生物制藥工藝學(xué)：第三章 生物制藥工藝技術(shù)的發(fā)展

1、1第三章第三章 生物制藥工藝技生物制藥工藝技 術(shù)的發(fā)展術(shù)的發(fā)展2生物技術(shù)生物技術(shù)的四大支柱四大支柱基因工程細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程生生物物技技術(shù)術(shù)（生物工程）用用“剪刀剪刀+ +糨糊糨糊”創(chuàng)創(chuàng)造新物種的工程造新物種的工程微觀水平的嫁微觀水平的嫁接技術(shù)接技術(shù)讓工廠高效、讓工廠高效、安靜、美麗安靜、美麗如畫的工程如畫的工程把微生物或細(xì)胞造把微生物或細(xì)胞造就成無數(shù)微型工廠，就成無數(shù)微型工廠，將神話變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)的將神話變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)的橋梁。橋梁。3第一代酶第一代酶酶制劑；酶制劑；第二代酶第二代酶固定化酶；固定化酶；第三代酶第三代酶固定化多酶（包含輔因子固定化多酶（包含輔因子 再生系統(tǒng)）。再生系統(tǒng)）。一、酶工程技術(shù)

2、一、酶工程技術(shù) 酶工程就是將酶或者微生物酶工程就是將酶或者微生物細(xì)胞細(xì)胞，動(dòng)植物細(xì)胞，動(dòng)植物細(xì)胞，細(xì)胞器細(xì)胞器等在一定的等在一定的生物反應(yīng)生物反應(yīng)裝置中，利用酶所具有的生物催化功裝置中，利用酶所具有的生物催化功能能, ,借助工程手段將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)并應(yīng)用于社借助工程手段將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)并應(yīng)用于社會(huì)生活的一門會(huì)生活的一門科學(xué)技術(shù)科學(xué)技術(shù)。4酶的分類n（一）蛋白酶（一）蛋白酶n（二）核酸類酶（二）核酸類酶（R酶）酶）n（三）國際系統(tǒng)分類法（三）國際系統(tǒng)分類法5酶催化作用特性n1高效性n2專一性n3反應(yīng)條件溫和n4. 酶活力可調(diào)節(jié)控制6酶的應(yīng)用酶的應(yīng)用|生物洗滌劑工業(yè)生物洗滌劑工

3、業(yè)|烘烤食品工業(yè)烘烤食品工業(yè)|釀酒工業(yè)釀酒工業(yè)|乳制品工業(yè)乳制品工業(yè)|糖工業(yè)糖工業(yè)|紡織工業(yè)紡織工業(yè)|制革工業(yè)制革工業(yè)|醫(yī)療和藥品工業(yè)醫(yī)療和藥品工業(yè)78酶的發(fā)酵生產(chǎn)n酶的生產(chǎn)是指經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，并且通過人工控制而獲酶的生產(chǎn)是指經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，并且通過人工控制而獲得所需要的酶的過程。得所需要的酶的過程。n提取法：提取法：最早采用并且沿用至今的一種方法。提取法最早采用并且沿用至今的一種方法。提取法采用各種技術(shù)，直接從動(dòng)植物或微生物的細(xì)胞或組織采用各種技術(shù)，直接從動(dòng)植物或微生物的細(xì)胞或組織中將酶提取出來。該法中將酶提取出來。該法簡單易行，但必須要有充足的簡單易行，但必須要有充足的原材料原材料。n發(fā)酵法：

4、發(fā)酵法：發(fā)酵法主要通過發(fā)酵法主要通過微生物發(fā)酵微生物發(fā)酵來獲得人們所需來獲得人們所需要的酶。要的酶。n化學(xué)合成法化學(xué)合成法 9微生物酶發(fā)酵生產(chǎn)概念微生物酶發(fā)酵生產(chǎn)概念n微生物酶是指在人工控制的條件下，有目的利微生物酶是指在人工控制的條件下，有目的利用微生物培養(yǎng)來生產(chǎn)所需要的酶，其技術(shù)包括用微生物培養(yǎng)來生產(chǎn)所需要的酶，其技術(shù)包括培養(yǎng)基和發(fā)酵方式的選擇及發(fā)酵條件的控制管培養(yǎng)基和發(fā)酵方式的選擇及發(fā)酵條件的控制管理等方面的內(nèi)容。理等方面的內(nèi)容。n生產(chǎn)流程生產(chǎn)流程n優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選基因工程菌（細(xì)胞）基因工程菌（細(xì)胞）的構(gòu)建的構(gòu)建微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)101 1、優(yōu)良產(chǎn)酶

5、菌種的篩選、優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選從動(dòng)植物組織中分離提取從動(dòng)植物組織中分離提取植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶|酶的來源酶的來源11繁殖快、生活周期短、產(chǎn)酶量高，酶比活高；繁殖快、生活周期短、產(chǎn)酶量高，酶比活高；培養(yǎng)方法簡單，原料來源豐富，經(jīng)濟(jì)效益高；培養(yǎng)方法簡單，原料來源豐富，經(jīng)濟(jì)效益高；微生物菌株種類繁多，酶的品種齊全；微生物菌株種類繁多，酶的品種齊全；可以通過誘導(dǎo)、誘變及基因工程等方法培育出新的可以通過誘導(dǎo)、誘變及基因工程等方法培育出新的產(chǎn)酶量高的菌種；產(chǎn)酶量高的菌種；|微生物作為產(chǎn)酶生產(chǎn)來源的優(yōu)點(diǎn)微生物作為產(chǎn)酶生產(chǎn)來源的優(yōu)點(diǎn)12|

