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1、土壤酶活性測(cè)定方法土壤麻酶的測(cè)定方法(苯酚鈉一次氯酸鈉比色法)一、原理腺酶存在于人多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為專(zhuān)性的,它僅能水解尿素,水解的最終產(chǎn)物是氨和二氧化碳、水。土壤腺酶活性,與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含屋、全氮和速效磷含屋呈正相關(guān)。根際土壤腺酶活性較高,中性土壤腺酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤聯(lián)酶活性表征土壤的氮素狀況。土壤中服酶活性的測(cè)定是以腺素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測(cè)定生成的氨量,也可以通過(guò)測(cè)定未水解的尿素量來(lái)求得。本方法以尿素為基質(zhì),根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚一次氯酸鈉作用生成藍(lán)色的靛酚,來(lái)分析腺酶活性。二、試劑1)甲苯2)10%尿素:稱(chēng)取10g尿素,用水溶至l
2、OOmL3)檸檬酸鹽緩沖液(PH6.7):184g檸檬酸和147.5g氫氧化鉀(KOH)溶于蒸懈水。將兩溶液合并,用Imol/LNaOH將PH調(diào)至6.7,用水桶釋定容至1000mlo4)苯酚鈉溶液(1.35mol/L):62.5g苯酚溶于少量乙醇,加2ml甲醇和18.5ml丙酮,用乙醇桶釋至100ml(A液),存于冰箱中:27gNaOH溶于100ml水(B液)。將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將A液、B液各20ml混合,用蒸館水橋釋至lOOmL5)次氯酸鈉溶液:用水桶釋試劑,至活性氯的濃度為0.9%,溶液穩(wěn)定。6)氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱(chēng)取0.4717g硫酸饌?cè)苡谒⑼搬屩?000ml,得到1ml
3、含有O.lmg氮的標(biāo)準(zhǔn)液:再將此液棉釋10倍(吸取10ml標(biāo)準(zhǔn)液定容至100ml)制成氮的工作液(0.01mg/ml)o三、操作步驟稱(chēng)取5g土樣于50ml三角瓶中,加1ml甲苯,振蕩均勻,15min后加lOrnllO%尿素溶液和20mlPH6.7檸檬酸鹽緩沖溶液,搖勻后在37°C恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后過(guò)濾,過(guò)濾后取1ml濾液加入50ml容量瓶中,再加4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液,隨加隨搖勻。20min后顯色,定容。lh內(nèi)在分光光度計(jì)與578nm波長(zhǎng)處比色。(靛酚的藍(lán)色在lh內(nèi)保持穩(wěn)定)。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:在測(cè)定樣品吸光值之前,分別取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮
4、工作液,移于50ml容量瓶中,然后補(bǔ)加蒸館!水至20ml。再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液,隨加隨搖勻。20min后顯色,定容。lh內(nèi)在分光光度計(jì)上于578nm波長(zhǎng)處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意事項(xiàng):1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照,以等體積的蒸飾水代替基質(zhì),其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同,以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照,不加土樣,其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同,以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值,則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計(jì)算:以24小時(shí)后lg土壤中NH3N的亳克數(shù)表示土壤腺
5、酶活性(Ure)。Ure=(a樣品一a無(wú)土一a無(wú)基質(zhì))XVXn/m式中:a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N亳克數(shù);a無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N亳克數(shù);a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N亳克數(shù);V為顯色液體積;n為分取倍數(shù),浸出液體積/吸取濾液體積;m表示烘干土重土壤磷酸酶活性測(cè)定(磷酸苯二鈉比色法)一、原理測(cè)定磷酸酶主要根據(jù)酶促生成的有機(jī)基團(tuán)量或無(wú)機(jī)磷量計(jì)算磷酸酶活性。前一種通常稱(chēng)為有有機(jī)基團(tuán)含量法,是目前較為常用的測(cè)定磷酸酶的方法,后一種稱(chēng)為無(wú)機(jī)磷含屋法。研究證明:磷酸酶有三種最適PH值:45、67、810o因此,測(cè)定酸性、中性和堿性土壤的磷酸酶,要
