限制性核酸內切酶的命名和類型學習教案

1、會計學1第一頁，共74頁。核酸酶：通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而(cng r)導致核酸分子多核酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶?；靖拍罴捌渖锘靖拍罴捌渖?shngw)功能功能特異水解斷裂特異水解斷裂(dun li)RNA分子，核糖核酸酶（分子，核糖核酸酶（RNase）特異水解斷裂特異水解斷裂(dun li)DNA分子，脫氧核糖核酸酶（分子，脫氧核糖核酸酶（DNase）非專一性酶，底物或者為非專一性酶，底物或者為DNA或者為或者為RNA從核酸分子末端逐個降解核苷酸，叫從核酸分子末端逐個降解核苷酸，叫外切核酸酶外切核酸酶從核酸分子內部切割磷酸二酯鍵使之斷裂形成小片段，叫從核酸分

2、子內部切割磷酸二酯鍵使之斷裂形成小片段，叫內切核酸酶內切核酸酶 按水解斷裂核酸分子的方式按水解斷裂核酸分子的方式: 根據作用的核酸底物不同根據作用的核酸底物不同:第1頁/共73頁第二頁，共74頁?；蚬こ痰牟僮?，是在分子水平上的操作基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶，是依賴一些酶( (如限制性核酸內切酶，連接如限制性核酸內切酶，連接酶，酶，DNADNA聚合酶等聚合酶等) )作為作為(zuwi)(zuwi)工具對基因進工具對基因進行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為酶稱之為“工具酶工具酶”。 工具工具(gngj)(gngj)酶酶

3、 第2頁/共73頁第三頁，共74頁。1 1、限制、限制- -修飾系統修飾系統2 2、限制性核酸內切酶的命名和類型、限制性核酸內切酶的命名和類型3 3、IIII型限制性核酸內切酶的基本特性型限制性核酸內切酶的基本特性4 4、影響限制性內切酶活性的因素、影響限制性內切酶活性的因素5 5、限制性內切酶對、限制性內切酶對DNADNA的消化的消化(xiohu)(xiohu)作用作用 第一節(jié)第一節(jié) 限制性核酸限制性核酸(h sun)(h sun)內切酶內切酶第3頁/共73頁第四頁，共74頁。 限制性內切核酸酶限制性內切核酸酶(Restriction (Restriction endonuclease)en

4、donuclease)是一類能夠識別是一類能夠識別(shbi)(shbi)雙鏈雙鏈DNADNA分子中的某種特定核苷酸序列分子中的某種特定核苷酸序列(4-8bp)(4-8bp)，并由此處切割并由此處切割DNADNA雙鏈的核酸內切酶。雙鏈的核酸內切酶。 限制性核酸限制性核酸(h sun)(h sun)內切酶概念內切酶概念第4頁/共73頁第五頁，共74頁。2. 2. 性質性質(x(xnngzgzhh) )內切酶內切酶主要主要(zhyo)(zhyo)來源于原核生來源于原核生物物即在核酸分子鏈的內部即在核酸分子鏈的內部(nib)(nib)制造切口的酶。制造切口的酶。形成形成5 5-P-P和和3 3-OH

5、-OH末端末端 自我保護作用自我保護作用3. 3. 功能功能細菌的限制和修飾系統（細菌的限制和修飾系統（R/MR/M體系）體系）任何一種生物體都存在防御外界物質進入的機制任何一種生物體都存在防御外界物質進入的機制第5頁/共73頁第六頁，共74頁。大腸桿菌大腸桿菌(d chn (d chn n jn)Bn jn)B大腸桿菌大腸桿菌(d chn (d chn n jn)Kn jn)Kphage (B)phage (B)EOP=10-4EOP=10-4（限制（限制(xinzh)(xinzh)作用）作用）EOP=10EOP=10-4-4（限制作用限制作用）EOP=1EOP=1（修飾作用修飾作用）修飾的

6、修飾的phage (K)phage (K) 人們發(fā)現侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂人們發(fā)現侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的的寄主控制的限制與修飾現象限制與修飾現象簡稱（簡稱（R/MR/M體系體系）。）。 細菌的細菌的R/MR/M體系類似于免體系類似于免疫系統，能辨別自身的疫系統，能辨別自身的DNADNA與外來的與外來的DNADNA，并能使后者降解掉。，并能使后者降解掉。 寄主的限制與修飾現象寄主的限制與修飾現象E.O.P E.O.P 成斑率成斑率efficiency of platingefficiency of platingEOP=1EOP

