構(gòu)建點(diǎn)突變質(zhì)粒步驟

1、基因定點(diǎn)突變一、定點(diǎn)突變的目的把目的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。二、定點(diǎn)突變的原理通過設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過來了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。三、引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)的一般原則不再重復(fù)。突變引物設(shè)計(jì)的特殊原則：(1) 通常引物長度為2545bp，我們建議引物長度為3035bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12bp。若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，因?yàn)橐镏辽僖?1-12個(gè)bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭

2、上，所以兩邊最好各設(shè)至少12個(gè)bp,并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。(2) 如果設(shè)定的引物長度為30bp，接下來需要計(jì)算引物的Tm值，看是否達(dá)到78°C(GC含量應(yīng)大于40%)。(3) 如果Tm值低于78C，則適當(dāng)改變引物的長度以使其Tm值達(dá)到78C(GC含量應(yīng)大于40%)。(4) 設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)確保突變點(diǎn)在引物的中央位置。(5) 最好使用經(jīng)過純化的引物。Tm值計(jì)算公式：Tm=041x(%ofGC)675/L+81.5注：L：引物堿基數(shù)；%ofGC：引物GC含量。四、引物設(shè)計(jì)實(shí)例以GCGACG為例：5'-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG3

3、-'(1)首先設(shè)計(jì)30bp長的上下游引物，并將A(T)設(shè)計(jì)在引物的中央位置。Primer#1:5'-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3'Primer#2:5'-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3'(2)引物GC含量為40%,L為30,將這兩個(gè)數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.41x40-675/30+81.5)。通過計(jì)算可以看出其Tm低于78°C,這樣的引物是不合適的，所以必須調(diào)整引物長度。(3)重新調(diào)整引物長度。Primer#1:5'-CCTCCTTCA

4、GTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3'Primer#2:5'-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3'在引物兩端加5mer(斜體下劃線處)，這樣引物的GC含量為45.7%,L值為35,將這兩個(gè)數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm為80.952(Tm=0.41x47.5-675/35+81.5),這樣的引物就可以用于突變實(shí)驗(yàn)了。五、突變所用聚合酶及Buffer引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平時(shí)的，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來，延伸長度達(dá)到幾個(gè)K,所以要用那些GCbuf

5、fer或擴(kuò)增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。除了使用基因定點(diǎn)突變試劑盒，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價(jià)格昂貴?？梢允褂酶弑Ｕ娴木酆厦?，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTMHSDNApolymerase。六、如何去掉PCR產(chǎn)物最簡單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株)，而PCR產(chǎn)物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板(質(zhì)粒)而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物，從而

6、去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。DpnI處理的時(shí)間最好長一點(diǎn)，最少一個(gè)小時(shí)吧，最好能有兩三個(gè)小時(shí)，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛簦呐轮挥心敲匆稽c(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長出來，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。七、如何拿到質(zhì)粒直接把通過DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，然后再篩選出陽性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測序，驗(yàn)證突變結(jié)果。八、圖示PCRzmplHindNott/nndonindStep1.InducingmutatlorqPCR啤-UsingMiutd-dircelI5tsp2.SsldctionH龍1用Mutarvm$fpJ-.TrannnnqtirHUsingeem

7、patentecjNickrecovering；九、定點(diǎn)突變操作步驟A誘導(dǎo)突變基因（PCR反應(yīng)）以待突變的質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)的引物及Muta-direct酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，誘導(dǎo)目的基因突變。1. 設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物。注參考引物設(shè)計(jì)指導(dǎo)2.準(zhǔn)備模板質(zhì)粒DNA注用dam+型菌株（例如DH5a菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數(shù)低的現(xiàn)象，但是對突變效率沒有影響。提取質(zhì)粒DNA時(shí)我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純試劑盒。3.選項(xiàng)對照反應(yīng)體系（50卩1反應(yīng)體系）lOxReactionBuffer5g1pUC18controlplasmid(10ng/y1,total20ng)2g1Controlp

8、rimermix(20pmo1/p1)2g1dNTPmixture(each2.5mM)2g1dHQ381Muta-directEnzymelpl4.樣品反應(yīng)體系（50卩1反應(yīng)體系）lOxReactionBuffer5y1Sampleplasmid(10ng/pl,total20ng)21Sampleprimer(F)(lOpmol/yl)lylSampleprimer(R)(10pmo1/y1)lyldNTPmixture(each2.5mM)2yldH2O38ylMuta-directEnzyme1g15.PCR反應(yīng)條件注按如下參數(shù)設(shè)置PCR擴(kuò)增條件。CyclesTemperatureRe

9、actionTime1cycle95C30sec15cycle95C30sec55C1min72C1minperplasmidKb6.PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后冰育5分鐘，然后置于室溫(避免反復(fù)凍融)。注按下列提供的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，控制PCR循環(huán)數(shù)。注意當(dāng)突變點(diǎn)位點(diǎn)超過4個(gè)時(shí)會(huì)發(fā)生突變率降低的現(xiàn)象。MutationCycles12Nucleotide15cycles3Nucleotides18cyclesB突變質(zhì)粒選擇PCR反應(yīng)結(jié)束后使用MutazymeT酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒DNA。1. 準(zhǔn)備PCR反應(yīng)產(chǎn)物2. 加入1卩1(lOU/yl)MutazymeTM酶37°C溫育1小時(shí)。注當(dāng)質(zhì)粒DNA用量過多時(shí)Mutazyme酶可能發(fā)生與樣品反應(yīng)不完全的現(xiàn)象。因此我們建議為了保證突變率請嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。如果突變率低，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間或增加Mutazyme酶用量。C轉(zhuǎn)化反應(yīng)完畢后在質(zhì)粒DNA上會(huì)產(chǎn)