無菌檢驗方法適用性試驗方案

1、無菌檢驗方法適用性試驗方案目錄1 .概述試驗背景為保證無菌檢驗結果的準確可靠，當建立產品的無菌檢查法時，應進行方法的適用性試驗，以確認供試品在該實驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計，所采用的方法適合于該產品的無菌檢查。按照中國藥典2015年版四部“通則1101無菌檢查法”要求，檢驗程序或產品發(fā)生變化可能影響檢驗結果時，檢查方法應進行重新試驗。根據(jù)2015年版藥典及藥品微生物實驗室質量管理指導原則要求，檢測環(huán)境由原來的為C級背景下局部 A級空氣單向流，在層流凈化工作臺下進行無菌檢測，變更為在C級背景下，無菌檢查ORABS鬲離系統(tǒng)中進彳T無菌檢測，且由原來的臭氧消毒，變更為臭氧+過氧化氫滅

2、菌 消毒；培養(yǎng)基發(fā)生變更：由培養(yǎng)真菌用的改良馬丁培養(yǎng)基變更為胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度由23-28 C變更為20-25 C,現(xiàn)針對XXX注射液進行適用性試驗，以證明所采用的方 法適合該藥品的無菌檢查。方案說明驗證過程中嚴格按照經批準的方案規(guī)定的內容進行，若因特殊原因需要變更時，應填寫方案變更申請及批準書，報試驗領導小組批準。2 .確認目的按照中國藥典2015年版四部“通則1101無菌檢查法”規(guī)定對小兒氨基酸注射液無 菌檢查方法進行試驗， 在現(xiàn)有檢驗程序、 檢測條件及培養(yǎng)條件下，對該供試品的適用性試驗進行確認，證明所采用的方法適合該藥品的無菌檢查。驗證過程中應嚴格按照本方案規(guī)定的內容進行，

3、若因特殊原因確需變更時， 應填寫驗證方案變更申請及批準書，報驗證領導小組批準。3 .小組人員4 .風險評估 風險等級標準A.嚴重程度（S）:測定風險的潛在后果，分為以下四級：評分嚴重程度描述4關鍵直接影響產品質量要素或工藝與質量數(shù)據(jù)的可靠性、完整莊或可追蹤性，可能導致產品不能使用，直接影響GMPM則，危害生產區(qū)活動。3高直接影響產品質量要素或工藝與質量數(shù)據(jù)的可靠性、完整莊或可追蹤性，可能導致產品召回或退回， 未能符合一些 GMP（則，可能引起檢查或審計中產生偏差。2中（/、重要的）對產品或數(shù)據(jù)無相關影響，但間接影響產品質量要素或工藝與 質量數(shù)據(jù)的可靠性、完整莊或可追蹤性，可能造成資源的嚴重 浪

4、費或對企業(yè)形象產生較壞影響。1低（可以忽略）對產品或數(shù)據(jù)無相關影響，但對產品質量要素或工藝與質量數(shù) 據(jù)的可靠性、完整性或可追蹤性仍產生較小影響。B.可能性程度（P）:測定風險產生的可能性，為建立統(tǒng)一基線，建立以下四個等級:評分可能性描述4極高極易發(fā)生，約一星期一次或者更頻繁3高偶爾發(fā)生，約一個月一次2中很少發(fā)生，約一年一次1低發(fā)生可能性極低，三年甚至更長時間都/、大可能發(fā)生C.檢測能力（D）:在潛在風險造成危害前，檢測發(fā)現(xiàn)的可能性，設為以下四個等級:評分檢測能力描述4極低失敗很可能被忽視，因此沒有檢測到（無檢測機制，無人工或視覺校驗）3低不檢測，但可能被發(fā)現(xiàn)，如：作為現(xiàn)場檢查的審計2中定期檢測

