化學(xué)生物學(xué)第六章 化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用

1、大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)第六章第六章 化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用 Chapter 6. Interactions between chemicals and proteins 第八次課第八次課大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué) 在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)（包括酶）占細(xì)胞干重的在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)（包括酶）占細(xì)胞干重的70%以以上，種類繁多，在生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著各種各樣的上，種類繁多，在生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著各種各樣的作用。隨著人們

2、對(duì)環(huán)境保護(hù)和生活質(zhì)量要求的提高，作用。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和生活質(zhì)量要求的提高，蛋白質(zhì)在食品、醫(yī)藥（生化藥物、臨床檢驗(yàn)、藥物篩蛋白質(zhì)在食品、醫(yī)藥（生化藥物、臨床檢驗(yàn)、藥物篩選等）、環(huán)保（環(huán)境分析）、農(nóng)業(yè)、日用化工（化妝選等）、環(huán)保（環(huán)境分析）、農(nóng)業(yè)、日用化工（化妝品）、精細(xì)化工（酶催化合成）等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣品）、精細(xì)化工（酶催化合成）等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛。泛。 在蛋白質(zhì)體外的應(yīng)用中，一般涉及到分離純化、儲(chǔ)存、在蛋白質(zhì)體外的應(yīng)用中，一般涉及到分離純化、儲(chǔ)存、含量檢測(cè)等過程，其中常常發(fā)生化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)非含量檢測(cè)等過程，其中常常發(fā)生化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)非專一性的相互作用，如沉淀作用、變性作用、穩(wěn)定作專

3、一性的相互作用，如沉淀作用、變性作用、穩(wěn)定作用以及化學(xué)修飾作用等。用以及化學(xué)修飾作用等。 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)球狀蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要特征球狀蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要特征 絕大多數(shù)蛋白質(zhì)折疊成為近乎球狀的結(jié)構(gòu)。球狀蛋白絕大多數(shù)蛋白質(zhì)折疊成為近乎球狀的結(jié)構(gòu)。球狀蛋白質(zhì)一旦具有三級(jí)結(jié)構(gòu)后，蛋白質(zhì)內(nèi)部變得更為緊密，質(zhì)一旦具有三級(jí)結(jié)構(gòu)后，蛋白質(zhì)內(nèi)部變得更為緊密，內(nèi)部的空間約有內(nèi)部的空間約有75被原子所充滿。這樣的密集程度被原子所充滿。這樣的密集程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過在液體中的小分子，可以與某些晶體相比。遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過

4、在液體中的小分子，可以與某些晶體相比。 蛋白質(zhì)可認(rèn)為是帶有極性外套的油滴，也就是蛋白質(zhì)可認(rèn)為是帶有極性外套的油滴，也就是“非極非極性在內(nèi)，極性在外性在內(nèi)，極性在外”。大量蛋白質(zhì)的。大量蛋白質(zhì)的X射線晶體衍射射線晶體衍射分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果充分證明了這一規(guī)律。分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果充分證明了這一規(guī)律。 存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部的主要是一些非極性殘基側(cè)鏈，約存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部的主要是一些非極性殘基側(cè)鏈，約有有63是丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙是丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等；帶電的殘基，如天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸氨酸等；帶電的殘基，如天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸只有和精氨酸只有4。約。約95的帶電

5、側(cè)鏈分布在蛋白質(zhì)的帶電側(cè)鏈分布在蛋白質(zhì)表面；約表面；約14的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸在蛋白質(zhì)分子表面。酸在蛋白質(zhì)分子表面。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)蛋白質(zhì)內(nèi)部存在極少量的親水殘基，表面也常見到一些疏蛋白質(zhì)內(nèi)部存在極少量的親水殘基，表面也常見到一些疏水殘基。這些水殘基。這些“異常異?！狈植嫉臍埢?，致使肽鏈的局部結(jié)構(gòu)分布的殘基，致使肽鏈的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生發(fā)生“扭曲扭曲”，一些鍵的張角與一般正常的值有偏離，蛋，一些鍵的張角與一般正常的值有偏離，蛋白質(zhì)中這些局部的構(gòu)象具有相對(duì)偏高的能量

