結(jié)構(gòu)生物學(xué)：拉曼光譜基礎(chǔ)與生物學(xué)上的應(yīng)用-2

1、激光的特性 能量在空間高度集中：這主要體現(xiàn)在諧振腔對光束方向的選擇使激光的發(fā)散角很小，即光束的方向性很強(qiáng) 時(shí)間相干性高即譜線寬度很窄，單色性好 光束具有空間相干性：激光束在傳播場空間中，波前上的各點(diǎn)是相干的 氣體激光器氣體激光器 固體激光器固體激光器 半導(dǎo)體激光器半導(dǎo)體激光器 染料激光器染料激光器激光器的類型與激發(fā)波長激光器的類型與激發(fā)波長 激光器類型激光器類型激發(fā)波長（激發(fā)波長（nm） He-Ne激光器激光器 632.8 Ar+ 激光器激光器 488.0，514.5 Kr+ 激光器激光器 530.9，647.1 YGA 激光器激光器 1064.0拉曼光譜的特性 退偏比退偏比 熒光的抑制和消除

2、熒光的抑制和消除 共振共振 表面增強(qiáng)表面增強(qiáng) 液體或氣體樣品分子的取向是無規(guī)的。液體或氣體樣品分子的取向是無規(guī)的。 自然光或線偏振的自然光或線偏振的(完全偏振光完全偏振光) 入射光被入射光被分子散射后產(chǎn)生的各個(gè)拉曼譜帶則不一定分子散射后產(chǎn)生的各個(gè)拉曼譜帶則不一定是線偏振的或非偏振的。是線偏振的或非偏振的。 拉曼散射光的偏振性能的變化與分子構(gòu)型拉曼散射光的偏振性能的變化與分子構(gòu)型的對稱性和簡正振動(dòng)模式的對稱性有關(guān)。的對稱性和簡正振動(dòng)模式的對稱性有關(guān)。 為了描述拉曼譜帶的偏振性能變化的程度，為了描述拉曼譜帶的偏振性能變化的程度，引進(jìn)退偏比的概念。引進(jìn)退偏比的概念。 分別討論單色入射光為自然光和線偏

3、振光分別討論單色入射光為自然光和線偏振光兩種不同的情況。兩種不同的情況。拉曼光譜中拉曼光譜中熒光的抑制和消除熒光的抑制和消除第一電子激發(fā)態(tài)電子基態(tài)振動(dòng)量子數(shù)拉曼躍遷拉曼躍遷斯托克斯線反斯托克斯線熒光光譜熒光光譜和熒光光譜比較0123= = = = =vvvv1.1. 純化樣品。純化樣品。在拉曼光譜測試中發(fā)現(xiàn)熒光干擾時(shí)，首先要在拉曼光譜測試中發(fā)現(xiàn)熒光干擾時(shí)，首先要 做的是純化樣品，有時(shí)要反復(fù)純化多次方能做的是純化樣品，有時(shí)要反復(fù)純化多次方能 奏效。奏效。2.2. 強(qiáng)激光長時(shí)間照射樣品。強(qiáng)激光長時(shí)間照射樣品。很多情況下用這種方法確實(shí)能達(dá)到消除熒光很多情況下用這種方法確實(shí)能達(dá)到消除熒光 干擾的效果（

4、無法解釋為什么用強(qiáng)激光長時(shí)干擾的效果（無法解釋為什么用強(qiáng)激光長時(shí) 間照射樣品能夠有效地消除熒光干擾）。照間照射樣品能夠有效地消除熒光干擾）。照 射樣品所用的激光功率有時(shí)可達(dá)數(shù)瓦，照射射樣品所用的激光功率有時(shí)可達(dá)數(shù)瓦，照射 時(shí)間由幾分鐘到數(shù)小時(shí)。選用激光功率的大時(shí)間由幾分鐘到數(shù)小時(shí)。選用激光功率的大 小和照射時(shí)間的長短因樣品的不同而不同。小和照射時(shí)間的長短因樣品的不同而不同。3.改變激發(fā)線的波長。改變激發(fā)線的波長。對于不同的激發(fā)光波長，拉曼譜帶的相對位移是不變對于不同的激發(fā)光波長，拉曼譜帶的相對位移是不變的。對于不同的激發(fā)光波長，熒光的相對位置是不同的。對于不同的激發(fā)光波長，熒光的相對位置是不同