6、優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的優(yōu)點(diǎn)繁殖快、產(chǎn)酶量高繁殖快、產(chǎn)酶量高能在便宜的底物上生長良好能在便宜的底物上生長良好產(chǎn)酶性能穩(wěn)定、菌株不易退化產(chǎn)酶性能穩(wěn)定、菌株不易退化產(chǎn)生的酶容易分離純化產(chǎn)生的酶容易分離純化13|產(chǎn)酶菌種的篩選方法產(chǎn)酶菌種的篩選方法篩選步驟：篩選步驟：樣品采集樣品采集菌種分離菌種分離產(chǎn)酶性能測定產(chǎn)酶性能測定復(fù)篩復(fù)篩產(chǎn)酶菌種的檢測：產(chǎn)酶菌種的檢測：胞外酶的產(chǎn)酶菌株的檢測胞外酶的產(chǎn)酶菌株的檢測胞內(nèi)酶的產(chǎn)酶菌株的檢測胞內(nèi)酶的產(chǎn)酶菌株的檢測14微生物微生物n大腸桿菌：大腸桿菌：大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌；工業(yè)上生大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌；工業(yè)上生

7、產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等。等。工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸等。核苷酸酶、某些氨基酸等。產(chǎn)生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等。在釀酒工產(chǎn)生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等。在釀酒工業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機(jī)酸。業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機(jī)酸。制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。

8、生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸、葡萄糖酸淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種。等）。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種。15動(dòng)、植物細(xì)胞植物細(xì)胞植物細(xì)胞 用于色素、藥物、香精、酶等次級代謝物的用于色素、藥物、香精、酶等次級代謝物的 生產(chǎn)。生產(chǎn)。動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞 用于疫苗、抗體、激素、多肽、酶等功能蛋白用于疫苗、抗體、激素、多肽、酶等功能蛋白的生產(chǎn)。的生產(chǎn)。162 2、基因工程菌（細(xì)胞）的構(gòu)建、基因工程菌（細(xì)胞）的構(gòu)建構(gòu)建基因工程菌的目標(biāo)構(gòu)建基因工程菌的目標(biāo)改善原有酶的各種性能：改善原有酶的各種性能：如提高酶產(chǎn)量、增加酶的穩(wěn)定性、改變?nèi)缣岣呙府a(chǎn)量、增加酶的穩(wěn)定

9、性、改變酶的適應(yīng)溫度等酶的適應(yīng)溫度等擴(kuò)充可安全使用的酶源擴(kuò)充可安全使用的酶源17酶基因克隆及表達(dá)的基本步驟酶基因克隆及表達(dá)的基本步驟18克隆酶基因的宿主克隆酶基因的宿主載體系統(tǒng)應(yīng)具備的特性載體系統(tǒng)應(yīng)具備的特性所希望的酶占細(xì)胞總蛋白量的比例要高；所希望的酶占細(xì)胞總蛋白量的比例要高；菌體容易大規(guī)模培養(yǎng)，生長無特殊要求；菌體容易大規(guī)模培養(yǎng)，生長無特殊要求；載體與宿主相容，且能在宿主中穩(wěn)定維持；載體與宿主相容，且能在宿主中穩(wěn)定維持；宿主的蛋白酶盡可能少；宿主的蛋白酶盡可能少；宿主菌對人安全，不分泌毒素。宿主菌對人安全，不分泌毒素。193 3、微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)、微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)基碳源碳源氮

10、源氮源無機(jī)鹽類無機(jī)鹽類生長因子生長因子培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的PHPH值值20植物細(xì)胞培養(yǎng)基植物細(xì)胞培養(yǎng)基特點(diǎn)：需要大量的無機(jī)鹽；需要多種維生素和植物生長激素；特點(diǎn)：需要大量的無機(jī)鹽；需要多種維生素和植物生長激素； 一般要求無機(jī)氮源；多數(shù)以蔗糖為碳源。一般要求無機(jī)氮源；多數(shù)以蔗糖為碳源。常用的培養(yǎng)基：常用的培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、KM-8P培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基等。微生物培養(yǎng)基微生物培養(yǎng)基碳源：淀粉或其水解產(chǎn)物碳源：淀粉或其水解產(chǎn)物氮源：混合氮源氮源：混合氮源21動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基氨基酸：必需氨基酸及半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等氨基酸：必需氨基酸及

11、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等維生素：血清提供或補(bǔ)充維生素：血清提供或補(bǔ)充B族維生素、維生素族維生素、維生素C無機(jī)鹽：大量元素（調(diào)節(jié)滲透壓），微量元素?zé)o機(jī)鹽：大量元素（調(diào)節(jié)滲透壓），微量元素（一般有血清提供）（一般有血清提供）葡萄糖：作為碳源和能源葡萄糖：作為碳源和能源激素：胰島素、生長激素、氫化可的松等。激素：胰島素、生長激素、氫化可的松等。一般由血清提供生長因子：血清中含有各種生長因子一般由血清提供生長因子：血清中含有各種生長因子組組 分分22微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的方式及特點(diǎn)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的方式及特點(diǎn)固體培養(yǎng)發(fā)酵：設(shè)備簡單、操作方便；勞動(dòng)強(qiáng)度大、原料利固體培養(yǎng)發(fā)酵：設(shè)備簡單、操作方便；勞動(dòng)強(qiáng)度大、

12、原料利 用率低、生產(chǎn)周期長。用率低、生產(chǎn)周期長。液體深層發(fā)酵：機(jī)械化程度較高，技術(shù)管理較嚴(yán)格，酶的液體深層發(fā)酵：機(jī)械化程度較高，技術(shù)管理較嚴(yán)格，酶的產(chǎn)率較高，質(zhì)量較穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率較高，產(chǎn)率較高，質(zhì)量較穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率較高，酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式固定化細(xì)胞發(fā)酵：提高產(chǎn)酶能力，發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)固定化細(xì)胞發(fā)酵：提高產(chǎn)酶能力，發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用，利于連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)，利于產(chǎn)品使用，利于連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量等顯著特點(diǎn)。的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量等顯著特點(diǎn)。固定化原生質(zhì)體發(fā)酵固定化原生質(zhì)體發(fā)酵23植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)產(chǎn)率高產(chǎn)