6、提供相應(yīng)的PH緩沖液才能測(cè)出該土壤的磷酸酶最人活性。測(cè)定磷酸酶常用的PH緩沖體系有乙酸鹽緩沖液(PH5.05.4)、檸檬酸鹽緩沖液(PH7.0)、三疑甲基氨基甲烷緩沖液(PH7.08.5)、和硼酸緩沖液(PH9V0)。磷酸酶測(cè)定時(shí)常用基質(zhì)有磷酸苯二鈉、酚釀磷酸鈉、甘油磷酸鈉、a-或者B-蔡酚磷酸鈉等?,F(xiàn)介紹磷酸苯二鈉比色法。二、試劑1)緩沖液:(1)醋酸鹽緩沖液(PH5.0)O.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L.O.2mol/L醋酸鈉溶液16.4gC2H3O2Na或27gC2H3O2Na.3H2O溶至IL.取14.8mlO.2mol/L醋酸溶液和35.2mlO.2mol/
7、L醋酸鈉溶液桶釋至1L.(2)檸檬酸鹽緩沖液(PH7.0)O.lmol/L檸檬酸溶液19.2gC6H7O8溶至1L.0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液53.63gNa2HPO4.7H2O或者71.7gNa2HPO4.12H2O溶至IL.取6.4mlO.lmol/L檸檬酸溶液加43.6ml0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液橋釋至100ml.(3)硼酸鹽緩沖液(PH9.6)0.05mol/L硼砂溶液19.05g硼砂溶至1L.0.2mol/LNaOH溶液8gNaOH溶至IL.取50ml0.05mol/L硼砂溶液加23ml0.2mol/LNaOH溶液桶釋至200ml.2)0.5%磷酸苯二鈉(用緩沖液配制)3)
8、氯代二漠對(duì)苯醍亞胺試劑:稱(chēng)取0.125g氯代二澳對(duì)苯醍亞胺,用10ml96%乙醇溶解,貯于棕色瓶中,存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。4)甲苯5)0.3%硫酸鋁溶液6)酚標(biāo)準(zhǔn)溶液酚原液:取lg重蒸酚溶于蒸館水中,桶釋至1L,存于棕色瓶中。酚工作液(0.01mg/ml):取10ml酚原液橋釋至1L。三、操作步驟稱(chēng)5g土樣置于200ml三角瓶中,加2.5ml甲苯,輕搖15min后,加入20ml0.5%磷酸苯二鈉(酸性磷酸酶用乙酸鹽緩沖液;中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液;堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液),仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱,37°C下培養(yǎng)24h。然后在培養(yǎng)液加入100ml0.3%硫
9、酸鋁溶液并過(guò)濾。吸取3ml濾液于50ml容量瓶中,然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色。用硼酸緩沖液時(shí),呈現(xiàn)藍(lán)色,于分光光度計(jì)上660nm處比色。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取0、1、3、5、7、9、11.13ml酚工作液,置于50ml容量瓶中,每瓶加入5ml硼酸緩沖液和4滴氯代二澳對(duì)苯匪亞胺試劑,顯色后桶釋至刻度,30min后,在分光光度計(jì)上660nm處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意事項(xiàng):1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照,以等體積的蒸飾水代替基質(zhì),其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同,以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照,不加土樣,其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同,以檢驗(yàn)
10、試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值,則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計(jì)算以24h后遼土壤中釋放岀的酚的質(zhì)量(mg)表示磷酸酶活性。磷酸酶活性二(a樣品一a無(wú)土一a無(wú)基質(zhì))XVXn/m式中:a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚亳克數(shù);a無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚亳克數(shù);a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚亳克數(shù);V為顯色液體積;n為分取倍數(shù),浸出液體積/吸取濾液體積;m表示烘干土重土壤蔗糖酶活性測(cè)定(3,5-二硝基水楊酸比色法)一、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性,如與土壤有機(jī)質(zhì)、氮、磷含量,微生物數(shù)量及土壤呼吸強(qiáng)度有關(guān),一般情況卞,土壤肥力
