基因組測序基本原理

1、基因組測序基因組測序生物信息系列講座之二大綱I. 核酸DNA的發(fā)現(xiàn)以及測序歷史簡介II. 雙脫氧化(Sanger dideoxy method)測序III.大片段的DNA測序與基因組測序的大發(fā)展VI.人類基因組V. 1000美元個體化基因組測序計劃(The “$1,000 dollar genome)On WebCT- “The $1000 genome”- review of new sequencing techniques by George ChurchPart I.核酸測序原理核酸發(fā)現(xiàn)與測序簡史MC chapter 12DNA測序的簡史DNA測序的方法A.雙脫氧法 (Sanger d

2、ideoxy) (primer extension/chain-termination) method: 最流行也是最廣為接受的方法。B.Maxam-Gilbert化學剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tediousC.焦磷酸測序(Pyrosequencing): measuring chain extension by p

3、yrophosphate monitoring。焦磷酸測序技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便，可以快速、準確地確定DNA序列。Single stranded DNA5353Sanger 雙脫氧測序原理a) 常規(guī)的PCR，粘附(Anneal)Sanger 雙脫氧測序原理b) 在延伸的時候將DNA聚合酶與加入正常的dNTP，同時摻入少量的雙脫氧的ddNTP53DNA聚合酶延伸方向Sanger 雙脫氧測序原理5353TTTTddAddAddAddA以ddATP為例，可以看到在反應中帶有T的模板被摻入的互補的ddATP隨機停止。因為ddATP不能

4、夠再使其主鏈延伸。如何讀取這些DNA片段？ 同位素標記同位素標記的引物 (如 32P)同位素標記的dNTPs (如35S 或者 32P) 熒光標記化學合成時帶有熒光素標記的ddNTPs被摻入到反應中。每一種ddNTP都帶有自身特定的熒光波長以便于觀測測序結果分析目前一般采用凝膠電泳法分析-能夠比較好的將每一條dNTP產(chǎn)生的DNA條帶分離開。DNA測序膠: 老方法利用電泳或者放射自顯影的方法來分析DNA序列在反應中加入不同的ddNTP得到結果帶有同位素標記的引物或者ddNTP被摻入到反應中，以便于觀測自動測序儀輸出DNA測序的實例樣本 一個帶有28個DNA樣品的膠圖: 綠帶：堿基A，,藍帶 C,

5、 黃帶G，紅帶 T. 越小的片段跑得越快自動測序儀/sci/techresources/Human_Genome/publicat/hgn/v10n3/images/megabaces.jpg測序的趨勢相對而言一般很少實驗室會自己做測序，一則自身測序費用比較高，而且熒光試劑容易粹滅，同時也比較消耗時間，另外可能出現(xiàn)一些其它問題引起結果不成功。所以大部分的測序都是送到相關的測序中心或者公司完成:-下面這個序列就是一個自動測序儀記錄的一段DNA片段Part II.大片段DNA測序與基因組測序的大發(fā)展19蜜蜂基因組是如何獲得的？基因組文庫的建立 目前基將基因組片段

6、打碎建立文庫。基因組文庫含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體。Page 22酵母人工染色體酵母人工染色體(YACs) 200-1000 kbBacteriophage P1 90 kbCosmids 40 kbBacteriophage l l 9-23 kb質粒(2-6 kb)Page 23大片段載體大片段載體Lambda phage 插入大小: 2030 kbCosmids 插入大小: 3545 kbBACs and PACs (bacterial and P1 artificial chromosomes (Viral) respectively) 插入大小: 10030

7、0 kbYACs (yeast artificial chromosomes) 插入大小: 2001,000 kbPage 24大片段插入載體大片段插入載體 Lambda 噬菌體 以及 cosmids 插入穩(wěn)定 但插入片段的容量可能不足以做大規(guī)模的測序 YACs 能夠插入大片段 但不太穩(wěn)定，比較難實際操作Page 25BACs and PACs BACs and PACs 大規(guī)模測序通用質粒 對插入片段大小比較合適，而且容易使用 與其它正常質粒一樣能夠擴增和分離全基因組鳥槍法測序 但是片段比較大時，如在基因組測序時，僅僅由Sanger方法并不合適，因此Shotgun測序，將基因大片段打碎后測序

8、。鳥槍法戰(zhàn)略（Shotgun Strategy）又稱隨機測序戰(zhàn)略，是由美國塞萊拉遺傳公司創(chuàng)始人克雷格文特爾發(fā)明，主要針對大片段的全長測序。因為整個基因組太長而每次只能測得一個500的小片斷(read)。鳥槍法測序步驟 第一，建立高度隨機、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫?？寺?shù)要達到一定數(shù)量，即經(jīng)末端測序的克隆片段的堿基總數(shù)應達到基因組5倍以上。 第二，高效、大規(guī)模的末端測序。 第三，序列集合。 第四，填補缺口。鳥槍法測序簡要SIZE SELECTSHEAR鳥槍法測序技術LIGATE & CLONESEQUENCE550bpPage 30重疊群重疊群Contigs 重疊群是指一組相

9、互重疊的染色體DNA序列 如何建立重疊群基因克隆？ For sequencing one wants to create “minimum tiling path” Contig of smallest number of inserts that covers a region of the chromosome基因組genomic DNA重疊群contig最小路徑minimumtiling pathPage 31限制性酶切產(chǎn)生不同的重疊群限制性酶切產(chǎn)生不同的重疊群Contigs 通過限制性內切酶酶切 將重疊片段序列排列 直到建立一個完整的contig兩種不同的全基因組鳥槍法測序序列拼接與組

