原子力顯微術(shù)研究生物樣品的彈性

1、原子力顯微術(shù)研究生物樣品的彈性原子力顯微術(shù)研究生物樣品的彈性王艷霞王艷霞2002年12月14日作為生命基本單元的細(xì)胞，是一個(gè)生物學(xué)的復(fù)合系統(tǒng)。測(cè)量細(xì)胞的彈性，在AFM面世之前就受到廣泛的關(guān)注。迅速發(fā)展的細(xì)胞生物學(xué)表明，細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是高度有組織的網(wǎng)狀分子細(xì)絲。這種動(dòng)態(tài)的網(wǎng)狀組織是各種細(xì)胞功能的基礎(chǔ)，這些細(xì)胞功能之中包括細(xì)胞的粘附和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組分生化辨識(shí)和描述，是定量測(cè)量細(xì)胞骨架的物理性質(zhì)的基礎(chǔ)。細(xì)胞骨架是一個(gè)由肌動(dòng)蛋白細(xì)絲（610nm）、間質(zhì)細(xì)絲（711nm）和細(xì)胞的微管絲（25nm）組成的有機(jī)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞骨架的力學(xué)性質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的形狀、細(xì)胞的擴(kuò)展、細(xì)

2、胞的蠕變、細(xì)胞的極性和細(xì)胞的分裂等其他的功能都有相當(dāng)重要的決定性作用，已逐漸成為業(yè)內(nèi)的共識(shí)。與懸浮細(xì)胞不同，附著細(xì)胞的變形在很大程度上決定于細(xì)胞骨架，同時(shí)還受到細(xì)胞與周圍環(huán)境特別是細(xì)胞與胞外基體（ECM）之間的力學(xué)作用及生化作用的影響。正如許多工程材料一樣，有外力作用在細(xì)胞表面時(shí)，細(xì)胞也會(huì)發(fā)生形變。這種變化用細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)描述。細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)決定于細(xì)胞的組成、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞與周圍物質(zhì)的相互作用。影響細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)的外部因素千變?nèi)f化。細(xì)胞的形變性質(zhì)還受到細(xì)胞內(nèi)部的某些特定結(jié)構(gòu)的控制，生物細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)會(huì)影響細(xì)胞的整體形變。與其他物質(zhì)不同，外力作用的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞的生理反應(yīng)。許多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常

3、細(xì)胞與病態(tài)細(xì)胞的生存條件與他們周圍的力學(xué)環(huán)境有關(guān)。細(xì)胞力學(xué)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)就是使用外力調(diào)節(jié)細(xì)胞的某些功能。 這方面的工作包括：對(duì)生物組織的細(xì)胞施加何種形式的力，能夠使得細(xì)胞黏附于細(xì)胞外部的基體(cell-extra cellular matrix)；可以完成這種黏附的力的量值有多大；這些力如何在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行轉(zhuǎn)換和分布；以及它們是如何進(jìn)行生物信息的傳導(dǎo)、如何產(chǎn)生生理反應(yīng)等等。這個(gè)方向的深入研究包括確定具體分子對(duì)機(jī)械力的轉(zhuǎn)換、感知過(guò)程的途徑（生理過(guò)程）、判別多個(gè)生物化學(xué)過(guò)程的層疊、確定各種分子的性質(zhì)等；還可以研究細(xì)胞內(nèi)部的力學(xué)調(diào)控機(jī)理，包括對(duì)細(xì)胞骨架的研究。 目前，細(xì)胞力學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究方法有：移液管

4、吸入法（micropipette aspiration)、動(dòng)態(tài)反射干涉對(duì)照法(flicker)、光學(xué)鉗(optical tweezers)、 掃描聲學(xué)顯微鏡(scanning acoustic microscope)、擠壓刺探法(poking)等，測(cè)量生物樣品的表面間相互作用和彈性的方法還有表面力儀等等。這些方法多數(shù)是相對(duì)較大面積內(nèi)的平均特性，從而影響這些技術(shù)的空間分辨率?？臻g分辨率的限制，影響了對(duì)細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的研究 。AFM的橫向分辨率比上述方法都高。利用AFM對(duì)細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)的研究方法類似于，使用玻璃纖維壓陷細(xì)胞的某個(gè)局部，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行擠壓、刺探的方法。實(shí)驗(yàn)方法移液管吸入法 1989年，Yo