13、率高周期短周期短易于管理、減輕勞動(dòng)強(qiáng)度易于管理、減輕勞動(dòng)強(qiáng)度產(chǎn)品質(zhì)量高產(chǎn)品質(zhì)量高植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制溫度的控制：一般在室溫范圍；溫度的控制：一般在室溫范圍；pH的控制：微酸性范圍，即的控制：微酸性范圍，即pH56；溶解氧的調(diào)節(jié)控制：通風(fēng)和攪拌（不能太強(qiáng)烈）；溶解氧的調(diào)節(jié)控制：通風(fēng)和攪拌（不能太強(qiáng)烈）；光照的控制：根據(jù)細(xì)胞的特性及目的次級代謝產(chǎn)物的種類不光照的控制：根據(jù)細(xì)胞的特性及目的次級代謝產(chǎn)物的種類不 同，進(jìn)行光照的調(diào)節(jié)控制；同，進(jìn)行光照的調(diào)節(jié)控制；前體的添加：目的代謝物代謝途徑上游的物質(zhì)。前體的添加：目的代謝物代謝途徑上游的物質(zhì)。刺激劑的應(yīng)用：常用的

14、刺激劑有微生物細(xì)胞的碎片和果膠酶、刺激劑的應(yīng)用：常用的刺激劑有微生物細(xì)胞的碎片和果膠酶、纖維素酶等微生物胞外酶。纖維素酶等微生物胞外酶。24動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制種質(zhì)細(xì)胞種質(zhì)細(xì)胞 胰蛋白酶處理細(xì)胞胰蛋白酶處理細(xì)胞 得細(xì)胞懸浮液得細(xì)胞懸浮液 細(xì)胞接細(xì)胞接入培養(yǎng)液中入培養(yǎng)液中 在反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)在反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng) 收集培養(yǎng)液收集培養(yǎng)液 分離純化產(chǎn)物分離純化產(chǎn)物。溫度的控制：一般在溫度的控制：一般在36.5；pH的控制：的控制：pH7.07.6的微堿性環(huán)境；的微堿性環(huán)境；滲透壓的控制：與細(xì)胞內(nèi)的滲透壓處于等滲狀態(tài)；滲透壓的控制：與細(xì)胞內(nèi)的滲透壓處于等滲狀

15、態(tài)；溶解氧的控制：根據(jù)具體情況，對溶解氧進(jìn)行調(diào)節(jié)控制；溶解氧的控制：根據(jù)具體情況，對溶解氧進(jìn)行調(diào)節(jié)控制；25產(chǎn)酶工藝條件及其調(diào)節(jié)控制產(chǎn)酶工藝條件及其調(diào)節(jié)控制保藏細(xì)胞保藏細(xì)胞細(xì)胞活化細(xì)胞活化細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)產(chǎn)酶產(chǎn)酶分離純化分離純化酶酶無菌空氣無菌空氣培養(yǎng)基培養(yǎng)基原生質(zhì)體原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)酶生產(chǎn)的工藝流程26細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng) 將保藏的細(xì)胞接種于新鮮的培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)將保藏的細(xì)胞接種于新鮮的培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞的生命活性得以恢復(fù)的過程。行培養(yǎng)，使細(xì)胞的生命活性得以恢復(fù)的過程。條件：適合細(xì)胞生長

16、、繁殖的最適條件條件：適合細(xì)胞生長、繁殖的最適條件時(shí)間控制：培養(yǎng)到細(xì)胞對數(shù)生長期為宜時(shí)間控制：培養(yǎng)到細(xì)胞對數(shù)生長期為宜種子量：接入下一級種子擴(kuò)大培養(yǎng)或接入發(fā)酵罐的種種子量：接入下一級種子擴(kuò)大培養(yǎng)或接入發(fā)酵罐的種子量一般為下一級工序培養(yǎng)基總量的子量一般為下一級工序培養(yǎng)基總量的1%-10%1%-10%27產(chǎn)酶工藝條件的優(yōu)化與調(diào)節(jié)控制產(chǎn)酶工藝條件的優(yōu)化與調(diào)節(jié)控制1、pH的優(yōu)化與調(diào)節(jié)控制的優(yōu)化與調(diào)節(jié)控制2、溫度的優(yōu)化與調(diào)節(jié)控制、溫度的優(yōu)化與調(diào)節(jié)控制3、溶解氧的優(yōu)化與調(diào)節(jié)控制、溶解氧的優(yōu)化與調(diào)節(jié)控制（1）調(diào)節(jié)通氣量）調(diào)節(jié)通氣量（2）調(diào)節(jié)氧的分壓）調(diào)節(jié)氧的分壓（3）調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間）調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間（4）

17、調(diào)節(jié)氣液接觸面積）調(diào)節(jié)氣液接觸面積（5）改變培養(yǎng)液的性質(zhì)：黏度）改變培養(yǎng)液的性質(zhì)：黏度28提高酶產(chǎn)量的措施提高酶產(chǎn)量的措施添加誘導(dǎo)物：添加誘導(dǎo)物：酶的作用底物、酶的反應(yīng)產(chǎn)物、酶的底物類似物酶的作用底物、酶的反應(yīng)產(chǎn)物、酶的底物類似物控制阻遏物濃度控制阻遏物濃度表面活性劑表面活性劑添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑29添加誘導(dǎo)物添加誘導(dǎo)物能使某些酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的物質(zhì)。能使某些酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的物質(zhì)。酶的作用底物：（誘導(dǎo)酶）大腸桿菌在含乳糖的培養(yǎng)基中酶的作用底物：（誘導(dǎo)酶）大腸桿菌在含乳糖的培養(yǎng)基中能大量合成能大量合成-半乳糖苷酶半乳糖苷酶酶的反應(yīng)產(chǎn)物：纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶的生物合成

18、。酶的反應(yīng)產(chǎn)物：纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶的生物合成。酶作用底物的類似物：異丙基酶作用底物的類似物：異丙基-硫代半乳糖苷對硫代半乳糖苷對-半半乳糖苷酶的誘導(dǎo)效果比乳糖高幾百倍。乳糖苷酶的誘導(dǎo)效果比乳糖高幾百倍。30控制阻遏物的濃度控制阻遏物的濃度產(chǎn)物阻遏：由酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏：由酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物 引起的阻遏作用。引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏：有分解代謝物（如葡萄糖或其他容易分解代謝物阻遏：有分解代謝物（如葡萄糖或其他容易 利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物 質(zhì)）引起的阻遏作用。質(zhì)）引起的阻遏作用。無機(jī)磷酸無機(jī)磷

