293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染201709271600291

1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法一脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測(cè)外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料。2.實(shí)驗(yàn)原理RlbMOHtl上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過(guò)程。外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度

2、較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、廣州息行虎生化醫(yī)藥有限公司廣州息行虎生化醫(yī)藥公司成立于2017年8月21日,公司成立的緣由是發(fā)起人察覺(jué)到社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展浪潮和人民生活的更新期待需要有一個(gè)敢于挑戰(zhàn)風(fēng)險(xiǎn)、善于克服困難、勇于探索前進(jìn)、勤于變革創(chuàng)新、肯于傳播正義的社會(huì)團(tuán)體站出來(lái)承擔(dān)責(zé)任,公司的宗旨是改變每個(gè)人的生活記憶，讓人類生活更加生態(tài)環(huán)保和更加智能安康.公司的營(yíng)業(yè)范疇涵蓋：生命科學(xué)研究生態(tài)智能化實(shí)晚室創(chuàng)建、化工制造生態(tài)智能化車間創(chuàng)建、醫(yī)療檢測(cè)和治療生態(tài)智能化臨床創(chuàng)建、藥品內(nèi)外用生態(tài)智能化健康創(chuàng)建。公司聯(lián)系手機(jī)來(lái)電一般情況能接聽，特殊情況下未接的當(dāng)天回電，不需回電的請(qǐng)發(fā)短信注明

3、。現(xiàn)階段公司自主研發(fā)的部分產(chǎn)品目錄:產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品名稱產(chǎn)品規(guī)格產(chǎn)品價(jià)格Xxh1RealTimePCR2x預(yù)混液1ml50-70元5ml200-230元Xxh2總RNA提取液20ml70-90元50ml150-180元100ml270-300元Xxh3總DNA提取液100ml100-200元Xxh4總protein提取液強(qiáng)50ml60-70元100ml中50ml50-60元100ml90410元弱50ml40-50元100ml|70-90元Xxh5TaqDNApolymerasePCR試劑盒TaqM200U20-25元Taq酶1000U80-90元Taq®5000U350-380元Xxh

4、6CDNA第一鏈合成試劑盒20次250-280元50次550-600元100次1000-1100元Xxh7總糖提取和檢測(cè)試劑盒500ml100-200元Xxh8黃酮類化合物的提取、分離純化和含量測(cè)定試劑盒500ml100-200元Xxh9紫外流膠照膠儀30cm*30cm*30cm,260nm700-1000元Xxh10慢病毒包裝服務(wù)電議Xxh11腺病毒包裝服務(wù)Xxh12細(xì)胞培養(yǎng)服務(wù)Xxh13植物組織培養(yǎng)服務(wù)Xxh14CRISPR-Cas9敲靶點(diǎn)服務(wù)Xxh15細(xì)菌突變體構(gòu)建服務(wù)Xxh16感受態(tài)DH5Q1支12-15元10支100-130元50支400.450元BL21(

5、DE3)：1支12-15元10支100-130元50支400-450元Stbl33支3040元10支250-300元50支1100-1200元ToplO工支13-15元10支110430元50支480-530元EHA105二支20-23元10支180-220元50支850-950元Xxh17便隱血檢測(cè)家用試紙10片20元50片90元100片170元Xxh18質(zhì)粒構(gòu)建服務(wù)電議Xxh19觀賞熒光植物40cm*40cm*50cm500元而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體

6、與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。CHg。o上圖是本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體中陽(yáng)離子組分的結(jié)構(gòu)的示意圖。本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體是promega公司的TransFast脂質(zhì)體試劑，它是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體的混合物，是對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)中采用的293T細(xì)胞優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑。3 .實(shí)驗(yàn)材料與器材1）材料293T名田胞MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒DMEM培養(yǎng)基鏈霉素/青霉素（雙抗）FCS（小牛血清）PBS（磷酸鹽緩沖溶液）胰酶/EDTA消化液轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)2)器材20ul/200u

7、l/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈廢液缸血球計(jì)數(shù)板渦旋振蕩器恒溫水浴箱臺(tái)式離心機(jī)35mm培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染管15ml離心管觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD4 .實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞傳代(1)試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘(37°C,5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來(lái)為止。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。(5)用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。(6)將

8、培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。2)選擇合適的¥M合比例(1:11:2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。5)將混合液在室溫放置10-15分鐘。6)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。7)加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)8）到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2448小時(shí)。第二次細(xì)胞傳代1)在轉(zhuǎn)