5、ung and Evans在Biophysical Journal 56: 139149（Cortical shell-liquid core model for passive low of liquid-like spherical cells into micropipettes）對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和變形給出了測(cè)量方法和定量分析； 1996年，J. Shao和R. M. Hochmuth等，在Biophysical Journal 71:28922901（Micropipette suction for measuring piconewton forces of adhesion and t

6、ether formation from neutrophil membranes）測(cè)量了細(xì)胞膜在皮牛頓量級(jí)的作用力； 1988年，Theret等，在the application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements，Journal of mechanical Engineering 110: 190199中對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行了研究; 1990年，Sato和Theret等，在Application of the micropipette tec

7、hnique to the measurement of cultured porcine aorticendothe lial cell viscoelastic properties，Journal of mechanical Engineering 112: 263268對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行了研究； 1999年，Jones等，在Alterations in the Youngs modulus and volumetric properties of chodrcytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage，Journ

8、al of mechanics 32: 119127中討論了固體彈性模型（上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞）和固體粘彈性模型（軟骨細(xì)胞）微移液管測(cè)量變形的彈性模量是幾百帕，粘性系數(shù)是幾千泊。利用閃爍或者動(dòng)態(tài)反射干涉對(duì)照譜研究1987年，Zilker等人Journal of Physics 48:21392151，Dynamic reflection interference contract (RIC) microscopy: a new method to study surface excitations of cells and to measure membrane bending elastic

9、moduli；1990年，Zeman等的文章Bending undulations and elasticity of the erythrocyte membrane: effect of cell shape and membrane organization (European Biophysics Journal 18: 203219)。利用光學(xué)鉗（紅外激光阱）的方法 1989年，Ashkin and Dziedzic等, Internal cell maniplulation using infrared laser traps, Proceedings of the Nationa

10、l Academy of Science, 86: 79147918； 1992年，Svoboda et al., Conformation and elasticity of the isolated red blood cell membrane skeleton, Physics Journal 63: 784793； 1995年，J, Sheetz M.P.等，Mechanical properties of neuronal growth cone membranes studied by tether formation with laser optical tweezers. B

11、iophysical Journal 68:98896。掃描聲學(xué)顯微鏡研究分布在細(xì)胞表面的力 1991年，Luers, H., K. Hillmann, J. Litniewski, and J. Berciter. Acoustic microscopy of cultured cells: distribution of forces and cytoskeletal elements. Cell Biophys. 18:279 293； 1995年，Bereiter-Hahn, J., K. Ilonka, H. Luers, and M. Voth. Mechanical basis

12、of cell shape: investigations with the scanning acoustic microscope. Biochem. Cell Biol. 73:337348。磁分析裝置和剪切流量測(cè)量技術(shù) 磁分析裝置中磁粒子被限制于細(xì)胞外部的接收器或被引入完整的活細(xì)胞內(nèi)以及各種磁分析裝置。 1987年，Valberg and Feldman等； 1994年，Wang and Ingber等； 1997年，Maniotis等， 1993年，Wang N, Bulter JP, Ingber PE. Science，260:11247。 剪切流量測(cè)量技術(shù) 1993年，Kuo

13、SC, Lauffenburger DA等， Biophysical Journal;65:2191200。表面力儀 表面力儀SFA（surface force apparatus）可以測(cè)量分子尺度的表面之間的相互作用力、兩表面之間的幾何形狀和絕對(duì)間距。兩片相同厚度的背部鍍銀的透明云母片粘附在柱形彎曲的硅板上構(gòu)成基底。不斷提高靈敏度的四步機(jī)構(gòu)控制兩表面之間的間距在5mm范圍內(nèi)，該四步機(jī)構(gòu)具有1埃的分辨率。利用光正常通過(guò)兩表面時(shí)多光干涉條紋的移動(dòng)，可測(cè)到兩表面的間距達(dá)1埃。當(dāng)測(cè)到強(qiáng)吸引力(strongly attractive forces)，同時(shí)出現(xiàn)機(jī)構(gòu)的不穩(wěn)定導(dǎo)致表面從一個(gè)穩(wěn)定的位置跳躍到另