7、=1第6頁/共73頁第七頁，共74頁。 限制性內切酶將侵入限制性內切酶將侵入(qnr)(qnr)細菌體內的外源細菌體內的外源DNADNA進行分解，切成小片斷。進行分解，切成小片斷。 限制作用限制作用: :實際就是限制性內切酶降解外源實際就是限制性內切酶降解外源DNADNA，維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護，維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護(boh)(boh)機制。機制。第7頁/共73頁第八頁，共74頁。 細菌自身細菌自身(zshn)(zshn)的的DNADNA堿基被甲基化酶甲基化修飾堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身所保護，不能被自身(zshn)(zshn)的限制性內切酶識別切割的限制性內切酶識別切割。

8、Dam Dam甲基化酶甲基化酶( (DNA Adenine MethylaseDNA Adenine Methylase) )GATC GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6N6位置位置(wi zhi)(wi zhi)引入甲引入甲基基 Dcm Dcm甲基化酶甲基化酶( (DNA cytosine MethylaseDNA cytosine Methylase) )C CC CAGGAGG或或C CC CTGGTGG序列在第二個序列在第二個C C上上C C5 5位置上引位置上引入甲基入甲基 修飾作用修飾作用: :宿主細胞通過甲基化作用達到識別自宿主細胞通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。

9、身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。第8頁/共73頁第九頁，共74頁。第9頁/共73頁第十頁，共74頁。 hsd R: hsd R: 編碼編碼(bin m)(bin m)限制性限制性內切酶內切酶 hsd M: hsd M: 編碼編碼(bin m)(bin m)限制性限制性甲基化酶甲基化酶 hsd hsd S: S: 編碼限制性內切酶和甲基化酶的協同表達編碼限制性內切酶和甲基化酶的協同表達這類酶能識別這類酶能識別DNADNA分子上的特定位點，并將雙鏈分子上的特定位點，并將雙鏈DNADNA切斷切斷這類酶使這類酶使DNADNA分子特定位點上的堿基甲基化，即起分子特定位點上的堿基甲基化，即起修飾修飾 DN

10、A DNA的作用。的作用。作用是協同上述兩種酶識別特殊的作用位點。作用是協同上述兩種酶識別特殊的作用位點。第10頁/共73頁第十一頁，共74頁。2.2.入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細胞入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細胞 K K株，株，B B株株 中，中， 1 1）宿主細胞甲基化酶，將染色體）宿主細胞甲基化酶，將染色體DNADNA和噬菌體和噬菌體DNADNA特異性保護特異性保護. . 2 2）封閉自身所產生）封閉自身所產生(chnshng)(chnshng)的核酸內切酶的的核酸內切酶的識別位點識別位點-（修飾）（修飾）1.1.大腸桿菌宿主細胞大腸桿菌宿主細胞 K K株，株，B B 株株 ，有各

11、自的限制和修飾，有各自的限制和修飾(xish)(xish)系統。系統。限制和修飾限制和修飾(xish)(xish)作用的分作用的分子機制子機制第11頁/共73頁第十二頁，共74頁。3. 3. 外來外來(wili)DNA(wili)DNA入侵時，遭到宿主限制性內切酶的特異入侵時，遭到宿主限制性內切酶的特異降解降解 - -（限制）（限制）4. 4. 由于降解不完全，外來少數由于降解不完全，外來少數DNADNA分子在宿主細胞分子在宿主細胞(xbo)(xbo)中繁殖過程中被宿主細胞中繁殖過程中被宿主細胞(xbo)(xbo)的甲基化酶修飾，雖的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。然是外來卻不被降解。 5

12、 5接受了新宿主菌甲基化修飾的同時，喪失了原宿主菌修接受了新宿主菌甲基化修飾的同時，喪失了原宿主菌修飾的標記，喪失在原宿主細胞飾的標記，喪失在原宿主細胞(xbo)(xbo)中的存活能力。中的存活能力?；蚬こ讨?，應采用缺少基因工程中，應采用缺少(qusho)限制作用的菌株作為受體。限制作用的菌株作為受體。第12頁/共73頁第十三頁，共74頁。1 1、限制、限制- -修飾系統修飾系統2 2、限制性核酸內切酶的命名和類型、限制性核酸內切酶的命名和類型3 3、IIII型限制性核酸內切酶的基本型限制性核酸內切酶的基本(jbn)(jbn)特性特性4 4、影響限制性內切酶活性的因素、影響限制性內切酶活性的