19、酸1.0 mmol/L1.0 mmol/L堿性磷酸酶堿性磷酸酶合成受阻合成受阻堿性磷酸酶堿性磷酸酶大量合成大量合成控制碳源濃度、添加一定量的環(huán)腺苷酸控制碳源濃度、添加一定量的環(huán)腺苷酸減少減少解除解除阻遏物阻遏物是能夠引起某些酶的生物合成停止或者減速的物質(zhì)。是能夠引起某些酶的生物合成停止或者減速的物質(zhì)。31添加表面活性劑添加表面活性劑細(xì)胞膜高度細(xì)胞膜高度的選擇透性的選擇透性表面活表面活性劑性劑增加細(xì)增加細(xì)胞的透胞的透過性過性利于胞外利于胞外酶分泌酶分泌酶產(chǎn)量酶產(chǎn)量4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶，但作用機(jī)理未闡明清楚的物質(zhì)。產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶，但作用機(jī)理未闡明

20、清楚的物質(zhì)。324、酶的分離純化、酶的分離純化由于酶不穩(wěn)定，在提取時(shí)容易變性失活，因而在提取時(shí)要注意：由于酶不穩(wěn)定，在提取時(shí)容易變性失活，因而在提取時(shí)要注意：溫度：盡可能在低溫（溫度：盡可能在低溫（0-40-4）進(jìn)行，防止變性失活或蛋白水解酶對目的酶的）進(jìn)行，防止變性失活或蛋白水解酶對目的酶的破壞作用破壞作用PHPH值：提取過程中一般采用緩沖液作為溶劑，防止過酸或過堿；值：提取過程中一般采用緩沖液作為溶劑，防止過酸或過堿；鹽濃度：選用合適濃度鹽溶液以促進(jìn)蛋白溶解；鹽濃度：選用合適濃度鹽溶液以促進(jìn)蛋白溶解；攪拌：劇烈攪拌容易引起蛋白質(zhì)變性；攪拌：劇烈攪拌容易引起蛋白質(zhì)變性；微生物對酶的破壞：盡可

21、能防止微生物對酶的破壞。微生物對酶的破壞：盡可能防止微生物對酶的破壞。33酶的純度和酶活力酶的純度和酶活力酶純化的過程中，每一步驟都要進(jìn)行酶活性和比活性的測定，酶純化的過程中，每一步驟都要進(jìn)行酶活性和比活性的測定，這樣才知道所需的酶在哪一個(gè)部分，也才可以用來比較酶的這樣才知道所需的酶在哪一個(gè)部分，也才可以用來比較酶的純度。酶的純度可用酶的純度。酶的純度可用酶的比活力比活力來衡量，來衡量，比活力是以每毫克比活力是以每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位。一般情況下，酶的比活力隨酶。一般情況下，酶的比活力隨酶純度的提高而提高。純度的提高而提高。34酶制劑的保存酶制劑的保存溫度溫度緩

22、沖液緩沖液氧化氧化/ /還原還原蛋白質(zhì)的濃度及純度蛋白質(zhì)的濃度及純度355、酶分子的改造、酶分子的改造酶應(yīng)用存在的問題：酶應(yīng)用存在的問題：（1 1）不穩(wěn)定、易變性：酶作用的最適）不穩(wěn)定、易變性：酶作用的最適PHPH條件一般在中性，條件一般在中性，PHPH值常偏離中性范值常偏離中性范圍，使酶難于發(fā)揮作用；圍，使酶難于發(fā)揮作用；（2 2）具有抗原性：在臨床應(yīng)用上，由于絕大多數(shù)的酶對人體而言都是外源蛋）具有抗原性：在臨床應(yīng)用上，由于絕大多數(shù)的酶對人體而言都是外源蛋白質(zhì)，具有抗原性，直接注入會(huì)引起人體的過敏反應(yīng)。白質(zhì)，具有抗原性，直接注入會(huì)引起人體的過敏反應(yīng)。解決方法：改變現(xiàn)有酶特性：解決方法：改變現(xiàn)

23、有酶特性：（1 1）通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶結(jié)構(gòu)；）通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶結(jié)構(gòu)；（2 2）通過生物工程方法改造編碼分子的基因從而達(dá)到改造酶的目的。）通過生物工程方法改造編碼分子的基因從而達(dá)到改造酶的目的。36酶分子修飾酶分子修飾酶分子修飾是指通過主酶分子修飾是指通過主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對酶分子進(jìn)行化學(xué)修飾對酶分子進(jìn)行改造，改造的目的在于改造，改造的目的在于改變酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)改變酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造出天然酶不具備的某造出天然酶不具備的某些優(yōu)良性狀，擴(kuò)大酶的些優(yōu)良性狀，擴(kuò)大酶的應(yīng)用以達(dá)到較高的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用以達(dá)到較高的經(jīng)濟(jì)效益效益37酶

24、的蛋白質(zhì)工程酶的蛋白質(zhì)工程酶的蛋白質(zhì)工程是指通過基因工程或隨機(jī)誘變的方式改變編碼酶蛋酶的蛋白質(zhì)工程是指通過基因工程或隨機(jī)誘變的方式改變編碼酶蛋白分子的白分子的DNADNA序列，從而達(dá)到改變酶的生理、生化特性的技術(shù)。序列，從而達(dá)到改變酶的生理、生化特性的技術(shù)。（1 1）對于一些功能和特性僅僅有蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中某些氨基酸殘）對于一些功能和特性僅僅有蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中某些氨基酸殘基的化學(xué)性質(zhì)決定的酶，可通過基因工程技術(shù)直接改變或消除這些基的化學(xué)性質(zhì)決定的酶，可通過基因工程技術(shù)直接改變或消除這些側(cè)鏈來改變原有酶的有關(guān)功能或特性；側(cè)鏈來改變原有酶的有關(guān)功能或特性；（2 2）隨機(jī)誘變編碼酶蛋白的基因，然后進(jìn)