14、一個(gè)穩(wěn)定的位置。只要力的變化量超過(guò)彈性強(qiáng)度(the spring stiffness)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行擠壓、刺探的方法早在1982，年P(guān)eterson等人，在Proceedings of the national Academy of science(Vol.79 pp53275331)中發(fā)表文章題為Dependence locally measured cellular deformability on position on the cell, temperature and cytochalasin；1990年，Zahalak等人，在Journal of Biomechan

15、ical Engineering 112:283294 中發(fā)表題為Determination of cellular mechanical properities by cell poking, with an application to leukocytes。這種方法刺探細(xì)胞的工具是尖銳的玻璃纖維。利用玻璃纖維的平端面壓陷細(xì)胞，研究細(xì)胞基于阻抗的變形。在細(xì)胞刺探實(shí)驗(yàn)中，精密的玻璃針尖將細(xì)胞壓陷一定量值后，迅速撤開(kāi)玻璃探針，在明場(chǎng)模式記錄逐漸釋放的壓陷。不同的細(xì)胞被壓陷的面積明顯不同，說(shuō)明細(xì)胞對(duì)機(jī)械力的阻礙不同。玻璃纖維的直徑為2m。利用AFM或者稱為納米壓陷器，對(duì)細(xì)胞施加一定的作用力，從而

16、確定表面的局域性質(zhì)。這些性質(zhì)包括細(xì)胞膜的厚度、硬度、細(xì)胞的粘附以及表面力、摩擦力和能量分布的范圍等等。同時(shí)，彈性變形正在被逐漸地重視?？梢岳肁FM分析力隨探針移動(dòng)的曲線，繪制基底的局域彈性圖。對(duì)AFM成像的每點(diǎn)處的力進(jìn)行測(cè)量、分析。在對(duì)探針樣品系統(tǒng)施加負(fù)載的過(guò)程中，用赫茲模型描述細(xì)胞的彈性形變，用力學(xué)理論對(duì)樣品的變形進(jìn)行模擬。已有報(bào)道，在單獨(dú)的點(diǎn)位置測(cè)量力隨探針的縱向移動(dòng)，通過(guò)分析力曲線繪制局域彈性圖。原子力顯微術(shù)研究活細(xì)胞的性質(zhì)AFM不僅被用作分子、原子尺度的表面成像的工具，還可以用來(lái)測(cè)量探針與表面間的相互作用。對(duì)于生物材料，AFM除能夠?qū)ι飿悠烦上裢?，還可以被用作測(cè)量和施加微小的作用力

17、。使用力調(diào)制模式可以定性的對(duì)任何樣品成像，九十年代初期就有研究活細(xì)胞報(bào)道。利用AFM研究細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，這方面的研究包括追蹤細(xì)胞內(nèi)部的輸運(yùn)材料或者細(xì)胞骨架變化、追蹤細(xì)胞的活化過(guò)程等等；對(duì)于細(xì)胞的靜態(tài)性質(zhì)包括細(xì)胞的形貌，細(xì)胞的內(nèi)部組分及細(xì)胞與細(xì)胞內(nèi)部組分的性質(zhì)研究。被研究的細(xì)胞包括血細(xì)胞、骨和軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞等等。也有正常細(xì)胞和基因突變細(xì)胞、紐帶缺乏細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞等等。 如圖是AFM追蹤人體血小板活化過(guò)程的示意圖。血小板是血液中主要成分之一，對(duì)血液凝結(jié)起重要作用。在封閉傷口的過(guò)程中，血小板要經(jīng)歷由圓餅狀眠態(tài)到扁平狀的激活態(tài)。這種形狀的變化伴隨著一系列生物化學(xué)變化。圖中追蹤到活化過(guò)程

