轉(zhuǎn)錄組相關(guān)實驗技術(shù)

1、- -實驗七 聚合酶鏈反響PCR技術(shù)體外擴增 DNA目的1、學習 PCR 反響的根本原理和實驗技術(shù)。2、了解引物設計的一般要求。原理聚合酶鏈反響 polymerase chain reaction， PCR 是體外酶促合成 DNA 片段的一種技術(shù)。利用 PCR 技術(shù)可在數(shù)小時之內(nèi)大量擴增目的基因或 DNA 片段，以用于基因工程操作。PCR 進展的根本條件：DNA 模板在 RT-PCR 中模板是 RNA ；引物；dNTPdATP、dTTP、dGTP、dCTPTaq DNA 聚合酶PCR 循環(huán)由三個步驟組成：變性 使模板 DNA 解離成單鏈；退火 使引物與模板 DNA 所需擴增序列結(jié)合；延伸 DN

2、A 聚合酶利用 dNTP 合成與模板堿基序列互補的 DNA 鏈。每一個循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一個循環(huán)的模板，通過 30 個左右循環(huán)后，目的片段的擴增可達 106 倍。引物設計：要保證 PCR 反響能準確，特異，有效的對引物 DNA 進展擴增，通常引物設計要遵循以下原那么：引物長度：1525 個核苷酸；CG 含量為 40%60%；Tm 值為 55Tm=4C+G+2A+T計算；引物與非特異配對位點的配對率小于 70%；引物自身配對形成的莖環(huán)構(gòu)造，莖的堿基對小于 3，兩條引物間配對堿基數(shù)小于 5 個。由于影響引物的設計的因素比較多，所以常常利用計算機來輔助設計。本實驗以實驗一中提取的質(zhì)粒 DNA 為模板

3、， 進展 PCR 擴增， 大量得到目的 DNA 片段。試劑與器材一、試劑1、 Taq DNA 聚合酶 2、 10×反響緩沖液含 25mmol MgCl23、 dNTP 4、 引物P1、P25、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml 溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。6、 點樣緩沖液 Loading buffer10× ：0.25%溴酚藍，40%甘油。二、器材1、 PCR 擴增儀 2、 電泳儀 3、 臺式離心機4、 紫外分析儀 5、 恒溫水浴 6、 凝膠成像系統(tǒng)操作步驟一、PCR 擴增1、按下表參加試劑，并小心混勻。模板為實驗一中提取的質(zhì)粒 DNA。試劑 體積

4、50ulddH2O 35ul10 x buffer 5ul10×dNTP 5ulPrimer P1 1ulPrimer P2 1ul模板 2ulTaq 酶2.5U 1.0ul2、設置 PCR 程序： 94 180s 94 45s35 cycles: 55 45s 72 60s 72 600s3、運行 PCR 程序二、PCR 產(chǎn)物鑒定反響完畢后，取 20ul PCR 產(chǎn)物進展 1.2%瓊脂糖電泳分析。實驗八 RNA 提取與純化一、目的掌握 RNA 提取的根本技術(shù)，了解 RNA 提取過程中的各種本卷須知。二、原理RNA 提取是分子生物學實驗中難度較大的實驗技術(shù)。RNA 提取和 DNA 提

5、取有類似的地方， 因為它們都是核酸， 都具有較好的水溶性。 提取 RNA首先破碎細胞，然后用提取液將 RNA 溶出，反復抽提去除蛋白質(zhì)，參加乙醇沉淀 RNA，將 RNA沉淀溶解備用。那么如何區(qū)分 DNA 和 RNA 分開？DNA 和 RNA 的溶解性不同，DNA 在 1M 的鹽溶液中具有最好的溶解度，而 RNA 在 0.14M 的鹽溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它們的溶解性將它們進展區(qū)分。另外，RNA 的分子量一般比較小，而 DNA 分子很大且和蛋白結(jié)合成復合體，所以 DNA 更容易隨蛋白沉淀，而 RNA 具有較好的溶解性。RNA 提取的另一個關(guān)鍵問題就是如何抑制或去除環(huán)境中 RNA 酶

6、。所有的玻璃、陶瓷和鐵器具在 180×6 h 以上。所有的塑料器皿用 0.1的 DEPC 水 37過夜浸泡，然后濕熱滅菌80烘干備用。配制溶液所需的水也要用 DEPC 處理過的水，而配置 Tris 相關(guān)的緩沖液時Tris 會與 DEPC 發(fā)生反響，應防止用 DEPC 處理。另外操作過程中應戴手套。判斷 RNA 的質(zhì)量主要有兩個標準，一是純度，二是完整性是否被降解 。RNA 的純度可以通過分光光度計進展測定的 A260A280 值來判斷。RNA 的完整性主要通過電泳分析來說明，未降解的總 RNA 電泳時在凝膠中會出現(xiàn) 18S 和 28SrRNA 對應的條帶如果有 DNA 污染那么在 R

7、NA 后會發(fā)現(xiàn)基因組 DNA 對應的條帶 。RNA 電泳系統(tǒng)也要嚴格對 RNA 酶進展處理。如果用普通瓊脂糖凝膠電泳，那么用盡量減少電泳時間。三、試劑與器材一試劑1、暗培養(yǎng) 7 天的小麥苗，用前光照誘導 3 h2、DEPC3、DEPC 處理的 ddH2O4、RNA 提取液： 每 1000 毫升中含有Tris 6.06 克 (最終濃度為 50 mM )LiCl 6.03 克 (LiCl -H2O 9.06 克) (最終濃度為 150 mM )EDTA0.5 M 10 毫升 (最終濃度為 5 mM )SDS 50 克 (最終濃度為 5 % )5、8 M Li Cl：33.92 克 Li Cl 溶于