6、，相對(duì)處于較白質(zhì)中這些局部的構(gòu)象具有相對(duì)偏高的能量，相對(duì)處于較不穩(wěn)定狀態(tài)，在外界很小的擾動(dòng)作用下，就能發(fā)生變化。不穩(wěn)定狀態(tài)，在外界很小的擾動(dòng)作用下，就能發(fā)生變化。原則上，一些相對(duì)規(guī)則的原則上，一些相對(duì)規(guī)則的 -螺旋和螺旋和 -折疊分布在球狀蛋白折疊分布在球狀蛋白內(nèi)部，且壓積得很緊密，致使球狀蛋白具有致密的結(jié)構(gòu)；內(nèi)部，且壓積得很緊密，致使球狀蛋白具有致密的結(jié)構(gòu)；那些那些 -螺旋和螺旋和 -折疊疊規(guī)整性相對(duì)差一些的二級(jí)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)折疊疊規(guī)整性相對(duì)差一些的二級(jí)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)角和環(huán)狀以及特定的角和環(huán)狀以及特定的“無規(guī)無規(guī)”卷曲，則更多地分布在球狀卷曲，則更多地分布在球狀蛋白外周。蛋白外周。值得指出的是在很多蛋白

7、質(zhì)分子內(nèi)部還存在著數(shù)量不同的值得指出的是在很多蛋白質(zhì)分子內(nèi)部還存在著數(shù)量不同的水分子，這些水分子也和一些極性基因或負(fù)電性原子形成水分子，這些水分子也和一些極性基因或負(fù)電性原子形成氫鍵。其中一些也參與蛋白質(zhì)功能的行使過程。氫鍵。其中一些也參與蛋白質(zhì)功能的行使過程。球狀蛋白表面并不是非常光滑的，而是具有很多溝渠，多球狀蛋白表面并不是非常光滑的，而是具有很多溝渠，多數(shù)球狀蛋白可及表面的面積約為同樣大小球表面積的兩倍數(shù)球狀蛋白可及表面的面積約為同樣大小球表面積的兩倍。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué) 球狀蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)具有

8、高度特異性和高度靈球狀蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)具有高度特異性和高度靈敏性。每種蛋白質(zhì)分子都有特定的高級(jí)結(jié)構(gòu)。這種構(gòu)敏性。每種蛋白質(zhì)分子都有特定的高級(jí)結(jié)構(gòu)。這種構(gòu)象特異性，使它區(qū)別于其他蛋白質(zhì)；但這種高度特異象特異性，使它區(qū)別于其他蛋白質(zhì)；但這種高度特異性結(jié)構(gòu)，并非固定不變，在執(zhí)行生物學(xué)功能時(shí)，常常性結(jié)構(gòu)，并非固定不變，在執(zhí)行生物學(xué)功能時(shí)，常常發(fā)生一系列的構(gòu)象變化，表現(xiàn)出高度靈敏性。發(fā)生一系列的構(gòu)象變化，表現(xiàn)出高度靈敏性。 在生物體內(nèi)，構(gòu)象變化，往往是該蛋白質(zhì)分子與配基在生物體內(nèi)，構(gòu)象變化，往往是該蛋白質(zhì)分子與配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受體的相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、