13、因素5 5、限制性內切酶對、限制性內切酶對DNADNA的消化作用的消化作用 第一節(jié)第一節(jié) 限制性核酸限制性核酸(h sun)(h sun)內切酶內切酶第13頁/共73頁第十四頁，共74頁。19731973年年H.O SmithH.O Smith和和D. NathansD. Nathans提議的命名提議的命名(mng (mng mng)mng)系統，命名系統，命名(mng mng)(mng mng)原則如下：原則如下：1.1. 用屬名的第一個字母和種名的頭兩個用屬名的第一個字母和種名的頭兩個(lin (lin )字母組成字母組成3 3個字母的略語表示寄主菌的物種個字母的略語表示寄主菌的物種名，組

14、成酶的基本名稱。名，組成酶的基本名稱。大腸桿菌（大腸桿菌（E Escherichia scherichia cocolili）用）用EcoEco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（H Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae）用）用HinHin表示表示第14頁/共73頁第十五頁，共74頁。2. 2. 如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（一個字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質粒上，則用一個大寫字母表示病毒）或質粒上，則用一個

15、大寫字母表示(biosh)(biosh)此染此染色體外遺傳成分。色體外遺傳成分。如如 HinHind d ：d d菌株菌株 Eco EcoR R I I ：抗藥性：抗藥性R R質粒質粒 第15頁/共73頁第十六頁，共74頁。3. 3. 如果一種特殊的菌株內有幾種如果一種特殊的菌株內有幾種(j zhn)(j zhn)不同不同的限制與修復系統，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現的限制與修復系統，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現某種酶的先后次序。某種酶的先后次序。 如如Hind Hind ：d d菌株中發(fā)現的第二個酶菌株中發(fā)現的第二個酶4. 4. 所有的限制酶，除以上名稱外還要冠以系統所有的限制酶，除以上名稱外還

16、要冠以系統(xtng)(xtng)名稱。限制性內切酶的系統名稱。限制性內切酶的系統(xtng)(xtng)命名為命名為R R，甲基化酶為，甲基化酶為M M。如如 R.Hind R.Hind 表示限制性內切酶表示限制性內切酶 M.Hind M.Hind 表示相應表示相應(xingyng)(xingyng)的甲基化酶的甲基化酶實際應用中，實際應用中，R R常被省略。常被省略。第16頁/共73頁第十七頁，共74頁。 EcoR IEscherichia屬名屬名Coli種名種名Ry13株系株系編號編號(bin ho) 若種名頭若種名頭(mn tu)2(mn tu)2個字母相同則其中一個可用種名的第個字母

17、相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。一和第三個字母。第17頁/共73頁第十八頁，共74頁。 目前鑒定出四種不同類型的限制性內切酶目前鑒定出四種不同類型的限制性內切酶。據限制性核酸內切酶的識別。據限制性核酸內切酶的識別(shbi)(shbi)切割切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為分為、型。型。 第18頁/共73頁第十九頁，共74頁。二、限制性內切酶的類型二、限制性內切酶的類型(lixng) 據限制性核酸內切酶的識別切割特性、催化條件及據限制性核酸內切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為是否具有修飾酶活性，可分為、型。型。

18、主要特性主要特性型型型型型型限制修飾限制修飾 蛋白結構蛋白結構 輔助因子輔助因子 識別序列識別序列 切割位點切割位點雙功能（具甲基化）雙功能（具甲基化） 異源三聚體異源三聚體 ATP Mg2+ SAM 距識別序列距識別序列1kb處處 隨機性切割隨機性切割單一功能單一功能 同源二聚體同源二聚體 Mg2+ 4-6bp回文序列回文序列 識別序列內或附近識別序列內或附近特異切割特異切割雙功能（具甲基化）雙功能（具甲基化） 異源二聚體異源二聚體 ATP Mg2+ 距識別序列下游距識別序列下游24-26bp處處 隨機性切割隨機性切割基因工程(jyn gngchng)中使用注：注： SAM為為S腺苷甲硫氨酸

19、腺苷甲硫氨酸第19頁/共73頁第二十頁，共74頁。首先由首先由M.MeselsonM.Meselson和和R.YuanR.Yuan在在19681968年從大腸桿菌年從大腸桿菌(d chn n jn) B(d chn n jn) B株和株和 K K株分離的。株分離的。（1 1）識別）識別(shbi)(shbi)位點位點序列序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC如如 EcoEcoB B和和 EcoEcoK K。未甲基化修飾的特異序列。未甲基化修飾的特異序列。N：表示任何一種核：表示任何一種核苷酸苷酸第20頁/共73頁第二十一頁，共74頁。需需ATP、Mg2+和和S

