酶切位點進行克隆操作時非常不方便，發(fā)展M13載體的下一步中，是給LacZ基因里插入另外更多的限制性酶切點，具體方法是：在試管中合成一個多聚銜接物銜接物，即一個含

21、有：EcoRI的粘性末端的粘性末端和一系列的酶切點序列一系列的酶切點序列的短的核苷酸鏈（圖6-8a）。我們將這個多聚銜接物插入到M13mp2的EcoRI 切點上，就形成了M13mp7 （圖6-8b），它有4個克隆位點（EcoRI、BamHI、PstI和 SalI(也被AccI、HincII識別)），是一個較好的載體。插入M13mp2的這個多聚銜接物并沒有將LacZ-基因破壞（插入這個序列后，在這個序列中沒有出現終止密碼子，沒有改變密碼子的讀碼框，因此沒有破壞原來氨基酸序列，只是在其編碼的氨基酸序列中增加了幾個氨基酸殘基），最終形成的是一個和原來一樣有功能的、但改變了部分氨基酸序列的-半乳糖苷酶

22、（圖6-8b）。 如果將M13mp7用EcoR I、BamH I或者Sal I 處理，這個多聚銜接物就全部或部分地被切下來（圖6-9a）。在有新的DNA-片段存在時進行連接，就有下列三種情況發(fā)生（圖6-9b）：1)、新的DNA被插入2)、插入多聚銜接物3)、載體的末端連接起來，而沒有加入新的片段 和多聚銜接物相比，插入的DNA要長得多，難以避免終止子的出現或者插入點后-半乳糖苷酶序列的改變，因此，新的DNA的插入總會使-半乳糖苷酶的合成停止，這樣X-Gal瓊脂板上重組體噬菌斑看起來就是透明的（圖6-9c）。相反，如果多聚銜接物重新插入，就形成了原來的M13mp7載體，噬菌斑呈現藍色。如果載體與

23、載體連接起來，而沒有插入新的DNA或銜接物，載體自身連接總會產生一個有功能的-半乳糖苷酶的基因，形成的仍是藍色噬菌斑。這種選擇很明顯，只有重組的M13mp7才形成透明的噬菌斑。 具有對稱克隆位點的M13mp7有個很大優(yōu)點：插入到BamHI，SalI或PstI位點的DNA片段，都可以用位于多克隆位點最外端的EcoRI將被克隆的DNA很容易地重新切下來（圖6-10）。M13mp7是僅有的少數幾個這種類型的載體之一。在克隆實驗中，這樣的載體很有意義。圖圖610：在多：在多聚銜接物的較外聚銜接物的較外位點的限制性切位點的限制性切割，從一個重組割，從一個重組的的M13mp7-分子分子重新獲得被克隆重新獲

24、得被克隆的的DNA 圖6-10 還為我們說明了同尾酶在基因操作中的應用帶給我們的方便：目的DNA具有一個內切酶Sau3A的粘末端 GATC （5），而載體M13mp7則是用BamHI消化的，也具有GATC（5）末端。連接之后，BamHI的識別序列就不復存在（因為Sau3A的識別序列 GATC兩側可以是任意一個核苷酸，而BamHI識別序列的兩側必須有固定的核苷酸（GGATCC），前面是G，后面為C。連接之后，這個條件都不能滿足，只能用Sau3A才可以將目的DNA片段重新切下。但是，在M13 （及M13mp7）上有很多Sau3A識別位點，因此不能再使用Sau3A切下連入的外源DNA片段（思考一下為

25、什么？）。但使用EcoRI就可以重新切下連入的DNA 片段。6.2.3 其它其它M13系列載體系列載體M13mp8 在M13-載體里的LacZ-基因中又插入較復雜的多聚銜接物還可得到一系列具有其它用途及特點的載體。一個例子就是(圖6-11a的)M13mp8這個pUC8的對應物（ M13mp8 中的LacZ-基因中插入了同pUC8 相同的具有多個限制性酶切點的序列）。 M13mp8與質粒載體pUC8相同，可以接受具有兩個不同粘性末端的DNA-片段。 M13mp9載體M13mp9有另一個特點：它具有與M13mp8相同的多聚銜接物，但方向相反。一個在M13mp8中克隆的DNA-片段，用兩種限制性酶切