10、裝 獨立的測序片段(read)通過逐步把它們拼接起來形成序列更長的重疊群(Contig)，直至得到完整序列的過程稱為重疊群裝配(Scaffold)。目前DNA 序列拼接應用的主要軟件是由美國華盛頓大學Phil Green實驗室開發(fā)的Phred Phrap Consed系統(tǒng)。目前36個國家900 多個實驗室都在使用上述系統(tǒng)。非贏利研究機構或個人可申請免費利用該系統(tǒng)。此外還有一序列的商業(yè)軟件，如主流的基因組拼接軟件（GenomeAssembly），華大基因開發(fā)的SOAPdenovo都可以做基因組的拼接，然后可以用補漏軟件進行補漏，得到完整的基因組序列?；蚪M基因組de novo測序測序 基因組de

11、 novo測序也叫做基因組從頭測序，是指不依賴于任何已知基因組序列信息對某個物種的基因組進行測序，然后應用生物信息學手段對測序序列進行拼接和組裝，最終獲得該物種基因組序列圖譜。De novo基因原理淺解 假設有原始序列：I did not know what is written in this paper.那么通過de novo分段重復測序得到了3次不同的結果。 測序結果1：id idn otkn owwh ati swr itteni nthisp aper 測序結果2: idid notkn owwha tiswrrit enin th isp ap er 測序結果3: i di dno

12、 tkno ww hati swri tteni nth ispap er 將3次重疊(overlap)部分進行拼接組成contig(重疊群) idn otkn owwhidid notkn owwha dno tkno wwididnotknowwha (Contig)De novo測序原理mapping測序 通過現(xiàn)有的已知同源主鏈序列，將同源測序片段組裝拼裝，建立新序列。該序列與的主鏈類似，但不一定相同。測序實驗室測序實驗室39組裝缺口測序缺口測序缺口- 我們如果已經(jīng)知道重疊群的順序和方向，那么可以通過跨越式測序得到缺口的序列信息。物理缺口物理缺口- 沒有重疊群覆蓋，同時也沒有DNA測序結

13、果 測序缺口物理缺口重復序列干擾鳥槍法測序拼接41重復序列REPEATS重復序列 真核生物染色體基因組中重復出現(xiàn)的核苷酸序列。這些序列一般不編碼多肽，在基因組內可成簇排布，也可散布于基因組。重復序列的屏蔽軟件重復序列的屏蔽軟件 CENSOR是一個通過參考序列篩選查詢序列中的重復序列并屏蔽同源重復序列的軟件工具，其能夠將所有找到的重復生成報告以及分類CENSOR也可提供離線軟件包Repeat masker RepeatMasker通過已知數(shù)據(jù)庫中的重復元素篩選FASTA格式的查詢序列，并返回一個屏蔽之后的可以用于準備數(shù)據(jù)庫檢索查詢序列的DNA序列。Repeat masker的離線軟件包的離線軟件

14、包兩種屏蔽方法的差別兩種屏蔽方法的差別 Repeatmasker用法類似于CENSOR，但這兩個工具各自有自身的優(yōu)點，在于他們的數(shù)據(jù)庫選取中有差異，如果要確保數(shù)據(jù)更加可信。所以同時用兩個工具或者與與其他類似的工具組合使用。48一些錯配的重復序列 a b c a c b a b c d I II III I II III a b c d b c a b d c e f I II III IV I III II IV a d b e c f a collapsed tandemexcisionrearrangement人類基因組計劃 人類基因組計劃 (英語：Human Genome Project

15、, HGP）是一項規(guī)模宏大，跨國跨學科的科學探索工程。其宗旨在于測定組成人類染色體（指單倍體）中所包含的30億個堿基對組成的核苷酸序列，從而繪制人類基因組圖譜，并且辨識其載有的基因及其序列，達到破譯人類遺傳信息的最終目的。人類基因組數(shù)據(jù)庫/projects/genome/guide/human//http:/hgpd.lifesciencedb.jp/cgi//index.html個體化基因組測序計劃 已有的研究表明，基因或基因組變異是腫瘤發(fā)生的根本原因，利

16、用單細胞全基因組測序技術，可以對獲取的腫瘤細胞進行更為精確和深入的分析，了解癌細胞的基因如何突變，以及腫瘤的來源、屬于哪種基因型等，為早期檢測和診斷腫瘤和腫瘤的個體化治療提供指導。 而基因分析是個體化醫(yī)療的前提，因此個體化的基因測序技術的發(fā)展能夠驅動著個體化醫(yī)療的進程。乳腺癌患者全基因組測序 2012年歐洲內科腫瘤學會（ESMO）研究者首次完成了對個體的乳腺癌患者全基因組測序以期制定個體化治療的大型臨床試驗。 截至2012年9月23日，共有 402名乳腺癌患者已經(jīng)完成了這項檢測，還有26名患者分析正在進行中。276名患者得到了基因組檢測結果，其中248例進行了完整的全基因組分析。 Andr博士說，在172例患者中發(fā)現(xiàn)了一個能作為抗腫瘤藥物靶點的基因組改變。有趣的是，20%的患者表現(xiàn)出一個罕見和意料之外的基因組改變