11、越高,蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān),因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。二、試劑1)酶促反應(yīng)試劑:基質(zhì)8%蔗糖,pH5.5磷酸緩沖液:1/15M磷酸氫二鈉(11.876gNa2HPO42H2O溶于1L蒸餡水中)0.5ml加1/15M磷酸二氫鉀(9.078gKH2PO4溶于1L蒸懈水中)9.5ml即成,甲苯2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(lmg/mL)預(yù)先將分析純葡萄糖置80°C烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱(chēng)取50mg葡萄糖于燒杯中,用蒸館水溶解后,移至50mL容量瓶中,定容,搖勻(冰箱中4°C
12、保存期約一星期)。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)彖,則應(yīng)棄之,重新配制。3)3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS試劑)稱(chēng)0.5g二硝基水楊酸,溶于20ml2mol/LNaOH和50ml水中,再加30g酒石酸鉀鈉,用水橋釋定容至100ml(保存期不過(guò)7天)。三、操作步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別吸1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于試管中,再補(bǔ)加蒸館水至ImL,加DNS試劑3mL混勻,于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min(從試管放入重新沸騰時(shí)算起),取出立即泠水浴中冷卻至室溫,以空白管調(diào)零在波長(zhǎng)540nm處比色,以O(shè)D值為縱坐標(biāo),以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)土壤
13、蔗糖酶測(cè)定稱(chēng)取5g土壤,置于50mL三角瓶中,注入15ml8%蔗糖溶液,5mlpH5.5磷酸緩沖液和5滴甲苯。搖勻混合物后,放入恒溫箱,在37°C下培養(yǎng)24h。到時(shí)取出,迅速過(guò)濾。從中吸取濾液lml,注入50ml容量瓶中,加3mlDNS試劑,并在沸騰的水浴鍋中加熱5min,隨即將容量瓶移至自來(lái)水流2令卻3mino溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色,最后用蒸館水橋釋至50ml,并在分光光度計(jì)上于508nm處進(jìn)行比色。(為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差,每一土樣需做無(wú)基質(zhì)對(duì)照,整個(gè)試驗(yàn)需做無(wú)土壤對(duì)照:如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值,則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣
14、。)四、結(jié)果計(jì)算:蔗糖酶活性以24h,lg干土生成葡萄糖亳克數(shù)表示。蔗糖酶活性二(a樣品一a無(wú)土一a無(wú)基質(zhì))Xn/ma樣品、a無(wú)土、a無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖亳克數(shù);n為分取倍數(shù);m表示烘干土重土壤纖維素酶活性測(cè)定(3,5-二硝基水楊酸比色法)一、原理纖維素是植物殘?bào)w進(jìn)入土壤的碳水化合物的重要組分之一。在纖維素酶作用卞,它的最初水解產(chǎn)物是纖維二糖,在纖二糖酶作用下,纖維二糖分解成葡萄糖。所以,纖維素酶是碳素循環(huán)中的一個(gè)重要的酶。纖維素酶解所生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān),因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。二、