26、下來，然后插入到M13mp9中，在那里方向同樣相反（圖6-11c）。這對DNA的測序以及構建有正確讀碼框的表達載體十分重要，在測序時，從多聚體銜接物的一個末端開始，向著插入的DNA的方向讀出核苷酸的序列（圖圖6-11d）。在較早的測序分析中，我們最多可讀出400個核苷酸，如果插入的DNA較長，它的另一端的序列就不知道。因此，我們將這段DNA切下來插入到第二個載體中，使這個片段顛倒過來。對新的克隆重新測序，就得到了這段DNA的另一端的序列。至于表達載體的構建我們知道每一個基因對應的序列都是有確定的方向性的，而連入表達載體的序列必需保證其連入方向正確，這在基因操作中有時是非常棘手的，但像 M13m

27、p8/ M13mp9以及我們在第二章提到的pBluescript KS() 或SK( )為我們提供極大的方便。這在以后的實驗操作中會有所體會。此外還有幾個來自M13的載體。M13mp10/11、M13mp18/19它們都與M13mp8/9相似，但它們的多聚銜接物有區(qū)別，因此，限制性酶切點也不同。 6.2.4 質粒和質粒和M13的雜交載體的雜交載體 前面提到，M13基因組被改變的可能性是有限的，M13-載體的缺陷是：克隆到它里面的DNA-長度是有限的，其上限通常為1500bp，偶而也可達到3000bp。但第二章中我們提到過，M13有一個非常有用的特點：它可以獲得克隆的單鏈形式。這樣一個特點為發(fā)展

28、復雜的M13克隆載體提供了極大的方便。將M13-基因組的一部分和質粒-片段結合到一起。比如將M13的一個長1300bp片段連接到pUC8-質粒中形成的 pEMBL8（圖6-12a)。pEMBL8的特點：的特點： 來自M13的這一段含有一種酶基因（這種酶可以將雙鏈的M13分子在噬菌體釋放之前轉化成單鏈形式）的信號序列。即使這個序列被從M13基因組其它部分分開，它還是和原來一樣有效。因此，來自M13的復制蛋白能夠結合到這個信號序列上，從雙鏈的pEMBL8分子復制成單鏈的pEMBL8分子。但由于M13的許多基因（包括外殼蛋白基因）已經缺少，因此，不能形成完整的噬菌體顆粒（圖6-12b）。在使用pEM

29、BL8的克隆實驗中，必須將用作宿主的E.coli細胞用一個正常的M13-噬菌體侵染，這個M13-噬菌體是作為輔助噬菌體（helperphage）起作用，它可以供給必須的復制酶以及組成噬菌體衣殼的蛋白質。因為pEMBL8由pUC8而來的，它在LacZ-基因里也具有多聚銜接物克隆位點，這樣，我們就可以將重組噬菌體在X-Gal瓊脂糖基質上進行篩選。pEMBL8同 M13mp2 以及通過改變銜接物衍生的一系列M13mp類載體（M13mp2-11）相比，使用pEMBL8可以獲得單鏈的長達10kb的克隆DNA-片段，而M13mp系列載體能插入的片段則相當有限（1500-3000bp)，這樣就使M13-克隆

30、系統(tǒng)的使用范圍擴展了很多。 圖圖: 6-12 pEMBL8: 一個一個來自質粒和來自質粒和M13的雜交載體的雜交載體, 它它可以被轉化成單可以被轉化成單鏈形式鏈形式 6.36.3 -細菌噬菌體克隆載體細菌噬菌體克隆載體最初由-細菌噬菌體衍生的克隆載體具有很大的局限：-分子大小僅允許超過其本身的5%，才可以被包裝；這相當于-細菌噬菌體克隆載體最多附加3kb長的DNA-分子，如果它的總長度超過52kb，就不能被包裝到-頭狀結構中去，這樣就不能形成有感染能力的噬菌體顆粒。因此，在還沒有改建的-載體中插入的DNA-分子的長度非常有限（圖6-13a）?；蚪M很大，載體上含有多種限制性內切酶的多個切點。通