25、行定向的篩選和選擇。）隨機(jī)誘變編碼酶蛋白的基因，然后進(jìn)行定向的篩選和選擇。38酶蛋白質(zhì)工程的策略酶蛋白質(zhì)工程的策略p分子裁減分子裁減 p定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變 p對隨機(jī)誘變的基因庫進(jìn)行定向的篩選和選擇對隨機(jī)誘變的基因庫進(jìn)行定向的篩選和選擇 p雜交酶（雜交酶（hybridenzymehybridenzyme） n 利用高度同源的酶之間的雜交利用高度同源的酶之間的雜交 n 創(chuàng)造具有新活性的雜交酶創(chuàng)造具有新活性的雜交酶 39舉例舉例|枯草桿菌蛋白酶：枯草桿菌蛋白酶：功能：功能：分解蛋白質(zhì)，可用于去掉衣服分解蛋白質(zhì)，可用于去掉衣服上的血漬。上的血漬。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：在漂白劑的作用下失活（在漂白劑的作用下失活（2

26、22222位的甲硫氨酸易被氧化）。位的甲硫氨酸易被氧化）。改造：改造：用絲氨酸或丙氨酸代替其用絲氨酸或丙氨酸代替其222222位的甲硫氨酸，抗氧化能力大大提高。位的甲硫氨酸，抗氧化能力大大提高。406、酶的固定化、酶的固定化酶的固定化：指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能酶的固定化：指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。目的：使酶既具有催化性質(zhì)，又能回收反復(fù)使用，在生目的：使酶既具有催化性質(zhì)，又能回收反復(fù)使用，在生產(chǎn)工藝上可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和自動(dòng)化。產(chǎn)工藝上可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和自動(dòng)化。分類：酶的固定化和細(xì)胞的固定化。

27、分類：酶的固定化和細(xì)胞的固定化。41固定化酶固定化酶水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技術(shù)固定化技術(shù)42固定化酶的特點(diǎn)：固定化酶的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：固定化過程中往往會(huì)引起酶的失活.增加成本可溶性小分子底物適宜缺點(diǎn)缺點(diǎn)： 不溶于水，易于與產(chǎn)物分離； 可反復(fù)使用； 可連續(xù)化生產(chǎn)； 穩(wěn)定性好。43(1)吸附法：可分為物理吸附法和 離子吸附法。EEEE酶的固定化方法酶的固定化方法物理吸附法：物理吸附法：這是酶通過氫鍵、疏水鍵等作用力通過氫鍵、疏水鍵等作用力物理吸附于不溶性載體的一種固定化方法。離子結(jié)合法：離子結(jié)合法：酶通過離子鍵離子鍵結(jié)合于具有離

28、子交換基的水不溶性載體的固定化方法。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑。44(2)(2)包埋法：將酶包埋于凝膠或高分子聚合物網(wǎng)格內(nèi)包埋法：將酶包埋于凝膠或高分子聚合物網(wǎng)格內(nèi) 常用的包埋劑有聚丙烯酰胺、卡拉膠、淀粉凝膠、 三醋酸纖維素、海藻酸、膠原、血纖維和大豆蛋白等。EEEE451、凝膠包埋法（膠格包埋法）（網(wǎng)格型）將酶分子包埋在高聚物網(wǎng)格高聚物網(wǎng)格內(nèi)的包埋方法。n聚丙烯酰胺包埋聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 n卡拉膠 n海藻酸鈉、膠原和明膠也是常用的包埋載體。 462、微囊化包埋法（微囊型）微囊法主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體膠囊、脂質(zhì)體中。微囊型固定化酶通常是直徑為幾微米到幾百微米的球狀體

29、，顆粒比網(wǎng)格型要小得多，比較有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散，但是反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。膠囊和脂質(zhì)體主要用于醫(yī)學(xué)治療。作為膜材料的高聚物有硝酸纖維素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。47n包埋法優(yōu)點(diǎn)：一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率較高可進(jìn)行大量的固定化；包埋膜可選用生物相容材料，并可做成任意大小 n包埋法缺點(diǎn)：在發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)時(shí)包埋，酶容易失活包埋法只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶48(3)(3)酶以共價(jià)鍵結(jié)合于載體的固定化方法，即將酶分子上非活性部位功能團(tuán)與載體表面反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的方法。EEEE49n共價(jià)結(jié)合法優(yōu)點(diǎn)：共價(jià)結(jié)合法優(yōu)點(diǎn)： 載體與酶偶

30、聯(lián)的方法多樣化；酶與載體結(jié)合牢固，一般不會(huì)因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。n共價(jià)結(jié)合法缺點(diǎn)：共價(jià)結(jié)合法缺點(diǎn)：反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜偶聯(lián)試劑對生命組織多有一定毒性 由于采用了比較激烈的反應(yīng)條件，會(huì)引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)變化，破壞部分活性中心（酶活回收率30左右）底物的專一性等酶的性質(zhì)可能會(huì)發(fā)生變化50(4)(4)交聯(lián)法：交聯(lián)法：是使用雙功能或多功能試劑與酶分子之間進(jìn)行分子間的交聯(lián)反應(yīng)的固定化方法。此法與共價(jià)結(jié)合法一樣也是利用共價(jià)鍵固定酶，所不同的是它不使用載體。EEEEEEE酶蛋白分子彼此交叉連接起來，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)酶蛋白分子彼此交叉連接起來，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)51n交聯(lián)劑：形成希夫堿的戊二醛，形成

31、肽鍵的異氰酸酯，發(fā)生重氮偶合反應(yīng)的雙重氮聯(lián)苯胺或N,N-乙烯雙馬來亞胺等。n參與交聯(lián)反應(yīng)的酶蛋白的功能基團(tuán)：N-末端的-氨基、賴氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基等。n交聯(lián)法的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是操作簡便。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件比較激烈，固定化的酶活回收率一般比較低，常出現(xiàn)擴(kuò)散限制，使用有一定難度。盡可能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間有利于固定化酶比活的提高。52圖10-1 固定化酶的模式（a）離子結(jié)合；（b）共價(jià)結(jié)合；（c）交聯(lián)；（d）聚合物包埋；（e）疏水相互作用；（f）脂質(zhì)體包埋；（g）微膠囊； 53各類固定化方法的特點(diǎn)比較:固定化方法載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法物理吸附法 離子結(jié)合法