9、受體的小分子激素和神經(jīng)介質(zhì)、血紅蛋白小分子激素和神經(jīng)介質(zhì)、血紅蛋白O2等。因此，生物等。因此，生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)總是處于一種可以相互轉(zhuǎn)變的多種構(gòu)象體內(nèi)的蛋白質(zhì)總是處于一種可以相互轉(zhuǎn)變的多種構(gòu)象平衡態(tài)。平衡態(tài)。 球狀蛋白質(zhì)分子表面并不光滑，常出現(xiàn)一些球狀蛋白質(zhì)分子表面并不光滑，常出現(xiàn)一些“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴”，“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴周圍常具有疏水周圍常具有疏水性，這些性，這些“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴”可能是蛋白質(zhì)可能是蛋白質(zhì)(酶酶)的活的活性部位。性部位。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)硫氧還蛋白的結(jié)構(gòu)硫氧還蛋白的

10、結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合水緊密結(jié)合水親水性殘基親水性殘基疏水性殘基疏水性殘基大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用 由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水中能夠形成膠體溶液。由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透布郎運(yùn)動(dòng)等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分

11、子雜質(zhì)除去。 根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生沉淀作用。蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生沉淀作用。 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)。在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液質(zhì)的溶解性質(zhì)。在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。中沉淀出來。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)沉沉淀淀作作用用的的類類型型可逆沉淀可逆沉

12、淀不可逆沉淀不可逆沉淀抗體抗體- -抗原沉淀抗原沉淀在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱脑跍睾蜅l件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。蛋白質(zhì)在沉淀過程中中沉淀分離。蛋白質(zhì)在沉淀過程中結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，又稱為非變性沉淀。液，又稱為非變性沉淀。在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶

13、解于水蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，又稱為變性沉淀。和性質(zhì)的變化，又稱為變性沉淀。抗體和抗原蛋白通過相互識(shí)別抗體和抗原蛋白通過相互識(shí)別和結(jié)合而發(fā)生的沉淀現(xiàn)象。這和結(jié)合而發(fā)生的沉淀現(xiàn)象。這種特殊的沉淀作用是生物體免種特殊的沉淀作用是生物體免疫功能的基礎(chǔ)疫功能的基礎(chǔ)。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)一、無機(jī)物沉淀一、無機(jī)物沉淀當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中逐漸加入無機(jī)當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中逐漸加入無機(jī)鹽時(shí)，開始蛋白質(zhì)的溶解度增大，鹽時(shí)，開始蛋白質(zhì)的溶解度增大，是由于蛋白質(zhì)的

14、活度系數(shù)降低的是由于蛋白質(zhì)的活度系數(shù)降低的緣故，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。緣故，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。但當(dāng)繼續(xù)加入電解質(zhì)時(shí)，另一種但當(dāng)繼續(xù)加入電解質(zhì)時(shí)，另一種因素起作用，使蛋白質(zhì)的溶解度因素起作用，使蛋白質(zhì)的溶解度減小，稱為鹽析。這是由于電解減小，稱為鹽析。這是由于電解質(zhì)的離子在水中發(fā)生水化，當(dāng)電質(zhì)的離子在水中發(fā)生水化，當(dāng)電解質(zhì)的濃度增加時(shí)，水分子就離解質(zhì)的濃度增加時(shí)，水分子就離開蛋白質(zhì)的周圍，暴露出疏水區(qū)開蛋白質(zhì)的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，疏水區(qū)域越蛋白質(zhì)聚集而沉淀，疏水區(qū)域越多，就越易產(chǎn)生沉淀。多，就越易產(chǎn)生沉淀。（1）鹽析）鹽析牢固結(jié)

15、牢固結(jié)合水合水大量溶大量溶劑水層劑水層大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)含高價(jià)陰離子的鹽，效果比含高價(jià)陰離子的鹽，效果比1價(jià)的鹽好。陰離子的鹽析效果有下價(jià)的鹽好。陰離子的鹽析效果有下列次序：列次序：檸檬酸鹽檸檬酸鹽PO43-SO42-CH3COO-Cl-NO3-SCN-。 但高價(jià)陽離子的效果不如低價(jià)陽離子，例如硫酸鎂的效果不如但高價(jià)陽離子的效果不如低價(jià)陽離子，例如硫酸鎂的效果不如硫酸銨。對(duì)于硫酸銨。對(duì)于1價(jià)陽離子則有下列次