18、的關(guān)鍵階段。由圖a和圖b可以看到，被稱為絲羽狀外圍突起；在隨后的階段，這些突起之間被細(xì)胞膜充滿，這些細(xì)胞膜在圖a到圖c中被紅色、藍(lán)色箭頭標(biāo)出。從中心的高位置向周邊輸運(yùn)的載體也都可見(jiàn)（圖a中綠色箭頭和圖e、圖f中的藍(lán)色箭頭）。對(duì)軟樣品的研究工作的是從對(duì)橡膠、軟骨組織和活細(xì)胞等逐步開(kāi)展的。如圖是浸入水，或者丙醇，或者兩種液體的混合液中的云母表面覆蓋的明膠薄膜。在力曲線中，隨著探針移向樣品，直至最后接觸的過(guò)程中，隨時(shí)記錄懸臂梁的偏移量值。然后反向移動(dòng)探針，直至探針不再與樣品表面接觸。硬樣品（100丙醇中的明膠）的力曲線有兩個(gè)區(qū)域，一是偏移量值為常量的平坦區(qū)域（未接觸），此時(shí)探針沒(méi)有接觸樣品的表面；另

19、一個(gè)是探針觸及樣品表面的接觸區(qū)域，懸臂梁的偏移量正比于樣品的移動(dòng)（圖中第一條曲線的左側(cè)傾斜部分）。如果是軟樣品，樣品會(huì)受到探針的作用而變形，出現(xiàn)彈性凹陷。觀察到的懸臂梁的反射量會(huì)比硬樣品的小一些。力曲線相對(duì)較平坦。浸入水中的部分增多，明膠膨脹變得越來(lái)越軟，曲線越來(lái)越平坦。 如神經(jīng)細(xì)胞、纖維原細(xì)胞和上皮細(xì)胞等真核狀態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞的形貌和細(xì)胞的移動(dòng)源自于細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、與細(xì)胞有關(guān)的蛋白質(zhì)、細(xì)胞外基體等，還與它們之間的復(fù)雜相互作用有關(guān)。細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)是在分子層面最難解釋的現(xiàn)象之一。我們希望細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的時(shí)間和空間分布可以更為深入地研究這些現(xiàn)象。 真核細(xì)胞的狀態(tài)受到機(jī)械力平衡的控制，各種因素產(chǎn)生的

20、作用力達(dá)到平衡。這些作用力包括作用在細(xì)胞骨架上面的力、對(duì)鄰近細(xì)胞的作用力，以及對(duì)底層的作用力等 (Ingber等 1994)。這個(gè)平衡一旦改變，細(xì)胞的形式、骨架結(jié)構(gòu)及核形結(jié)構(gòu)都會(huì)發(fā)生改變，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、生命周期、基因表達(dá)等細(xì)胞行為，機(jī)械力的平衡與細(xì)胞骨架、細(xì)胞外部基體的力學(xué)性質(zhì)、核結(jié)構(gòu)等相關(guān)聯(lián)(Ingber，1993)。細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)與空間和時(shí)間的關(guān)系，與重大的生理過(guò)程緊密相關(guān)，如胚胎發(fā)育過(guò)程 (Fung, 1988; Ingber和Folkman, 1989; Ingber和Jamieson，1985)等，神經(jīng)細(xì)胞對(duì)機(jī)械張力的反應(yīng)也要經(jīng)歷生長(zhǎng)和發(fā)育的變化（Zheng等，1991）。對(duì)活

21、細(xì)胞的粘彈性的空間分布和變化的測(cè)量可以深刻理解這些過(guò)程。 細(xì)胞彈性的測(cè)量細(xì)胞骨架是一網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。真核細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)相當(dāng)豐富。對(duì)肌動(dòng)蛋白膠質(zhì)的實(shí)時(shí)觀測(cè)，可以深入研究細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)。細(xì)胞骨架決定細(xì)胞的形狀，細(xì)胞形狀的變化和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。上圖是利用AFM測(cè)量細(xì)胞局域硬度的示意圖。AFM的探針在細(xì)胞表面的一點(diǎn)壓入細(xì)胞，較硬的細(xì)胞骨架對(duì)探針有阻礙作用，這個(gè)阻礙作用確定探針的壓陷深度。 可以使用接觸力學(xué)中的赫茲模型描述這種相互作用。宏觀物體的彈性形變用虎克定律描述?；⒖硕杀砻鲏毫εc張力（形變）的比值是一與材料形變性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)。該常數(shù)就是彈性模量。彈性模量是材料被拉長(zhǎng)或者壓縮時(shí)，產(chǎn)生的力學(xué)阻礙。楊氏模量（