32、共價(jià)結(jié)合法制備難易易易難較難較難結(jié)合程度弱中等強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)酶活回收率高，但酶易流失高低中等高對底物專一性不變不變可變可變不變再生可能可能不可能不可能不可能固定化費(fèi)用低低高中等低545556細(xì)胞的固定化方法細(xì)胞的固定化方法細(xì)胞固定化是將完整細(xì)胞固定在載體上的技術(shù)，它免去了破碎細(xì)胞提取酶等步細(xì)胞固定化是將完整細(xì)胞固定在載體上的技術(shù)，它免去了破碎細(xì)胞提取酶等步驟，直接利用細(xì)胞內(nèi)的酶，因而固定后酶活基本沒有損失。驟，直接利用細(xì)胞內(nèi)的酶，因而固定后酶活基本沒有損失。包埋法：包埋法：將細(xì)胞包埋在多微孔載體內(nèi)部制備固定化細(xì)胞的方法，可分為凝膠包將細(xì)胞包埋在多微孔載體內(nèi)部制備固定化細(xì)胞的方法，可分為凝膠包埋法、纖維

33、包埋法和微膠囊包埋法。埋法、纖維包埋法和微膠囊包埋法。吸附法：吸附法：主要利用細(xì)胞與載體之間的吸引力（范德華力、離子鍵和氫鍵），使主要利用細(xì)胞與載體之間的吸引力（范德華力、離子鍵和氫鍵），使細(xì)胞固定在載體上。細(xì)胞固定在載體上。57固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)酶活力的變化：活力比天然酶的活力低，專一性也可能發(fā)生變化。酶活力的變化：活力比天然酶的活力低，專一性也可能發(fā)生變化。酶穩(wěn)定性提高：穩(wěn)定性包括熱穩(wěn)定性、對各種有機(jī)試劑的穩(wěn)定性、對酶穩(wěn)定性提高：穩(wěn)定性包括熱穩(wěn)定性、對各種有機(jī)試劑的穩(wěn)定性、對PHPH穩(wěn)定性、穩(wěn)定性、對蛋白水解酶的抗性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性等。對蛋白水解酶的抗性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性等。最適最適PHP

34、H值的變化：催化底物的最適值的變化：催化底物的最適PHPH值和值和PHPH活性曲線常發(fā)生變化，原因是微環(huán)活性曲線常發(fā)生變化，原因是微環(huán)境表面電荷的影響。境表面電荷的影響。最適溫度的變化：一般情況下，固定化后酶失活速度下降，最適溫度也隨之提最適溫度的變化：一般情況下，固定化后酶失活速度下降，最適溫度也隨之提高。高。動(dòng)力常數(shù)的變化。動(dòng)力常數(shù)的變化。58固定化酶的指標(biāo)固定化酶的指標(biāo)相對酶活力：相對酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值稱為相對具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值稱為相對酶活力，相對酶活力低于酶活力，相對酶活力低于75%75%的固定化酶，一般沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。的固

35、定化酶，一般沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。酶的活力回收率：酶的活力回收率：固定化酶的總活力與用于固定化的酶的活力百分比稱為固定化酶的總活力與用于固定化的酶的活力百分比稱為酶的活力回收率，一般情況下，活力回收率應(yīng)小于酶的活力回收率，一般情況下，活力回收率應(yīng)小于1.1.固定化酶的半衰期：固定化酶的半衰期：即固定化酶的活力下降到位初始活力一般所經(jīng)歷的時(shí)即固定化酶的活力下降到位初始活力一般所經(jīng)歷的時(shí)間。它是衡量固定化酶操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵間。它是衡量固定化酶操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵59酶反應(yīng)器酶反應(yīng)器以酶為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需的以酶為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需的設(shè)備稱為設(shè)備稱為酶反應(yīng)器酶反應(yīng)器。按酶狀態(tài)可分：一類直接應(yīng)用按酶狀態(tài)可分：

36、一類直接應(yīng)用游離酶進(jìn)行反應(yīng)的游離酶進(jìn)行反應(yīng)的均相酶反應(yīng)均相酶反應(yīng)器器；另一類應(yīng)用固定化酶進(jìn)行；另一類應(yīng)用固定化酶進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)的非均相酶反應(yīng)器非均相酶反應(yīng)器。60酶反應(yīng)器的基本類型酶反應(yīng)器的基本類型 攪拌罐型反應(yīng)器攪拌罐型反應(yīng)器 其基本結(jié)構(gòu)由容器、攪拌器及保溫裝置組成。有時(shí)也可在容器壁其基本結(jié)構(gòu)由容器、攪拌器及保溫裝置組成。有時(shí)也可在容器壁上裝上擋板，以促進(jìn)反應(yīng)物的混合。上裝上擋板，以促進(jìn)反應(yīng)物的混合。間歇式攪拌罐間歇式攪拌罐連續(xù)式攪拌罐連續(xù)式攪拌罐多級連續(xù)攪拌罐多級連續(xù)攪拌罐61固定床型反應(yīng)器固定床型反應(yīng)器 把催化劑填充在固定床（填充床）中的反應(yīng)器叫做固定床型反應(yīng)器。適用于不含固體顆粒、粘度

37、不大的底物溶液。 填充床（固定床）填充床（固定床） 帶循環(huán)的固定床帶循環(huán)的固定床 列管式固定床列管式固定床 62流化床型反應(yīng)器流化床型反應(yīng)器 流化床型反應(yīng)器是一種裝有較小顆粒的垂直塔式反應(yīng)器。底物以一定的流速從下向上流過，使固定化酶顆粒在流體中維持懸浮狀態(tài)并進(jìn)行反應(yīng)，這時(shí)的固定化顆粒和流體可以被看作是均勻混合的流體。 流化床型反應(yīng)器63膜式反應(yīng)器膜式反應(yīng)器 膜反應(yīng)器是利用膜的分離功能，同時(shí)完成反應(yīng)和分離過程的反應(yīng)器，包括用固定化酶膜組裝的平板狀或螺旋卷型反器、轉(zhuǎn)盤反應(yīng)器和空心酶管、中空纖維膜反應(yīng)器等。 螺旋卷式生物膜反應(yīng)器螺旋卷式生物膜反應(yīng)器 攪拌罐攪拌罐- -超濾器聯(lián)合裝置超濾器聯(lián)合裝置64