5、的。選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長，可使記錄拉曼光譜時(shí)避的。選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長，可使記錄拉曼光譜時(shí)避開熒光的干擾。開熒光的干擾。4.加熒光淬滅劑。加熒光淬滅劑。有時(shí)在樣品中加入少量熒光淬滅劑，例如有時(shí)在樣品中加入少量熒光淬滅劑，例如l 的硝基的硝基苯，可以有效地淬滅熒光干擾。苯，可以有效地淬滅熒光干擾。5. 利用反斯托克斯技術(shù)：反斯托克斯拉曼譜帶位于瑞利利用反斯托克斯技術(shù)：反斯托克斯拉曼譜帶位于瑞利線的高頻一側(cè)，而熒光則位于瑞利線的低頻一側(cè)。記線的高頻一側(cè)，而熒光則位于瑞利線的低頻一側(cè)。記錄反斯托克斯拉曼光譜可完全避免熒光的干擾。錄反斯托克斯拉曼光譜可完全避免熒光的干擾。6.脈沖激光器。脈沖激光器。激

6、光照射到樣品時(shí)，產(chǎn)生熒光和拉曼散射光的激光照射到樣品時(shí)，產(chǎn)生熒光和拉曼散射光的時(shí)間不同，在時(shí)間不同，在10-1110-12秒內(nèi)產(chǎn)生拉曼散射，而秒內(nèi)產(chǎn)生拉曼散射，而在在10-710-9秒后熒光則才出現(xiàn)。這樣實(shí)驗(yàn)上可秒后熒光則才出現(xiàn)。這樣實(shí)驗(yàn)上可以利用產(chǎn)生拉曼散射和熒光的時(shí)間差把拉曼散以利用產(chǎn)生拉曼散射和熒光的時(shí)間差把拉曼散射光與熒光分離開。激光脈沖照射樣品后，約射光與熒光分離開。激光脈沖照射樣品后，約10-10秒把拉曼光譜記錄下，隨之關(guān)閉光譜儀的秒把拉曼光譜記錄下，隨之關(guān)閉光譜儀的入射狹縫或檢測器的門開關(guān)，這樣就把熒光入射狹縫或檢測器的門開關(guān)，這樣就把熒光“拒之門外拒之門外”，以達(dá)到消除熒光的干

7、擾。，以達(dá)到消除熒光的干擾。7.其他方法：頻率調(diào)制光譜法，交流耦合倒拉曼其他方法：頻率調(diào)制光譜法，交流耦合倒拉曼光譜法，信號平均法等，亦可達(dá)到消除熒光干光譜法，信號平均法等，亦可達(dá)到消除熒光干擾的目的。擾的目的。8. 付里葉變換拉曼付里葉變換拉曼(FT-Raman)光譜技術(shù)。光譜技術(shù)。當(dāng)前付里葉變換拉曼光譜儀已商品化。付當(dāng)前付里葉變換拉曼光譜儀已商品化。付里葉變換拉曼光譜儀的激發(fā)波長是里葉變換拉曼光譜儀的激發(fā)波長是1064 nm，所產(chǎn)生的拉曼光譜也位于近紅外區(qū)，所產(chǎn)生的拉曼光譜也位于近紅外區(qū)。熒光位于可見區(qū)，所以近紅外激光激發(fā)。熒光位于可見區(qū)，所以近紅外激光激發(fā)樣品完全不會(huì)激發(fā)產(chǎn)生熒光，從而避