20、AM（S-腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）（3）輔助因子輔助因子在距離特異性識別在距離特異性識別(shbi)位點約位點約10001500 bp處隨機切開一條單鏈，不產生特異片斷，應用不處隨機切開一條單鏈，不產生特異片斷，應用不大大Recognize sitecut1-1.5kb第21頁/共73頁第二十二頁，共74頁。 首先由首先由H.O. SmithH.O. Smith和和K.W. WilcoxK.W. Wilcox在在19701970年從流感年從流感嗜血菌中分離出來。嗜血菌中分離出來。 分離的第一個酶是分離的第一個酶是Hind Hind 未甲基化修飾的雙鏈未甲基化修飾的雙鏈DNADNA上的特殊靶

21、序列（多數上的特殊靶序列（多數(dush)(dush)是回文序列），與是回文序列），與DNADNA的來源無關。的來源無關。 A B C C B A A B C C B AA B N B AA B N B A 或或型限制性內切酶的基本型限制性內切酶的基本(jbn)(jbn)特性特性 （1 1）識別）識別(shbi)(shbi)位點位點序列序列第22頁/共73頁第二十三頁，共74頁。 識別位點處。 切開雙鏈DNA。形成(xngchng)粘性末端（sticky end）或平齊末端（blunt end）。如： EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3

22、3-GACGTC-5 產生粘性末端產生粘性末端 EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 產生平齊末端產生平齊末端 （2）切割）切割(qig)位位點點第23頁/共73頁第二十四頁，共74頁。A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A ABCDDNADNAHindHind切割(qig)位點核酸(h sun)內切酶Hind對雙鏈DNA分子的切割作用第24頁/共73頁第二十五頁，共74頁。 在完全肯定的位點切割在完全肯定的位點切割DNA(DNA(識別位點下游識別位點下游24-26bp)24-26bp)，但不，但不是是(b shi)(b

23、shi)對稱的回文順序，且在識別序列旁邊一定數目核對稱的回文順序，且在識別序列旁邊一定數目核苷酸的位置切割。苷酸的位置切割。 反應需要反應需要ATPATP、 Mg2+ Mg2+和和SAMSAM（S-S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作在基因工程操作(cozu)中用途不大。中用途不大。 型限制性內切酶的基本型限制性內切酶的基本(jbn)(jbn)特性特性 第25頁/共73頁第二十六頁，共74頁。 IV型限制性內切酶型限制性內切酶 新鑒定出來的一類限制新鑒定出來的一類限制(xinzh)酶。只切酶。只切割堿基已被甲基化、羥甲基化、葡

24、糖羥甲割堿基已被甲基化、羥甲基化、葡糖羥甲基化的基化的DNA序列。序列。 除除EcoKMcrBC外，識別外，識別(shbi)序列尚未確序列尚未確定，目前尚無應用。定，目前尚無應用。第26頁/共73頁第二十七頁，共74頁。核酸限制性內切酶的類型及主要核酸限制性內切酶的類型及主要(zhyo)特性特性特性特性I型內切酶型內切酶II型內切酶型內切酶III型內切酶型內切酶內切酶的內切酶的蛋白結構蛋白結構3種不同的亞基種不同的亞基單一成分單一成分2種不同的種不同的亞基亞基限制作用限制作用所需要的所需要的輔助因子輔助因子ATP、 Mg2+和和SAMMg2+ ATP、 Mg2+和和SAM寄主特異寄主特異性位點

25、識性位點識別序列別序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC回文序列，回文序列，旋轉對稱旋轉對稱 （IIs型除外）型除外）EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG第27頁/共73頁第二十八頁，共74頁。切割位點切割位點在距離識別位在距離識別位點至少點至少1000 bp外隨機切外隨機切開一條單鏈。開一條單鏈。位于寄主位于寄主特異性位特異性位點或其附點或其附近近識別位點識別位點3端端24-26bp處處甲基化作用的位甲基化作用的位點點寄主特異性位寄主特異性位點點寄主特異寄主特異性位點性位點寄主特異性寄主特異性位點位點識別未甲基化的識別未甲基化的序列進行切割

26、序列進行切割能能能能能能序列特異的切割序列特異的切割 不是不是是是不是不是基因工程中的用基因工程中的用途途無用無用十分有用十分有用用處不大用處不大第28頁/共73頁第二十九頁，共74頁。1 1、限制、限制- -修飾系統修飾系統2 2、限制性核酸內切酶的命名和類型、限制性核酸內切酶的命名和類型3 3、IIII型限制性核酸內切酶的基本特性型限制性核酸內切酶的基本特性4 4、影響、影響(yngxing)(yngxing)限制性內切酶活性的因素限制性內切酶活性的因素5 5、限制性內切酶對、限制性內切酶對DNADNA的消化作用的消化作用 第一節(jié)第一節(jié) 限制性核酸限制性核酸(h (h sun)sun)內切