31、過限制性切割，不可能將一個正常的-DNA切開成一條完整的單鏈用于連接一個新的外源DNA片段，-分子會被斷成許多小的片段，在重新連接時，它們就不可能按照原來順序連接起來，也就不能形成有功能的-基因組（圖6-13b）。6.3.1 細菌噬菌體基因組結構分析細菌噬菌體基因組結構分析-DNA基因組結構特征 -DNA基因組結構特征基因組結構特征 頭部蛋白質合成基因 尾部蛋白質合成基因 溶源整合相關基因，原噬菌體切除基因。 調控基因 盡管細菌噬菌體改造有許多困難，人們通過對其基因組功能的分析發(fā)現可以從-DNA的中部去掉一大段（溶源整合相關基因，原噬菌體切除基因）而不影響噬菌體對E.coli細胞的侵染力，這個

32、發(fā)現為發(fā)展一系列的-克隆載體鋪平了道路。它們最主要的應用區(qū)域就是克隆5-40kb這樣長的片段。這樣長的分子已超過質粒載體或者M13載體的接受范圍。細菌噬菌體的改造細菌噬菌體的改造 研究證明去掉圖6-14中b2 整合與切除位點的15kb部分或全部（對生命不重要區(qū)域）不影響噬菌體對E.coli細胞的侵染力 ，這樣，-DNA的長度就減小了15kb，就意味著可以插入18kb的新的DNA，才能達到包裝長度上限臨界值（圖6-14）。這個去掉的區(qū)域包括參與-前噬菌體的整合和將其從染色體上切下的基因的一大部分。也就是說，改變了它的整合性能。 縮短了的-基因組因此不再是溶源性的，僅能進行裂解循環(huán)。這個特性已經是

33、我們所希望的一個克隆載體所具有的，因為這樣，我們不需要誘發(fā)噬菌體，噬菌斑也可以形成。6.3.2 通過自然選擇可以分離出缺少一通過自然選擇可以分離出缺少一定的限制性位點的定的限制性位點的-噬菌體噬菌體 對一個已經被縮短了的-基因組來說，它的大部分限制性內切酶的多個識別位點仍然存在。要想從-基因組發(fā)展成克隆載體時，就必須將一個或多個這樣的識別位點除去。為此，我們只能使用體外誘發(fā)突變（體外誘發(fā)突變（in vitro mutagenesis）技術。 要獲得缺少幾個不需要的限制性切點的-種系，最多使用的還是自然選擇。為此，我們選擇一個產生EcoRI酶的E.coli種系，用DNA-分子侵染。進入這些細胞的

34、大多數DNA-分子由于含有EcoRI酶識別位點因而大多數都被EcoRI酶破壞掉，僅有幾個幸存下來而形成噬菌斑。這些就是突變體，它們的一個或多個EcoRI切點自發(fā)地消失了（圖6-15）。在經過數次侵染循環(huán)就會產生一種-分子，它的大多數或所有的EcoRI識別位點已不存在。（同樣用含其它內切酶的菌株來篩選到含有其它酶切位點的突變體）。圖5-15 借助于自然選擇對缺少EcoRI切點的-噬菌體的分離 6.3.3 插入載體（插入載體（insertion）和置換載體）和置換載體（substitution vector） 最早從-分子發(fā)展的兩組載體就是 a). ). -插入載體和 b). ). -(置換)取代

35、載體。a). ). 插入載體：插入載體：對一個插入載體來說，我們是在-分子不重要的區(qū)域中切掉了一大段，然后再將-分子的兩個臂連接起來。這類載體最少有一個限制性酶切位點，可以在這個位點插入新的DNA-分子。這種載體可以接受DNA-片段的大小取決于切去的片段長度。最受歡迎的插入載體有兩種： - -gt10（圖6-16b）可接受達8kb長的外源DNA，將其插入到cI基因中唯一的一個EcoRI-位點上。因為cI基因在插入DNA后失活，使- DNA不能插入到細菌染色體中，只能進行裂解循環(huán)，形成重組體就具有透明的噬菌斑，從而與其它混濁菌斑區(qū)分開 - -Charon(凱倫)16（圖6-16c）具有唯一的一個