8、免了樣品完全不會(huì)激發(fā)產(chǎn)生熒光，從而避免了熒光對拉曼光譜的干擾。在正常拉曼光譜熒光對拉曼光譜的干擾。在正常拉曼光譜實(shí)驗(yàn)中所有由熒光引起的一切麻煩，在付實(shí)驗(yàn)中所有由熒光引起的一切麻煩，在付里葉變換拉曼光譜實(shí)驗(yàn)中都不存在。里葉變換拉曼光譜實(shí)驗(yàn)中都不存在。拉曼光譜測試常用的激發(fā)波長拉曼光譜測試常用的激發(fā)波長785nm1064nm515nm488nm454nmWhy Near-Infrared Excited Raman Spectroscopy?Fluorescence - a problem of visible excitationVIS-RamanFluorescenceNIR-RamanNIR

9、 FT-Raman SpectroscopyRaman spectra of highly purified Thioindigo excited at 488nm (yellow) and 1064nm (red)Negligible Fluorescence with 1064 nm ExcitationFT-Raman spectra ofChocolatetop: 785 nmbottom: 1064 nm785 nm1064 nm500100015002000250030003500Wavenumber cm-10.10.20.30.40.50.60.70.8將激發(fā)激光從可見光區(qū)移至

10、紫外光區(qū)而將激發(fā)激光從可見光區(qū)移至紫外光區(qū)而避開拉曼光譜中的熒光干擾避開拉曼光譜中的熒光干擾Excitation line106Excitation line106IntensityWavelength /nmUVVisible RamanUV Raman解決了長期以來拉曼解決了長期以來拉曼光譜的熒光干擾難題光譜的熒光干擾難題共振拉曼光譜共振拉曼光譜 通常拉曼散射是非常弱的只有入射光的通常拉曼散射是非常弱的只有入射光的10-6 ，甚至更低。因此通常在研究振動(dòng)光譜時(shí)主要采用甚至更低。因此通常在研究振動(dòng)光譜時(shí)主要采用IR 。 然而拉曼光譜在許多方面是紅外光譜無法替代的，然而拉曼光譜在許多方面是紅外

11、光譜無法替代的，如水溶液體系的研究。由于光譜的選擇定則，高如水溶液體系的研究。由于光譜的選擇定則，高對稱性的分子的振動(dòng)主要出現(xiàn)在拉曼光譜中。對稱性的分子的振動(dòng)主要出現(xiàn)在拉曼光譜中。 完整的研究應(yīng)該同時(shí)測量紅外和拉曼光譜。即完整的研究應(yīng)該同時(shí)測量紅外和拉曼光譜。即使一些沒有對稱性的分子，某些振動(dòng)在紅外和拉使一些沒有對稱性的分子，某些振動(dòng)在紅外和拉曼光譜中的強(qiáng)度也是不同的。同時(shí)測量兩者的光曼光譜中的強(qiáng)度也是不同的。同時(shí)測量兩者的光譜可以得到盡可能多的信息。譜可以得到盡可能多的信息。一、共振拉曼效應(yīng)一、共振拉曼效應(yīng):在正常的拉曼光譜實(shí)驗(yàn)中，使用的激發(fā)線波長遠(yuǎn)離化合物在正常的拉曼光譜實(shí)驗(yàn)中，使用的激發(fā)

12、線波長遠(yuǎn)離化合物的電子吸收光譜帶。當(dāng)改變激發(fā)線的波長并使之接近或者的電子吸收光譜帶。當(dāng)改變激發(fā)線的波長并使之接近或者落在化合物的電子吸收光譜帶內(nèi)時(shí)，某些拉曼光譜帶的強(qiáng)落在化合物的電子吸收光譜帶內(nèi)時(shí)，某些拉曼光譜帶的強(qiáng)度將會(huì)大大的增強(qiáng)，甚至達(dá)到度將會(huì)大大的增強(qiáng)，甚至達(dá)到104106倍。這種現(xiàn)象叫做倍。這種現(xiàn)象叫做共振拉曼效應(yīng)（共振拉曼效應(yīng)（Resonance Raman Effect）。）。二、預(yù)共振拉曼散射二、預(yù)共振拉曼散射:它是電子態(tài)躍遷和振動(dòng)態(tài)相耦合的結(jié)果。以它是電子態(tài)躍遷和振動(dòng)態(tài)相耦合的結(jié)果。以Stocks拉曼能拉曼能級躍遷，激發(fā)線的頻率（能級）和電子躍遷頻率（能級）級躍遷，激發(fā)線的頻率