8、 100 ml DEPC 處理的 ddH2O6、 水飽和酚7、 氯仿8、 0.5M NaCl9、 溴乙啶(EB)： 10mg/ml 溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。10、點樣緩沖液 Loading buffer10× ：0.25%溴酚藍，40%甘油。三、器材1、 分光光度計 2、 電泳儀 3、 臺式離心機4、 手提式紫外監(jiān)測儀 5、 恒溫水浴 6、 凝膠成像系統(tǒng)四、操作步驟1、取植物葉片 1-3 克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分裝，小量提取試劑量可減至 110)2、液氮揮發(fā)完之前，倒入含有 10 毫升 RNA 提取液的離心管中，迅速反復倒置混勻，直至看不

9、見任何團狀物為止。3、 立即參加 10 毫升的等體積 酸性 酚/氯仿， 劇烈 ！ 反復倒置混勻 5 至 10min如在震蕩器上震蕩，要確保混勻而不能僅僅是振動！ 。4、13000g×5min，吸管取上清注意防止吸取界面上的蛋白 。5、重復步驟 3 和 4，三次左右注意觀察界面上白色物質(zhì) 。6、取上清，參加等體積的氯仿，反復倒置混勻 2-5min。7、13000g×5min。8、取上清，參加 1/3 體積 8 M 的 LiCl 即 8 M LiCl 應占最后體積的 25% ， 沉淀 RNA，4過夜。9、離心 13000g × 10 min。10、 棄上清,保存沉淀

10、此時應把 RNA 沉淀轉(zhuǎn)入 Eppendorf 管中， 以便于操作 , 參加 70%無水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液 0.5 毫升洗滌沉淀數(shù)分鐘和緩地反復倒置混勻 ，離心 13000g × 2 min 。重復洗滌沉淀數(shù)次。11、用 70%乙醇再洗滌 2 次沉淀，去掉鹽離子。12、用槍頭吸去殘留的液體，真空枯燥 2min。13、參加 200 ul DEPC 處理過的水溶解 RNA。14、取用 5 ul 電泳檢測 RNA 完整性, 用 TEB 緩沖液, 200V× 20-30min。15、取 5 ul 稀釋 40 倍測定 RNA 純度和濃度，A260 nm /A

11、280 nm 應在 2.0 左右。16、將 RNA 分裝,放在-70長期保存?zhèn)溆? 輔助方案：試劑盒提取法Trizol一試劑：1.Ttizol Reagent 2. 氯仿 3. 異丙醇 4. 70%無水乙醇5.DEPC二器材：1、 研缽 2、 離心機三實驗步驟1、 稱取小麥葉片 50-100mg,于研缽中加液氮研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移到 1.5ml 離心管中。2、 參加 1 ml Trizol Reagent，1530×5min。3、 參加 0.2ml 氯仿，劇烈振蕩 15 sec，1530×3min。4、 冷凍離心 12 000 rpm×15min。5、 將上清液轉(zhuǎn)

12、移到另一個離心管中，加 0.5ml 預冷異丙醇,混勻 ，-20放置20min。6、 冷凍離心 12 000 rpm×10min。7、 參加 0.5ml 70% 乙醇洗 RNA 沉淀，懸浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。8、 參加 30 ul DEPC 處理過的 ddH2O 溶解 RNA。實驗九 RT-PCR 擴增目的基因 cDNA目的學習從細胞或組織的 RNA 中用逆轉(zhuǎn)錄 PCR 擴增目的基因的技術(shù)及操作。原理普通 PCR 方法可以以 DNA 為模板擴增基因， 但真核生物的基因組中通常分為可轉(zhuǎn)為 mRNA的外顯子和不轉(zhuǎn)錄的成 mRNA 的內(nèi)含子，所以從染色體 DNA

13、 用 PCR 方法擴增出的基因是內(nèi)含子和外顯子相間排列的 DNA 分子，不能用于基因工程的直接表達。如果用人工的方法把內(nèi)含子去除，是極其煩瑣費力的事。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒依賴于 RNA 的 DNA 逆轉(zhuǎn)錄合成酶，在反義引物或 oligod T的引導下合成 mRNA 互補的 DNAplementalDNA ，再按普通的 PCR 的方法用兩條引物以 cDNA 為模板，擴增出不含內(nèi)含子的可編碼完整蛋白的基因。這一 DNA 的 5，和 3，端經(jīng)改造可直接用于基因工程的表達，因此逆轉(zhuǎn)錄PCR 成為了目前獲取目的基因的一條重要途徑。試劑與器材一、試劑1、 RNA 模板 2、 cDNA 引物 3、

14、 反轉(zhuǎn)錄緩沖液4、 dNTP 5、 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶6、 RNA 抑制劑RNasin 7、 Taq 酶8、 10×PCR 緩沖溶液 9、 引物P1、P2二、器材1、PCR 擴增儀 2、電泳儀 3、臺式離心機 4、恒溫水浴5、紫外分析儀 6、微量移液器操作步驟一、RNA 的反轉(zhuǎn)錄1、在小管中依次參加5 ul RNA6 ul DEPC H2O混合后,65×5 min(破壞二級構(gòu)造).2、 置于冰浴 5 min.3、在管中依次參加: (反響體系為 20 ul)RT buffer ( 5×) 4 ulRNasin 0.5 uldNTP ( 10mM) 2 ulOligo T17AGC 50-100 uM 1 ulAMV 反轉(zhuǎn)錄酶 1 ul置于 42× 1 h。4、70× 5 min使酶失活，可省略 。5、參加 100ul ddH2O (從總 RNA 開場制備)或 1000 ulddH2O從 mRNA 開場制備 。6、置于-20保存?zhèn)溆?二、