36、EcoRI切點，并且處于它的LacZ-基因中，這個基因將通過插入新的DNA而失活。重組體在X-Gal 瓊脂糖板上產生透明噬菌斑。b）.置換載體置換載體 置換載體和插入載體相比，-置換載體擁有同一種酶的兩個限制性識別位點，并且它們之間隔著一段要被置換的DNA片段（圖6-17a）。這個要被置換的片段上常常還有其它的限制性切點，從這些切點處可以將它切成許多小的片段，以便使它們在克隆實驗中不可能被重新插入。置換載體比插入載體可接受更大的DNA-片段。重組體的選擇是根據它們的大小進行的，因為沒有發(fā)生重組的載體很小，不會被包裝進噬菌體頭部。置換型置換型 -噬菌體的特點噬菌體的特點 MCS處有成對 的限制性

37、內切酶位點 在切除MCS處的一小片段后，連入外源的基因片段（置換或叫取代）， 如 EMBL4，Charon40, gtw40, 2001圖: 6-16 -取代載體 置換載體有以下兩個廣泛應用的類型置換載體有以下兩個廣泛應用的類型： EMBL4 (圖圖6-17b)，它理論上可接受長達20kb的片段，置換片段分別被兩個EcoR I、BamH I和Sal I切點加在中間（使用這三種酶的任一種，就可將中間這一段切下來，這樣就可以克隆具有不同粘性末端的DNA-片段）。EMBL4的重組體可通過大小或根據Spi-表現型來篩選 。 GEM11和 GEM12(圖圖6-17c)，都可攜帶23kb的外源DNA，這已

38、經接近理論上的最大值了。在填充片段的兩邊各有一個多接頭，含有7個不同的限制性酶切位點。6.3.4 使用使用-插入載體或者置換載體進插入載體或者置換載體進行的克隆實驗行的克隆實驗 用-插入載體進行克隆實驗與用質粒載體原理是相同的：用一種限制性內切酶將載體分子切開，加入新的DNA后，進行連接，用產生的重組體分子轉染感受態(tài)E.coli的寄主細胞（圖6-18a）。在這類實驗中，載體必須是環(huán)狀的，就是說，它的cos-位點必須是通過氫鍵連接起來的。 圖圖: : 6-18 用-載體克隆的各種過程: a) -DNA的環(huán)狀形式被作為質粒使用; b)利用提純的-基因組的左臂和右臂和體外包裝, 可以獲得大量的重組體

39、噬菌斑 實驗中用相應的限制性內切酶處理載體，就產生了兩個片段，即左臂和右臂，并將載體的兩個臂提純（圖6-18b）。所有的-載體的左臂都長于右臂，這樣，通過蔗糖梯度離心就可將兩個臂分開。在組建重組分子時，將要克隆的DNA和純化的左臂和右臂混合。在連接過程中，就產生了許多分子序列，其中有連環(huán)體（順序：左臂-要克隆的DNA-右臂），這種序列也可能多次重復（6-18b）。如果插入的DNA長短適當，即其大小處于可以包裝的限度內，就被包裝成噬菌體。我們可以用在試管中生產的重組噬菌體去感染培養(yǎng)液。用此種方法，特別適用體外包裝方法，可以得到大量的重組體噬菌斑。6.3.56.3.5 柯斯質粒載體柯斯質粒載體(c

40、osmid vectors) 柯斯質粒（cosmid）載體可以克隆非常大的DNA-片段，它是噬菌體DNA和細菌質粒的混合類型（或者叫兩者的雜交體）。Cosmid 是由英文”cos sitecarrying plasmid”縮寫而成的，為帶有cos-位點的質粒。要將-DNA分子包裝進噬菌體的蛋白質衣殼內，有一種酶稱為末端酶（terminase），它能識別兩個相距適宜的cos-位點，把多聯體分子切割成單位長度片段，并將它們包裝到噬菌體頭部中去。只要這個-DNA的長度處于37-52kb之間。 柯斯質粒（cosmid）是一種攜帶一個cos位點的質粒（圖6-19a）。另外，它含有一個可供選擇的標記，例如一個抗生素抗性基因和一個質粒復制起點，因為柯斯質粒不再含有-基因，因此，不能形成噬菌體噬菌斑。在篩選基質上，和質粒載體一樣，會形成許多菌落。圖: 6-19 一個典型的粘性質粒和在克隆大的DNA-分子中的應用 粘性質粒的克隆實驗因粘性質粒載體上只有單一限制性內切酶位點，用內切酶將質粒切開（以B