13、（能級）和電子躍遷頻率（能級）相一致為共振拉曼散射。激發(fā)線的頻率（能級）接近但還相一致為共振拉曼散射。激發(fā)線的頻率（能級）接近但還沒有超過分子的電子躍遷頻率（能量）時(shí)，為預(yù)共振拉曼沒有超過分子的電子躍遷頻率（能量）時(shí)，為預(yù)共振拉曼散射散射(Preresonance Raman Scatter)。 在共振拉曼光譜中，只是由生色團(tuán)或與生色團(tuán)相連接在共振拉曼光譜中，只是由生色團(tuán)或與生色團(tuán)相連接基團(tuán)的振動(dòng)被有選擇的增強(qiáng)，而與此無關(guān)的振動(dòng)則不基團(tuán)的振動(dòng)被有選擇的增強(qiáng)，而與此無關(guān)的振動(dòng)則不被增強(qiáng)。被增強(qiáng)。 共振拉曼效應(yīng)增強(qiáng)的譜帶數(shù)目一般要小于正常拉曼光共振拉曼效應(yīng)增強(qiáng)的譜帶數(shù)目一般要小于正常拉曼光譜的譜帶

14、數(shù)目。共振拉曼光譜可以得到有關(guān)生色基團(tuán)譜的譜帶數(shù)目。共振拉曼光譜可以得到有關(guān)生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)信息。的結(jié)構(gòu)信息。 共振拉曼光譜可以得到在正常拉曼光譜中失去的，可共振拉曼光譜可以得到在正常拉曼光譜中失去的，可能是更重要的分子結(jié)構(gòu)信息。能是更重要的分子結(jié)構(gòu)信息。 共振拉曼光譜總是在很低的濃度下測試，這對于有色共振拉曼光譜總是在很低的濃度下測試，這對于有色物和生物樣品更為重要。物和生物樣品更為重要。 生物化學(xué)研究表明，很多生物樣品的活性部位往往接生物化學(xué)研究表明，很多生物樣品的活性部位往往接近于生色基團(tuán)，所以在研究生物物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的近于生色基團(tuán)，所以在研究生物物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系時(shí)，共振拉曼光譜特

15、別有用。關(guān)系時(shí)，共振拉曼光譜特別有用。表面增強(qiáng)拉曼光譜表面增強(qiáng)拉曼光譜Surface Enhanced Raman ScatteringSERS 第第1篇有關(guān)篇有關(guān)SERS的文章是英國的的文章是英國的Fleishmann研研究組在究組在1974年發(fā)表的（年發(fā)表的（Fleischmann, M. et. Al., Chem. Phys. Lett. 1974, 26, 163）。在文章中，）。在文章中，他們報(bào)道了吸附在用電化學(xué)方法粗糙化的銀電極他們報(bào)道了吸附在用電化學(xué)方法粗糙化的銀電極表面的吡啶分子在不同電位下的拉曼光譜，表明表面的吡啶分子在不同電位下的拉曼光譜，表明了拉曼光譜能與電化學(xué)方法聯(lián)用