5、，如：常規(guī)的手動控制或分析可檢測到錯誤1高始終檢測到，如：自動控制裝置到位，故障報警或錯誤后無法下一流程操作風險分析及評價：根據(jù)確定的風險標準對已經識別并分析的風險進行評價，即通過評價風險的嚴重性和可能性從而確認風險的等級。質量風險優(yōu)先級別評價標準如下：RPN嚴重程度風險級別風險處理優(yōu)先等級RPN 16 或 S=4高等風險高優(yōu)先8WRPNC 16中等風險優(yōu)先RPNC 7低等風險忽略風險優(yōu)先系數(shù)（RPN計算：嚴重程度（S） x可能性程度（P） x檢測能力（口。風險水平的劃分：RPN16或嚴重程度=4高風險水平：此為不可接受風險。必須盡快采用控制措施，通過提高可檢測性及/或降低風險產生的可能性來降

6、低最終風險水平。驗證應首先集中于確認已采用控制措施且持續(xù)執(zhí)行。由嚴重程度為4導致的高風險水平，必須將其降低至RPN最大=8。 16RPN8中等風險水平：此風險要求采用控制措施，通過提高可檢測性及/或降低風險產生的可能性來降低最終風險水平。所采用的措施可以是規(guī)程或技術措施，但均應經過驗證。 RPNK7低風險水平：此風險水平為可接受，無需采用額外的控制措施。風險的確認無菌檢查結果不成立風險的分析及評價依據(jù)風險分析及評價結果需實施的確認項目 .試驗前準備文件確認序號文件/資料編p存放地點123456檢查人：檢查日期:復核人：復核日期:.儀器確認: 確認檢測設備已經檢定并在有效期內使用。確認檢測設備運

7、行良好，且滿足檢測需要。設備名稱型號編P檢定后效期至運行檢查智能集菌儀培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱檢查人：檢查日期:復核人：復核日期:物料、培養(yǎng)基和沖洗液的確認確認物料、培養(yǎng)基是否在有效期內使用確認物料、培養(yǎng)基儲存條件、性狀符合要求。品名（試驗物料）規(guī)格批號后效期生產1家集菌培養(yǎng)器品名（已配制培養(yǎng)基）固體批號廠家配制日期批號后效期硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基沙氏葡,萄糖肉湯培養(yǎng)基沙氏葡.萄糖瓊脂培養(yǎng)基%菌氯化鈉溶液% （v/v ）聚山梨酯80的尢菌氯化鈉溶液胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡.萄糖瓊脂培養(yǎng)基預培養(yǎng)及靈敏度實驗檢查確認培養(yǎng)基已經預培養(yǎng)實驗，并預培養(yǎng)合格。確認培養(yǎng)基已經靈敏度試驗檢查，并合

8、格。預培養(yǎng)：胰酪大豆臍液體培養(yǎng)基見XXXXXX硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基見XXXXXX品名批號培養(yǎng)日期培養(yǎng)條件操作人結果判斷胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基H 時 H 時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基H 時 H 時靈敏度實驗：胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基見【硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基見【XXXXXXXXXXXX品名批號培養(yǎng)日期培養(yǎng)條件操作人結果判斷胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基H 時 H 時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基H 時 H 時菌種確認：確認菌種有效期在合格范圍內。名稱代數(shù)編R金黃色葡萄球菌大腸埃布國枯草芽抱桿菌生抱梭菌白色念珠菌黑曲霉6.菌液制備.接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基上，接種生抱梭

9、菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30? 35 C培養(yǎng)18? 2 4小時；取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌斜面菌苔至3mlXXX注射液中混勻，取 1ml至空比濁管與標準比濁管比濁，以至即為100。取100菌液1ml,加入9ml %無菌氯化鈉溶液中，做為10-1稀釋液，依次稀釋至 10-8。取10-510-8稀釋級按平皿計數(shù)法計數(shù)菌落數(shù)，根據(jù) 結果取菌落數(shù)小于 100cfu的稀釋級作為試驗菌液。接種生抱梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30? 35 C培養(yǎng)18? 2 4小時后，取上述培養(yǎng)物1ml,加入9ml %無菌氯化鈉溶液中，做為10-1稀釋級，依次稀釋至10-8o取1