22、又稱為彈性模量）是單位表面積上的作用力。當(dāng)壓力和形變之間滿足線性關(guān)系時(shí)，產(chǎn)生彈性形變；不再施加外力時(shí)，材料恢復(fù)原來(lái)的形狀。材料的塑性表現(xiàn)在對(duì)力曲線的線性的偏離，去掉外加力后，材料不再恢復(fù)初始形狀。再加大形變會(huì)使材料斷裂。利用AFM測(cè)量樣品的彈性時(shí)，將探針推向被研究的樣品的表面，得到力距離曲線。測(cè)到的形變結(jié)果是探針的形變與被研究的樣品的形變的總和。雖然AFM測(cè)量的是微觀尺度，但探針壓陷樣品表面的原子數(shù)量很大（超過(guò)100個(gè)原子），經(jīng)典理論仍然使用。 赫茲理論描述的是，在平坦的剛性基底表面，由于外加力F的作用，彈性物體的形變情況。對(duì)于彈性球體的形變量滿足下式：（1）R是探針的曲率半徑，Etip和ti

23、p分別是探針的楊氏模量和泊松比。 REFtiptip2222316)1(9利用AFM測(cè)量細(xì)胞的性質(zhì)，模型可以看作是在平坦的剛性基底表面的彈性物體。在壓陷過(guò)程中應(yīng)該精確確定接觸面積。一種方法是把懸臂梁的球形針尖認(rèn)為是球體，作為對(duì)稱的球形壓頭。如下圖所示，b圖中是這種探頭的倒轉(zhuǎn)AFM圖像。探頭的半徑可以不同，從而壓力也在一定范圍變化。還可以利用球形探頭研究同等作用力下，對(duì)應(yīng)低壓強(qiáng)、大接觸面積的情況。低壓強(qiáng)也對(duì)應(yīng)小的壓陷量。對(duì)于較薄的樣品，在較大壓陷量的情況比較復(fù)雜。在測(cè)力和建立樣品的模型的過(guò)程中，不能忽略基底的作用。232134ERF 在球形和拋物面探頭壓陷樣品時(shí)，可以利用赫茲模型近似描述無(wú)限大樣

24、品的楊氏模量與力之間的關(guān)系，赫茲模型同時(shí)反映探針形貌的壓陷。用實(shí)驗(yàn)的方法，通過(guò)在樣品的某一點(diǎn)上得到的力曲線確定力和壓陷，在探針逼近樣品時(shí)測(cè)量懸臂梁的反應(yīng)，得到力曲線。（2）錐形探針半錐角為，外加力F產(chǎn)生的壓陷由下式得到：（3）E*是相對(duì)楊氏模量：（4）當(dāng)EsampleEtip時(shí)，1/E*可以化簡(jiǎn)為（5）Esample是被研究材料的楊氏模量，sample是樣品的泊松比。 拋物形探針在頂點(diǎn)處曲率半徑為R的拋物形探針，對(duì)樣品的壓陷z與力F之間滿足：（6）對(duì)于半徑為R的球形探針，當(dāng)接觸半徑rR時(shí)，也滿足上述方程。 上述是平坦的剛性基底上彈性物體產(chǎn)生的變形。下列原因?qū)y(cè)量楊氏模量影響相當(dāng)大：塑性變形，表

25、面能，粗糙表面的局部形狀。 2*)()(2)(tgEFsamplesampletiptipEEE22*111samplesampleEE2*115 . 1*)(34)(REF 如上所述，赫茲模型可以描述軟樣品的彈性反應(yīng)。前述方程給出了錐形探針在平坦的軟表面上施加負(fù)載F與產(chǎn)生的彈性壓陷之間的關(guān)系。彈性壓陷會(huì)增加探針與樣品表面之間的接觸面積，即使在最好的條件下，也會(huì)影響分辨率。下圖是使用赫茲模型時(shí)樣品的楊氏模量為E時(shí)，在負(fù)載力F的作用下，探針隨軟樣品之間的接觸面積的變化情況。方程（7），（8）是楊氏模量E、負(fù)載力F、泊松比和接觸面積的直徑、錐形張角、壓入平坦表面的接觸半徑R之間的關(guān)系： （7）（8）FEtgd2