27、酶內切酶第29頁/共73頁第三十頁，共74頁。識別識別(shbi)(shbi)序列序列 識別識別(shbi)(shbi)順序的堿基數一般為順序的堿基數一般為4-6 bp4-6 bp，少數識別，少數識別(shbi)(shbi)更長，多數識別更長，多數識別(shbi)(shbi)位點具有旋轉對稱性（位點具有旋轉對稱性（回文結構），少數的識別回文結構），少數的識別(shbi)(shbi)位點在切割位點之外，位點在切割位點之外，具旋轉對稱性。具旋轉對稱性。 4bp Hpa C CGG Hae GG CC 5bpAva G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamHG GATTC SmaCCC G

28、GG11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstX CCANNNNN NTGC 第30頁/共73頁第三十一頁，共74頁。1 1、以某一對核苷酸為中軸，左右同數目的核苷酸彼此呈、以某一對核苷酸為中軸，左右同數目的核苷酸彼此呈堿基互補堿基互補(h b)(h b)。2 2、這兩股、這兩股DNADNA鏈若按同方向閱讀（如鏈若按同方向閱讀（如5 35 3），其核），其核苷酸順序相同。苷酸順序相同。 5GAA TTC3 3CTT AAG5特點特點(tdin)有二：有二：回文序列：反向重復序列，雙鏈回文序列：反向重復序列，雙鏈DNADNA中含有兩個中含有兩個(lin )(lin )結構相同，

29、方向相反結構相同，方向相反的序列的序列 5GTNAC3 3CANTG5第31頁/共73頁第三十二頁，共74頁。限制性核酸內切酶切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3 位酯鍵產生兩個末端，末端結構(jigu)是5-P和3-OH，產生3種不同的切口。 切割切割(qig)(qig)方式方式 第32頁/共73頁第三十三頁，共74頁。與與IIII型核酸內切酶有關型核酸內切酶有關(yugun)(yugun)的幾個概的幾個概念念粘性末端粘性末端(cohesive ends):(cohesive ends):因酶切位點在兩條因酶切位點在兩條DNADNA單單鏈上不同鏈上不同(b tn)(b tn)（對稱）酶切后形成

30、（對稱）酶切后形成的具有互補堿基的單鏈末端結構，酶切產的具有互補堿基的單鏈末端結構，酶切產生的兩個粘性末端很容易通過互補堿基的生的兩個粘性末端很容易通過互補堿基的配對而重新連接起來。配對而重新連接起來。平平 末末 端端(Blunt end): (Blunt end): 因酶切位點在兩條因酶切位點在兩條DNADNA單鏈單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結構，上相同，酶切后形成的平齊的末端結構，這種末端不易重新連接起來。這種末端不易重新連接起來。第33頁/共73頁第三十四頁，共74頁。1. 51. 5突出突出(t (t ch)ch)的末端的末端EcoRI等產生的5粘性末端5G-C-T-G-A-A-

31、T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 EcoRI 37 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-AP OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5第34頁/共73頁第三十五頁，共74頁。2. 32. 3突出突出(t (t ch)ch)的末端的末端PstI等產生的3粘性末端 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5 PstI 37 5C-T-G-C-A-OH P-G 3 3G- P OH

32、 -A-C-G-T-C 5 退火 4-7 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5第35頁/共73頁第三十六頁，共74頁。i i）不同）不同(b tn)(b tn)的的DNADNA雙鏈雙鏈：只要粘性末端只要粘性末端(m dun)(m dun)堿基互補就可以連堿基互補就可以連接。接。這比連接兩個平齊末端這比連接兩個平齊末端(m dun)(m dun)容易得多容易得多。粘性末端的意義粘性末端的意義 連接便利連接便利iiii）同一個同一個DNADNA分子內連接：分子內連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子環(huán)形分子。第36頁/共73頁第三十七頁

33、，共74頁。粘性粘性(zhn xn)(zhn xn)末端可以用末端可以用DNADNA聚合酶補平成聚合酶補平成平齊末端。平齊末端。 補平成平齊末端補平成平齊末端(m dun)(m dun)B 3B 3末端可以通過末端轉移酶添加幾個多聚核苷酸的尾末端可以通過末端轉移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如巴（如dAdA和和dTdT），即同聚物加尾造成人工），即同聚物加尾造成人工(rngng)(rngng)粘性粘性末端。末端。A A 5 5末端末端可用可用DNADNA多核苷酸激酶多核苷酸激酶進行進行3232P P標記。標記。 末端標記末端標記第37頁/共73頁第三十八頁，共74頁。3. 3. 平頭平頭(png