16、而測得吸附在電了拉曼光譜能與電化學(xué)方法聯(lián)用而測得吸附在電極表面的分子的信息。極表面的分子的信息。 表面增強(qiáng)拉曼光譜表面增強(qiáng)拉曼光譜urface nhanced aman cattering當(dāng)具有共振拉曼效應(yīng)的分子吸附在粗糙化的銀、金或銅的表面當(dāng)具有共振拉曼效應(yīng)的分子吸附在粗糙化的銀、金或銅的表面時(shí)，其共振拉曼信號也能被增強(qiáng)時(shí)，其共振拉曼信號也能被增強(qiáng)104106倍，這種現(xiàn)象被稱為倍，這種現(xiàn)象被稱為表面增強(qiáng)共振拉曼散射表面增強(qiáng)共振拉曼散射(Surface Enhanced Resonance Raman Scattering)效應(yīng)，簡稱效應(yīng)，簡稱SERRS。第第1篇有關(guān)篇有關(guān)SERRS的文章是由

17、的文章是由VanDuyne研究組發(fā)表的。在文章研究組發(fā)表的。在文章中，他們報(bào)道了具有共振拉曼效應(yīng)的結(jié)晶紫分子在粗糙銀表面中，他們報(bào)道了具有共振拉曼效應(yīng)的結(jié)晶紫分子在粗糙銀表面上的上的SERRS光譜。在測量化合物的共振拉曼光譜時(shí)，經(jīng)常會(huì)受光譜。在測量化合物的共振拉曼光譜時(shí)，經(jīng)常會(huì)受到該化合物的熒光的干擾。但當(dāng)化合物分子吸附到粗糙化的銀、到該化合物的熒光的干擾。但當(dāng)化合物分子吸附到粗糙化的銀、金或銅的表面時(shí)，其熒光會(huì)被淬滅，而很易得到高增強(qiáng)的金或銅的表面時(shí)，其熒光會(huì)被淬滅，而很易得到高增強(qiáng)的SERRS光譜。光譜。對于對于SERRS光譜，能觀察到兩個(gè)極大，第一個(gè)一般是由共振效光譜，能觀察到兩個(gè)極大，

18、第一個(gè)一般是由共振效應(yīng)產(chǎn)生的，而在較長波長方向的極大歸結(jié)于應(yīng)產(chǎn)生的，而在較長波長方向的極大歸結(jié)于SERS的貢獻(xiàn)的貢獻(xiàn) 。 拉曼光譜是研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要手段拉曼光譜是研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要手段 拉曼光譜是進(jìn)行分析和鑒定的優(yōu)良方法拉曼光譜是進(jìn)行分析和鑒定的優(yōu)良方法 常用的拉曼光譜測試方法常用的拉曼光譜測試方法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)abcCNCNdeCNNCfNCNCNC極少見到酰胺平面酰胺平面酰胺平面酰胺平面?zhèn)孺溙荚犹荚親NCHROCNHOCCC=180180蛋白質(zhì)各種構(gòu)象的酰胺I和III譜帶的位置 用拉曼光譜測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的定量研究工作始于1976年，Lippert16等由已知二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)

19、(聚-L-賴氨酸)的拉曼光譜得到一組強(qiáng)度參數(shù)，然后用蛋白質(zhì)拉曼光譜的酰胺和酰胺I譜帶強(qiáng)度建立一組聯(lián)立方程，從而求解蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。調(diào)節(jié)聚-L-賴氨酸溶液的pH值和溫度可得到-螺旋、-折疊和無序結(jié)構(gòu)三種構(gòu)象。測得其拉曼光譜的酰胺I和酰胺III譜帶。選取水溶液拉曼光譜酰胺III譜帶在1240cm-1處的強(qiáng)度為-折疊和無序結(jié)構(gòu)的特征。重水溶液拉曼光譜酰胺I譜帶在1632cm-1處的強(qiáng)度為-螺旋，1660cm-1處的強(qiáng)度為-折疊和無序結(jié)構(gòu)的特征。假定蛋白質(zhì)拉曼光譜的酰胺I譜帶和酰胺是三種構(gòu)象相應(yīng)譜帶強(qiáng)度的線性疊加，其二級結(jié)構(gòu)則滿足下列方程組：CpIp1240=I1240+I1240+I1240CpI