38、65電鏡放大的中空纖維膜電鏡放大的過濾膜孔徑中空纖維膜絲66n膜的膜的4 4種主要功能：種主要功能：n載體功能：固定化載體，生物活性的功能膜載體功能：固定化載體，生物活性的功能膜n分離功能：膜的多孔性、膜與組分物理化學(xué)作用分離功能：膜的多孔性、膜與組分物理化學(xué)作用的不同，選擇性透過不同物質(zhì)。的不同，選擇性透過不同物質(zhì)。n分隔功能：膜的兩個(gè)表面將系統(tǒng)分隔成相關(guān)聯(lián)的分隔功能：膜的兩個(gè)表面將系統(tǒng)分隔成相關(guān)聯(lián)的兩個(gè)部分，可透過相關(guān)物質(zhì)。兩個(gè)部分，可透過相關(guān)物質(zhì)。n復(fù)合功能：依靠復(fù)合技術(shù)制備出幾層不同功能膜復(fù)合功能：依靠復(fù)合技術(shù)制備出幾層不同功能膜組成的復(fù)合膜。組成的復(fù)合膜。67第二代酶反應(yīng)器的主要類型

39、第二代酶反應(yīng)器的主要類型n 含輔因子的酶反應(yīng)器n 兩相或多相酶反應(yīng)器n 固定化多酶反應(yīng)器 酶反應(yīng)器68酶反應(yīng)器的選擇n考慮：酶形式、酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、底物和考慮：酶形式、酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、底物和產(chǎn)物的理化性質(zhì)等產(chǎn)物的理化性質(zhì)等n反應(yīng)器盡可能具有結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、易于反應(yīng)器盡可能具有結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、易于維護(hù)和清洗、維護(hù)和清洗、n可適用于多種酶的催化反應(yīng)、制成成本和運(yùn)行可適用于多種酶的催化反應(yīng)、制成成本和運(yùn)行成本較低等特點(diǎn)。成本較低等特點(diǎn)。69依據(jù)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)選擇反應(yīng)器n酶與底物分子有效碰撞和結(jié)合酶與底物分子有效碰撞和結(jié)合反應(yīng)系統(tǒng)混合反應(yīng)系統(tǒng)混合均勻均勻攪拌罐式反應(yīng)器、流化床式反應(yīng)器。攪拌

40、罐式反應(yīng)器、流化床式反應(yīng)器。n高濃度底物對酶抑制高濃度底物對酶抑制流加分批罐式反應(yīng)器、流加分批罐式反應(yīng)器、填充床式反應(yīng)器、流化床式反應(yīng)器等填充床式反應(yīng)器、流化床式反應(yīng)器等n產(chǎn)物抑制酶反應(yīng)產(chǎn)物抑制酶反應(yīng)膜反應(yīng)器、填充床式反應(yīng)器。膜反應(yīng)器、填充床式反應(yīng)器。n耐高溫酶耐高溫酶噴射式反應(yīng)器。噴射式反應(yīng)器。70根據(jù)底物或產(chǎn)物的理化性質(zhì)選擇反應(yīng)器n底物和產(chǎn)物的理化性質(zhì)直接影響酶催化反應(yīng)速率底物和產(chǎn)物的理化性質(zhì)直接影響酶催化反應(yīng)速率n底物或產(chǎn)物的分子質(zhì)量、溶解性、粘度等性質(zhì)對反底物或產(chǎn)物的分子質(zhì)量、溶解性、粘度等性質(zhì)對反應(yīng)器的選擇有重要影響。應(yīng)器的選擇有重要影響。p（1 1）反應(yīng)底物或產(chǎn)物分子質(zhì)量較大時(shí)）反

41、應(yīng)底物或產(chǎn)物分子質(zhì)量較大時(shí)，不宜采用膜，不宜采用膜反應(yīng)器。反應(yīng)器。p（2 2）底物或產(chǎn)物溶解度低、粘度高時(shí)）底物或產(chǎn)物溶解度低、粘度高時(shí)，選擇攪拌罐，選擇攪拌罐式反應(yīng)器，不采用填充床式反應(yīng)器和膜式反應(yīng)器。式反應(yīng)器，不采用填充床式反應(yīng)器和膜式反應(yīng)器。p（3 3）底物為氣體時(shí)，選擇鼓泡式反應(yīng)器。）底物為氣體時(shí)，選擇鼓泡式反應(yīng)器。p（4 4）小分子物質(zhì)作為輔酶的催化反應(yīng)，不選膜反應(yīng)）小分子物質(zhì)作為輔酶的催化反應(yīng)，不選膜反應(yīng)器，以免輔酶的流失。器，以免輔酶的流失。71酶反應(yīng)器使用中應(yīng)注意的問題n酶的穩(wěn)定性對酶反應(yīng)器的功效是很重要的酶的穩(wěn)定性對酶反應(yīng)器的功效是很重要的。在操作過程中，有時(shí)需要用酸或。在操

42、作過程中，有時(shí)需要用酸或堿來調(diào)節(jié)反應(yīng)液堿來調(diào)節(jié)反應(yīng)液pHpH。如果局部的。如果局部的pHpH過高或過低，就會(huì)引起酶的失活，或者使過高或過低，就會(huì)引起酶的失活，或者使底物和產(chǎn)物發(fā)生水解反應(yīng)。這時(shí)，可用加快攪拌已促使混合均勻。底物和產(chǎn)物發(fā)生水解反應(yīng)。這時(shí)，可用加快攪拌已促使混合均勻。n如果底物和產(chǎn)物在反應(yīng)器中不夠穩(wěn)定的話，可以采用高濃度的酶，以減少底如果底物和產(chǎn)物在反應(yīng)器中不夠穩(wěn)定的話，可以采用高濃度的酶，以減少底物和產(chǎn)物在反應(yīng)器中的停留時(shí)間，從而減少損失物和產(chǎn)物在反應(yīng)器中的停留時(shí)間，從而減少損失n防止防止微生物污染微生物污染n酶反應(yīng)器操作中，生產(chǎn)能力逐漸降低，主要原因是酶反應(yīng)器操作中，生產(chǎn)能力逐