34、tu)(pngtu)末端末端PvuII等產生的平頭末端 5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 PvuII 37 5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5第38頁/共73頁第三十九頁，共74頁。平齊末端平齊末端(m (m dun)dun)的特點的特點 連接困難，連接效率低，只有粘性連接困難，連接效率低，只有粘性(zhn xn)(zhn xn)末端連末端連接效率的接效率的1%1%，這種連接常出現多聯體連接。，這種連接常出現多聯體連接。粘性末端與平

35、齊末端連接的處理粘性末端與平齊末端連接的處理(chl)(chl)方法方法）添補法：）添補法： 利用利用DNADNA聚合酶聚合酶 (klenow fragment）將堿基添將堿基添補到目的基因的粘性末端上。補到目的基因的粘性末端上。）削除）削除( (平平) )法法 利用利用S1S1和和BalBal3131等等核酸酶核酸酶將目的基因粘性末端的單將目的基因粘性末端的單鏈突出部分削去，使其成為平齊末端鏈突出部分削去，使其成為平齊末端第39頁/共73頁第四十頁，共74頁。不同來源的酶，識別相同的序列，切割不同來源的酶，識別相同的序列，切割(qig)(qig)方式相同方式相同或不同?；虿煌?。識別識別(sh

36、bi)(shbi)位點和切點完全相同位點和切點完全相同 如如Hind Hind 和和Hsu IHsu I 同裂酶（同裂酶（Isoschizomer)Isoschizomer) 完全完全(wnqun)(wnqun)同裂酶：同裂酶：第40頁/共73頁第四十一頁，共74頁。Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5識別位點相同識別位點相同(xin tn)(xin tn)，但切點，但切點不同。不同。如如Xma I Xma I 和和 Sma I Sma I。 不完全不完全(wnqun)(wnqun)同裂酶：同裂酶：第41頁/共73頁第四

37、十二頁，共74頁。識別的序列不同，但能切出相同的粘性識別的序列不同，但能切出相同的粘性(zhn xn)(zhn xn)末端末端。如。如BamH IBamH I、Bgl Bgl 、Bcl IBcl I、Xho Xho 等等 同尾酶同尾酶(Isocaudamers(Isocaudamers）第42頁/共73頁第四十三頁，共74頁。 Sau 3A同尾酶的粘性同尾酶的粘性(zhn xn)末端互相結合后形末端互相結合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。成的新位點一般不能再被原來的酶識別。Sau 3A第43頁/共73頁第四十四頁，共74頁。1 1、限制、限制- -修飾系統修飾系統2 2、限制性核酸內切

38、酶的命名和類型、限制性核酸內切酶的命名和類型(lixng)(lixng)3 3、IIII型限制性核酸內切酶的基本特性型限制性核酸內切酶的基本特性4 4、影響限制性內切酶活性的因素、影響限制性內切酶活性的因素5 5、限制性內切酶對、限制性內切酶對DNADNA的消化作用的消化作用 第一節(jié)第一節(jié) 限制性核酸限制性核酸(h sun)(h sun)內切酶內切酶第44頁/共73頁第四十五頁，共74頁。1. 1. 標準酶解體系標準酶解體系(tx)(tx)的建立的建立 一個單位（一個單位（U U）的限制性內切酶定義）的限制性內切酶定義(dngy)(dngy)： 在合適的溫度和緩沖液中，在在合適的溫度和緩沖液中

39、，在20l20l的反應體系中，的反應體系中，1h1h完全酶解完全酶解1gDNA1gDNA所需要的酶量。所需要的酶量。推薦推薦(tujin)(tujin)：稍過量的酶（：稍過量的酶（2-52-5倍）和較長的反應時倍）和較長的反應時間間 限制性核酸內切酶的反應條件限制性核酸內切酶的反應條件 第45頁/共73頁第四十六頁，共74頁。定定第46頁/共73頁第四十七頁，共74頁。一般一般(ybn)20l(ybn)20l，保證酶液體積不超過反應總，保證酶液體積不超過反應總體積的體積的10%10%前提下，盡量降低反應總體積。前提下，盡量降低反應總體積。加樣順序加樣順序(shnx)(shnx)一般是：一般是：