16、序：價(jià)陽離子則有下列次序：NH4+K+Na+。 因此，最常用的鹽析劑是硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀或磷酸鈉。因此，最常用的鹽析劑是硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀或磷酸鈉。但硫酸鈉在但硫酸鈉在40C 以下溶解度較低，因而僅適用于對(duì)熱穩(wěn)定的蛋以下溶解度較低，因而僅適用于對(duì)熱穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。磷酸鹽在中性范圍內(nèi)實(shí)際上是白質(zhì)。磷酸鹽在中性范圍內(nèi)實(shí)際上是HPO42-和和H2PO4-的混合物，的混合物，其作用比其作用比PO43-差。硫酸銨由于價(jià)廉、溶解度大，且能使蛋白質(zhì)差。硫酸銨由于價(jià)廉、溶解度大，且能使蛋白質(zhì)穩(wěn)定穩(wěn)定, 在在2-3mol/L (NH4)2SO4中酶可保存幾年。同時(shí)由于鹽的濃中酶可保存幾年。同時(shí)由于鹽的濃度

17、高，可防止蛋白酶和細(xì)菌作用，故是最常用的鹽析劑。硫酸度高，可防止蛋白酶和細(xì)菌作用，故是最常用的鹽析劑。硫酸銨的缺點(diǎn)是水解后變酸，在高銨的缺點(diǎn)是水解后變酸，在高pH下會(huì)釋放出氨，腐蝕性強(qiáng)；殘下會(huì)釋放出氨，腐蝕性強(qiáng)；殘留的硫酸銨在食品中雖然量少，也會(huì)影響其味，在醫(yī)療上有毒，留的硫酸銨在食品中雖然量少，也會(huì)影響其味，在醫(yī)療上有毒，因此必須除去。因此必須除去。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)（2）金屬離子沉淀法）金屬離子沉淀法 一些高價(jià)金屬離子對(duì)沉淀蛋白質(zhì)很有效。它們可以分一些高價(jià)金屬離子對(duì)沉淀蛋白質(zhì)很有效。它們可以分為三類：為三

18、類： 第一類為第一類為Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和和Cd2+能和蛋白質(zhì)分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等能和蛋白質(zhì)分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等側(cè)鏈結(jié)合。側(cè)鏈結(jié)合。 第二類為第二類為Ca2+，Ba2+，Mg2+和和Pb2+能和蛋白質(zhì)分子表能和蛋白質(zhì)分子表面的羧基結(jié)合，但不和含氮化合物相結(jié)合。面的羧基結(jié)合，但不和含氮化合物相結(jié)合。 第三類為第三類為Ag+，Hg2+和和Pb2+能和蛋白質(zhì)分子表面的巰基能和蛋白質(zhì)分子表面的巰基相結(jié)合。相結(jié)合。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué) 金屬離子沉淀法

19、的優(yōu)點(diǎn)是它們?cè)谙∪芤褐袑?duì)蛋白質(zhì)金屬離子沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是它們?cè)谙∪芤褐袑?duì)蛋白質(zhì)有效強(qiáng)的沉淀能力。處理后殘余的金屬離子可用離有效強(qiáng)的沉淀能力。處理后殘余的金屬離子可用離子交換樹脂或螯合劑除去。子交換樹脂或螯合劑除去。 在這些離子中，應(yīng)用較廣的是在這些離子中，應(yīng)用較廣的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和和Mn2+，而，而Cu2+，F(xiàn)e2+，Pb2+，Hg2+等較少應(yīng)用，等較少應(yīng)用，因?yàn)樗鼈儠?huì)使產(chǎn)品損失和引起污染。如因?yàn)樗鼈儠?huì)使產(chǎn)品損失和引起污染。如Zn2+可用于可用于沉淀?xiàng)U菌肽沉淀?xiàng)U菌肽(作用于第作用于第4個(gè)組氨酸殘基上個(gè)組氨酸殘基上)和胰島素；和胰島素；Ca2+(CaCO3)用于分離乳酸，血