20、P1632=I1632+I1632+I1632 CpIP1660=I1660+I1660+I1660+=1式中IP1240是蛋白質(zhì)水溶液拉曼光譜酰胺譜帶在1 240cm-1處的強(qiáng)度除以1448cm-1處CH2變形振動(dòng)譜帶強(qiáng)度的值。I1240是聚-L-賴氨酸呈現(xiàn)純-螺旋時(shí)拉曼譜酰胺III譜帶在1240cm-1的相應(yīng)值，其它強(qiáng)度量具有相似的意義。,分別是蛋白質(zhì)中-螺旋、-折疊和無序結(jié)構(gòu)的含量，Cp是比例常數(shù)。 IU，IU，IU值列于表11.8。表11.8聚-L-賴氨酸的IU，IBU，IRU值構(gòu)象水溶液1240cm-1譜帶重水溶液1632cm-1譜帶 1660cm-1譜帶螺旋0.000.80 0.5

21、5折疊1.200.72 0.88無序結(jié)構(gòu)0.600.08 0.78由圖11.31和圖11.32所得構(gòu)象標(biāo)志譜帶相對于1 444cm-1-1 448cm-1的相對強(qiáng)度(見表11.9)，再由上述方程計(jì)算，溶菌酶的-螺旋為32%，-折疊為9%，無規(guī)結(jié)構(gòu)為59%。核糖核酸酶A的-螺旋結(jié)構(gòu)為14%,-折疊為35%，無規(guī)結(jié)構(gòu)為51%。表11.9相對Raman強(qiáng)度構(gòu)象水溶液1240cm-1譜帶重水溶液1632cm-1譜帶 1660cm-1譜帶卵清溶菌酶0.640.50 0.99核糖核酸酶0.920.52 0.99溶菌酶(10%)水溶液和重水溶液的Raman光譜 核糖核酸酶A(5%)水溶液和重水溶液的Rama

22、n光譜 各種蛋白質(zhì)是由20種氨基酸中的若干組成的分子，其中只有幾種氨基酸的某些基團(tuán)可以在拉曼光譜中出現(xiàn)特征譜帶。另外含有S-S橋鍵的蛋白質(zhì)將出現(xiàn)S-S和C-S譜帶。某些蛋白質(zhì)還出現(xiàn)S-H譜帶，通常把這些譜帶稱為邊鏈振動(dòng)譜帶(表11.10)，這些邊鏈振動(dòng)譜帶往往是結(jié)構(gòu)靈敏的，所以研究它們可以得到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。蛋白質(zhì)中氨基酸邊鏈的特征拉曼帶特征譜帶苯丙氨酸1004(s), 1203(m), 1032(m), 624(m)酪氨酸1621(w), 1210(s), 1180(m), 850(s), 830(s), 650(m)色氨酸1620(w), 1553(s), 1433(w), 1358(s

23、), 1016(s), 880(m), 760(s)S-S橋鍵500-550(s)C-S630-670(m)S-H2550-2590(m)酪氨酸：蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基在850和830cm-1處有兩個(gè)強(qiáng)譜帶，它們是由取代苯的環(huán)呼吸振動(dòng)和面外環(huán)彎曲振動(dòng)之間的費(fèi)米共振所產(chǎn)生的。很多研究結(jié)果證明這兩個(gè)譜帶的強(qiáng)度比同酪氨酸殘基在蛋白質(zhì)分子中的微環(huán)境有關(guān)，即苯環(huán)上的OH基團(tuán)是與溶劑水分子生成氫鍵還是與蛋白質(zhì)分子其它殘基的-COOH基團(tuán)生成氫鍵有關(guān)。圖11.33表明酪氨酸殘基的微環(huán)境與850和830cm-1兩個(gè)譜帶強(qiáng)度的關(guān)系。對于不同的蛋白質(zhì)或隨著蛋白質(zhì)所處的物理?xiàng)l件的變化，這兩個(gè)譜帶的強(qiáng)度比也隨之變化。如圖11.34所示，Gly-Try二肽的I