40、ddHddH2 2O buffer DNA O buffer DNA 酶酶 第47頁/共73頁第四十八頁，共74頁。大部分大部分II 型核酸內切酶需要相似型核酸內切酶需要相似(xin s)的反應條件：的反應條件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0 - 150 mMDTT1 mM0 - 50 mM 低鹽酶低鹽酶100 mM 中鹽酶中鹽酶150 mM 高鹽酶高鹽酶Volume20 - 100 mlTime Temp37 1 - 1.5 hr第48頁/共73頁第四十九頁，共74頁。移液槍吹打或手指移液槍吹打或手指(shuzh)(shuzh)輕彈管壁輕彈管壁若底物若

41、底物(d w)(d w)分子很大（如基因分子很大（如基因組組DNADNA），應避免強烈振蕩。），應避免強烈振蕩?；靹蚝笪⒘扛咚匐x心機進行短混勻后微量高速離心機進行短暫離心，使管壁液體暫離心，使管壁液體(yt)(yt)全部下沉全部下沉。第49頁/共73頁第五十頁，共74頁。三種三種(sn zhn)(sn zhn)方法：方法：）加乙二胺四乙酸（）加乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）至終濃度）至終濃度(nngd)(nngd) 10mmol/L; 10mmol/L; 加十二烷基硫酸鈉（加十二烷基硫酸鈉（SDSSDS） 至終濃度至終濃度(nngd)0.1%(W/V)(nngd)0.1%(W/V)）6565

42、加熱加熱20min20min或者或者7070加熱加熱10min10min）酚）酚/ /氯仿氯仿抽提抽提第50頁/共73頁第五十一頁，共74頁。快速進行微型瓊脂糖凝膠電泳快速進行微型瓊脂糖凝膠電泳觀察觀察然后然后(rnhu)(rnhu)決定是否終止反應決定是否終止反應第51頁/共73頁第五十二頁，共74頁。第52頁/共73頁第五十三頁，共74頁。限制性核酸內切酶的反應條件限制性核酸內切酶的反應條件 完全消化：內切酶在完全消化：內切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。上的所有識別位點都被切開。 局部消化：只有有限數量的酶切位點被切開。局部消化：只有有限數量的酶切位點被切開。 通過通過(tnggu)

43、縮短保溫時間、降低反應溫度或減少縮短保溫時間、降低反應溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。酶的用量可達到局部消化的目的。 第53頁/共73頁第五十四頁，共74頁。電泳電泳(din yn)(din yn)后電泳后電泳(din yn)(din yn)條帶擴散，電條帶擴散，電泳泳(din yn)(din yn)條帶移動距離異常條帶移動距離異常 底物底物DNADNA不純；不純；內切酶不純；內切酶不純；酶蛋白自身或其它雜蛋白與酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNADNA結合在一起使電泳條結合在一起使電泳條帶移動距離異常帶移動距離異常第54頁/共73頁第五十五頁，共74頁。 DNA中的雜質如蛋白質、多糖、苯酚

44、、氯仿、乙中的雜質如蛋白質、多糖、苯酚、氯仿、乙醇醇(y chn)、SDS、EDTA、NaCl等都會影響酶的活等都會影響酶的活性。性。 1. DNA的純度的純度(chnd) 一一般般(ybn)采采取取 純化純化DNA 加大酶的用量加大酶的用量 （510U酶酶/ g DNA ） 延長保溫時間延長保溫時間 （34h） 擴大反應體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌♂專〝U大反應體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌♂專?20 l） 加入亞精胺提高消化作用，需要適當的溫度加入亞精胺提高消化作用，需要適當的溫度 影響限制性內切酶活性的因素影響限制性內切酶活性的因素 第55頁/共73頁第五十六頁，共74頁。2. DNA2. DN

45、A的甲基化程度的甲基化程度(chngd) (chngd) 大腸桿菌大腸桿菌(d chn n jn)一般有兩種甲一般有兩種甲基化酶修飾質粒：基化酶修飾質粒：damdam甲基化酶（修飾甲基化酶（修飾(xish)GATC(xish)GATC中的中的A A）；）； dcmdcm甲基化酶（修飾甲基化酶（修飾(xish)CCA/TGG(xish)CCA/TGG的的C C）。）。 基因工程中必須使用甲基化酶基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。失活突變的菌株。第56頁/共73頁第五十七頁，共74頁。 不同不同(b tn)的限制性內切酶的最適反應溫度不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同(b tn)。大多數

46、是。大多數是37 ，少數例外。，少數例外。3. 3. 溫度溫度(wnd) (wnd) 第57頁/共73頁第五十八頁，共74頁。 酶切超螺旋酶切超螺旋DNA分子分子(fnz)，所需酶量多于線，所需酶量多于線性性DNA分子分子(fnz)；最高可達；最高可達20倍；倍；4. DNA分子分子(fnz)的的構型構型 對同一對同一DNA分子上不同位置的識別分子上不同位置的識別(shbi)序列，切割效率具有位點偏愛性；序列，切割效率具有位點偏愛性； 識別序列的側面序列影響酶切效率。識別序列的側面序列影響酶切效率。 “保保 護護 堿堿 基基”第58頁/共73頁第五十九頁，共74頁。是影響限制是影響限制(xin