43、漸降低，主要原因是固定化酶活性降低或損失固定化酶活性降低或損失。造成固定化酶活性損失的原因：造成固定化酶活性損失的原因：q（1 1）酶本身的失活；）酶本身的失活；q（2 2）酶從載體上脫落；）酶從載體上脫落；q（3 3）載體的破碎或溶解。）載體的破碎或溶解。7273甲生物甲生物乙生物乙生物取出優(yōu)取出優(yōu)秀基因秀基因“剪切剪切”“拼接拼接”新類型新類型表達(dá)表達(dá)新的生物產(chǎn)品新的生物產(chǎn)品基基因因敲敲除除技技術(shù)術(shù)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因技技術(shù)術(shù)生物生物新類型新類型敲敲除除不不利利基基因因新的生物產(chǎn)品新的生物產(chǎn)品二、基因工程技術(shù)二、基因工程技術(shù)74基因操作的工具基因操作的工具、基因的剪刀、基因的剪刀限制性內(nèi)切酶（限制

44、酶）限制性內(nèi)切酶（限制酶）一種限制酶只能一種限制酶只能識別一種特定的核苷識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的酸序列，并在特定的切割點(diǎn)上將切割點(diǎn)上將DNA DNA 分子分子切斷。切斷。限制性內(nèi)切酶ECOR75767778黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端79黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端802、“分子縫合針” DNA連接酶n催化磷酸二酯鍵形成催化磷酸二酯鍵形成818283843、“分子運(yùn)輸車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體運(yùn)載體需要的條件：常用運(yùn)載體： 細(xì)菌的質(zhì)粒 噬菌體或某些動(dòng)植物病毒8586基因操作的基本步驟基因操作的基本步驟、提取目的基因、提取目的基因?qū)⑿枰幕驈墓w生物需要的基因從供體生

45、物的細(xì)胞內(nèi)提取出來。的細(xì)胞內(nèi)提取出來。供體生物細(xì)胞供體生物細(xì)胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶87提取目的基因的方法提取目的基因的方法用限制酶切用限制酶切斷成許多片段斷成許多片段直接分離基因直接分離基因鳥槍法鳥槍法88人工合成基因法人工合成基因法DNADNA合成儀合成儀逆轉(zhuǎn)錄法：以信使逆轉(zhuǎn)錄法：以信使RNARNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將脫氧核苷酸合的作用下將脫氧核苷酸合成合成成合成DNA(DNA(基因基因) )。直接合成法：根據(jù)直接合成法：根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算出信使出信使RNARNA核苷酸

46、順序，核苷酸順序，再據(jù)此推算出基因再據(jù)此推算出基因DNADNA的的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)的基因。的基因。892 2、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合903 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之?dāng)U增、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之?dāng)U增導(dǎo)入導(dǎo)入擴(kuò)增擴(kuò)增要讓目的基因表達(dá)，必要讓目的基因表達(dá)，必須將它導(dǎo)入受體細(xì)胞并進(jìn)行須將它導(dǎo)入受體細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增。為獲得目的基因的表達(dá)為獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，通常以大腸桿菌等產(chǎn)物時(shí)，通常以大腸桿菌等無害易得的細(xì)菌為受體。為無害易得的細(xì)菌為受體。為改進(jìn)某種生物時(shí)，將欲改進(jìn)改進(jìn)某種生物時(shí)，將欲改

47、進(jìn)的生物細(xì)胞為受體。的生物細(xì)胞為受體。91將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)92方法方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法 感受態(tài)細(xì)胞吸收感受態(tài)細(xì)胞吸收 DNADNA分子分子將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞93 4 4、目的基因的檢測和表達(dá)、目的基因的檢測和表達(dá)為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)為保證目

48、的基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細(xì)胞中胞來接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物94多細(xì)胞生物的檢測，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培多細(xì)胞生物的檢測，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測這些個(gè)體是否攝養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測這些個(gè)體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個(gè)體，保留有相應(yīng)相應(yīng)

49、的性狀）。淘汰無變化的個(gè)體，保留有相應(yīng)變化的個(gè)體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。變化的個(gè)體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。95供 體 細(xì) 胞目 的 基 因載 體重 組 D N A 分 子轉(zhuǎn) 化 細(xì) 胞受 體 細(xì) 胞多 肽 藥 物疫 苗 、 抗 體基 因 治 療基 因 診 斷 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物(畜 牧 業(yè) 、 漁 業(yè) 生 物 反 應(yīng) 器 )轉(zhuǎn) 基 因 植 物(農(nóng) 業(yè) 、 林 業(yè) 生 物 反 應(yīng) 器 )冶 金 、 環(huán) 保輕 工 、 食 品96抗蟲轉(zhuǎn)基因植物利用轉(zhuǎn)基因改良植物品質(zhì)抗逆轉(zhuǎn)基因植物抗病轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因作物97蟲害殺蟲基因t毒蛋白基因；淀粉酶抑制基因；植物凝集素基因。環(huán)境污染、損害健康、增加成本。農(nóng)藥抗蟲轉(zhuǎn)基因植物抗蟲植物98抗病轉(zhuǎn)基因植物抗病基因病毒外殼蛋白基因；病毒復(fù)制酶基因；幾丁質(zhì)酶基因；抗毒素合成基因?；ㄈ~病 99抗逆轉(zhuǎn)基因植物抗鹽堿、干旱基因。干旱調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓鹽堿地澇災(zāi)抗鹽堿、抗旱、耐寒、抗除草劑。100利用轉(zhuǎn)基因改良植物品質(zhì)食品營養(yǎng)食品營養(yǎng)不均衡不均衡富含氨基酸的蛋白質(zhì)編碼基因賴氨酸含量提高30%。豆類：蛋氨酸少。大麥、玉米、小麥：賴氨酸少。101控制成熟的基因番茄延熟番茄與植物花青素代謝有關(guān)的基因102轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提高動(dòng)物生長速度外