15、試劑1)甲苯2)1%竣甲基纖維素溶液:遼竣甲基纖維素鈉,用50%的乙醇溶至lOOmL3)pH5.5醋酸鹽緩沖液:0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L.0.2mol/L醋酸鈉溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至IL.取Ilml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸鈉溶液混勻即成PH5.5醋酸鹽緩沖液.4)3,5二硝基水楊酸溶液:稱(chēng)1.25g二硝基水楊酸,溶于50ml2mol/LNaOH和125ml水中,再加75g酒石酸鉀鈉,用水桶釋至250ml(保存期不過(guò)7天),5)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(lmg/mL)預(yù)先將分析純葡萄糖置80&
16、#176;C烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱(chēng)取50mg葡萄糖于燒杯中,用蒸館水溶解后,移至50mL容量瓶中,定容,搖勻(冰箱中4°C保存期約一星期)。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)彖,則應(yīng)棄之,重新配制。三、操作步驟葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別吸lmg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于試管中,再補(bǔ)加蒸館水至lmL,加DNS溶液3ml混勻,于沸騰水浴中加熱5min,取出立即泠水浴中冷卻至室溫,以空白管調(diào)零在波長(zhǎng)540nm處比色,以O(shè)D值為縱坐標(biāo),以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱(chēng)10g土壤置于50ml三角瓶中,加入1.5ml甲苯,搖勻后放置15min,再加5ml1
17、%竣甲基纖維素溶液和5mlpH5.5醋酸鹽緩沖液,將三角瓶放在37°C恒溫箱中培養(yǎng)72h°培養(yǎng)結(jié)束后,過(guò)濾并取lml濾液,然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色法比色測(cè)定。(為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差,每一土樣需做無(wú)基質(zhì)對(duì)照,整個(gè)試驗(yàn)需做無(wú)土壤對(duì)照:如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值,則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。)四、結(jié)果計(jì)算纖維素酶活性以72h,lg干土生成葡萄糖亳克數(shù)表示。纖維素酶活性=(a樣品一a無(wú)土一a無(wú)基質(zhì))Xn/ma樣品、a無(wú)土、a無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖亳克數(shù);n為分取倍數(shù);m表示烘干土重過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定(高鐳酸鉀滴定法)一、原理過(guò)氧化氫廣
18、泛存在于生物體和土壤中,是由生物呼吸過(guò)程和有機(jī)物的生物化學(xué)氧化反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生的,這些過(guò)氧化氫對(duì)生物和土壤具有毒害作用。與此同時(shí),在生物體和土壤中存有過(guò)氧化氫酶,能促進(jìn)過(guò)氧化氫分解為水和氧的反應(yīng)(H2O2-H2O+O2),從而降低了過(guò)氧化氫的毒害作用。土壤中過(guò)氧化氫酶的測(cè)定便是根據(jù)土壤(含有過(guò)氧化氫酶)和過(guò)氧化氫作用析出的氧氣體積或過(guò)氧化氫的消耗量,測(cè)定過(guò)氧化氫的分解速度,以此代表過(guò)氧化氫酶的活性。測(cè)定過(guò)氧化氫酶的具體方法比較多,如氣量法:根據(jù)析出的氧氣體積來(lái)計(jì)算過(guò)氧化氫酶的活性;比色法:根據(jù)過(guò)氧化氫與硫酸銅產(chǎn)生黃色或橙黃色絡(luò)合物的量來(lái)表征過(guò)氧化氫酶的活性;滴定法:用高怯酸鉀溶液滴定過(guò)氧化氫分解
19、反應(yīng)剩余過(guò)氧化氫的量,表示出過(guò)氧化氫酶的活性。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)采用高鎰酸鉀滴定法。二、試劑2mol/LH2SO4溶液:量取5.43ml的濃硫酸稲釋至500ml,置于冰箱貯存;0.02mol/L高猛酸鉀溶液:稱(chēng)取1.7g高銹酸鉀,加入400mL水中,緩緩煮沸15min,冷卻后定容至500mL,避光保存,用時(shí)用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定;0.1mol/L草酸溶液:稱(chēng)取優(yōu)級(jí)純H2C2O4-2H2O3.334g/用蒸館水溶解后,定容至250ml;3%的H2O2水溶液:取30%H2O2溶液25ml,定容至250ml,置于冰箱貯存,用時(shí)用0.1mol/LKmnO4溶液標(biāo)定。三、操作步驟分別取5g土壤樣品于具塞三角瓶中(用不加土
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