47、zh)酶活性的重要酶活性的重要因素。因素。5. 5. 緩沖液緩沖液(Buffer) (Buffer) 緩沖液的化學緩沖液的化學(huxu)組成：組成：10XbufferMgCl2MgCl2、NaCl/KClNaCl/KCl： 提供提供Mg2+Mg2+和離子強度；和離子強度； Tris-HClTris-HCl： 維持維持(wich)pH(wich)pH； 二硫蘇糖醇（二硫蘇糖醇（DTTDTT）：）： 防止酶的氧化，保持酶穩(wěn)定性；防止酶的氧化，保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSABSA等：等： 提高溶液中蛋白質的濃度，防止酶失活提高溶液中蛋白質的濃度，防止酶失活 ；商品化的限制酶一般都帶

48、有專用緩沖液。商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。第59頁/共73頁第六十頁，共74頁。高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度(qingd)、極端、極端pH值等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列值等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的發(fā)生低特異性，即所謂的“星活性星活性” （star activity）現象?，F象。 EcoRI*代表代表EcoRI的星號活力。的星號活力。 星活性的特點星活性的特點: 限制酶識別序列特異性降低限制酶識別序列特異性降低 商品化的限制商品化的限制(xinzh)酶一般都帶有專用緩沖液。酶一般都帶有專用緩沖液。 第

49、60頁/共73頁第六十一頁，共74頁。EcoR I 和和BamH I 等都有等都有*活性?；钚?。EcoR I *在低鹽、高在低鹽、高pH（8）時可識別）時可識別(shbi)和切和切割割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的時候使用的時候(sh hou)要特別注意！要特別注意！第61頁/共73頁第六十二頁，共74頁。概括概括(giku)(giku)起來，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種起來，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種：（1 1）高甘油含量（）高甘油含量（55, v, vv v）；）；（2 2）限制性內切核酸酶用量過高（）限制性內切核酸酶用量過高（100U100Uu

50、gDNAugDNA）；）；（3 3）低離子濃度（）低離子濃度（25 mmol25 mmolL L）；）；（4 4）高）高pHpH（8.08.0以上）；以上）；（5 5）含有機溶劑，如）含有機溶劑，如DMSODMSO（二甲基亞砜（二甲基亞砜 ），乙醇），乙醇等；等；（6 6）有非）有非Mg2+Mg2+的二價陽離子存在（如的二價陽離子存在（如Mn2+Mn2+，Cu2+Cu2+，Co2+Co2+，Zn2+Zn2+等）。等）。第62頁/共73頁第六十三頁，共74頁。 但在實際應用中，一般要用稍過量的酶（但在實際應用中，一般要用稍過量的酶（1g1g加加25U25U酶）反應較長的時間，才能達到完全酶）反應

51、較長的時間，才能達到完全(wnqun)(wnqun)酶酶解。但是不能過分加大酶的用量解。但是不能過分加大酶的用量酶過量對酶切反應的影響：酶過量對酶切反應的影響：1 1）酶過量（一般為）酶過量（一般為100U/gDNA100U/gDNA）會影響識別序列）會影響識別序列(xli)(xli)的正確性，如：的正確性，如：BamHI BamHI 的正常識別序列的正常識別序列(xli): GGATTC (xli): GGATTC ；酶過量識別序列；酶過量識別序列(xli) NGATCN(xli) NGATCN2 2）酶制劑含甘油成分，酶過量，會因為甘油量大而影響其）酶制劑含甘油成分，酶過量，會因為甘油量大而影響其識別的專一性，誘發(fā)星號活力。識別的專一性，誘發(fā)星號活力。6. 酶對消化酶對消化(xiohu)效率的影效率的影響響1U1U核酸內切酶的酶活性：在最佳反應條件下核酸內切酶的酶活性：在最佳反應條件下1h1h，完全水解，完全水解1gDNA1gDNA所需的酶量所需的酶量第63頁/共73頁第六十四頁，共74頁。1 1、限制、限制- -修飾系統修飾系統2 2、限制性核酸內切酶的命名和類型、限制性核酸內切酶的命名和類型3 3、IIII型限制性核酸內切酶的基本特性型限制性核酸內切酶的基本特性4 4、影響限制性內切酶活性的因素、影響限制