10、05 10-8稀釋級按平皿計數(shù)法計數(shù)菌落數(shù)，根據(jù)結果取菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級作為試20驗菌液。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,? 25 C培養(yǎng)24? 4 8小時，上述培養(yǎng)物用0. 9%無菌氯化鈉溶液制成每lm l含菌數(shù)小于lOOcfu(菌落形成單位)的菌懸液。取上述培養(yǎng)物1ml,加入9ml炕菌氯化鈉溶液中，做為10-1稀釋級，依次稀釋至 108 0取10-510-8稀釋級按平皿計數(shù)法計數(shù)菌落數(shù)，根據(jù)結果取菌 落數(shù)小于100cfu的稀釋級作為試驗菌液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上， 20? 25。C培養(yǎng)5? 7天，加人 3

11、? 5m l含% (ml/ml)聚山梨酯80的0. 9 %無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，用管口帶 有能過濾菌絲的裝置(如薄的無菌棉花或紗布的無菌毛細吸管)吸出抱子懸液至無菌試管內，用含(m l/m l)聚山梨醋80的0. 9 %無菌氯化鈉溶液加入 炕菌氯化鈉溶?中，作為 10-1 稀釋級。依次稀釋至 10-8。取10-410-8稀釋級按平皿計數(shù)法計數(shù)菌落數(shù)，根據(jù)結果取菌 落數(shù)小于100cfu/ml的稀釋級作為試驗菌液。計數(shù)結果取上述各稀釋級各種菌懸液或抱子懸液1ml,分別用融化后45c左右的胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基15ml20ml注皿，各平行測定兩皿。胰酪大豆月東瓊脂培

12、養(yǎng)基在3035c培養(yǎng)48小時，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基在2025c培養(yǎng)72小時，計數(shù)l。表1平皿計數(shù)法，各對照菌菌落計數(shù)結果，單位： cfu/ml菌種金黃色葡萄球菌大腸埃布國枯草芽抱桿菌生抱梭菌白色念珠菌黑曲霉菌稀釋級計數(shù)平均正式試驗樣品信息:產品名稱規(guī)格包裝形式玻瓶火菌條件批號1肩效期至1批號2肩效期至2批號3肩效期至3生產單位試驗步驟：產品試驗：取同一批次的供試品60瓶，分成六組，每組10瓶。共取三個批次，共計 18組。產品試驗：將同一批次的供試品60瓶分六組，每組10瓶。按薄膜過濾法將一組供試液過濾至一只濾筒內，過濾完畢，加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基，然后加入小于100c

13、fu/ml的試驗菌。另一管濾加入同等體積同種培養(yǎng)基，再加入等量試驗菌，作為對照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。各試驗菌同法操作。重復上述操作，做完另五組供試液。重復三批試驗。每個試驗菌每天只需做一次陽性對照。結果判斷：與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢驗法和檢驗條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行

14、方法適用性試驗試驗依據(jù)：按無菌檢查法（中國藥典2015年版四部通則1101）的薄膜過濾法。培養(yǎng)溫度：細菌培養(yǎng)溫度：3035C、真菌培養(yǎng)溫度：2025 c 記錄實驗結果7 .試驗結果與評價：各工作人員應如實記錄各項結果，并及時將數(shù)據(jù)提交驗證小組，驗證小組對其分析匯總后，做出相應客觀評價。評價人：日期：8 .試驗過程中的偏差處理在確認過程中，對于不合格的項目，應進行有針對性的分析，查明原因及時整改，并對該項目重復確認，直至達到方案要求為止。驗證名稱：方案編號：偏離/不符合評價:接收（Yes/No）日期： 評價人：9 .再試驗周期：檢驗程序或條件、產品組分發(fā)生變化時包裝形式及滅菌條件發(fā)生變化時當陽性試驗不成立時；10 .批準由公司確認領導小組負責人根據(jù)具體確認結果對小兒氨基酸注射液無菌檢驗方法的有 效性作出批示。表1產品試驗組、陽