20、清清蛋白等。用于分離乳酸，血清清蛋白等。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)二、等電點(diǎn)沉淀二、等電點(diǎn)沉淀 蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。 等電點(diǎn)沉淀法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)等電點(diǎn)沉淀法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在偏酸性范圍內(nèi)，而無機(jī)酸通常價(jià)較廉，并且某些都在偏酸性范圍內(nèi)，而無機(jī)酸通常價(jià)較廉，并且某些酸，如磷酸、鹽酸和硫酸的應(yīng)用能為蛋白質(zhì)類食品所酸

21、，如磷酸、鹽酸和硫酸的應(yīng)用能為蛋白質(zhì)類食品所允許。同時(shí)，?？芍苯舆M(jìn)行其他純化操作，無需將殘?jiān)试S。同時(shí)，?？芍苯舆M(jìn)行其他純化操作，無需將殘余的酸除去。余的酸除去。 等電點(diǎn)沉淀法的最主要缺點(diǎn)是酸化時(shí)，易使蛋白質(zhì)失等電點(diǎn)沉淀法的最主要缺點(diǎn)是酸化時(shí)，易使蛋白質(zhì)失活，這是由于蛋白質(zhì)對(duì)低活，這是由于蛋白質(zhì)對(duì)低pH比較敏感。比較敏感。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)pH對(duì)對(duì) -乳球蛋白溶解度的影響乳球蛋白溶解度的影響 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)三、有機(jī)物沉淀三

22、、有機(jī)物沉淀 利用和水互溶的有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)沉淀的方法很早就利用和水互溶的有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)沉淀的方法很早就用來純化蛋白質(zhì)。加入有機(jī)溶劑于蛋白質(zhì)溶液中產(chǎn)生用來純化蛋白質(zhì)。加入有機(jī)溶劑于蛋白質(zhì)溶液中產(chǎn)生多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來使蛋白質(zhì)沉淀。其中主多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來使蛋白質(zhì)沉淀。其中主要效應(yīng)是水活度的降低。要效應(yīng)是水活度的降低。 當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時(shí)，水對(duì)蛋白質(zhì)分子表面上荷電當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時(shí)，水對(duì)蛋白質(zhì)分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，或者說溶劑的介電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，或者說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸力增大。常數(shù)降低，因而靜電吸力增大。 在疏水區(qū)域附近近有序排

23、列的水分子可以為有機(jī)溶劑在疏水區(qū)域附近近有序排列的水分子可以為有機(jī)溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了疏水性特所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了疏水性特別強(qiáng)的蛋白質(zhì)外，對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)來說，后者影響較小，別強(qiáng)的蛋白質(zhì)外，對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)來說，后者影響較小，所以總的效果是導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀。所以總的效果是導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀。 1. 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué) 有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是溶劑容易蒸發(fā)除去，不會(huì)殘有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是溶劑容易蒸發(fā)除去，不會(huì)殘留在成品中，因此適用于制備食品蛋白質(zhì)。而

24、且有機(jī)留在成品中，因此適用于制備食品蛋白質(zhì)。而且有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。有溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。有機(jī)溶劑沉淀法的缺點(diǎn)是容易使蛋白質(zhì)變性失活，且有機(jī)溶劑沉淀法的缺點(diǎn)是容易使蛋白質(zhì)變性失活，且有機(jī)溶劑易燃、易爆、安全要求較高。機(jī)溶劑易燃、易爆、安全要求較高。 一般所選擇的溶劑必須能和水互溶，而和蛋白質(zhì)不發(fā)一般所選擇的溶劑必須能和水互溶，而和蛋白質(zhì)不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，最常用的溶劑是乙醇和丙酮，加量在生化學(xué)反應(yīng)，最常用的溶劑是乙醇和丙酮，加量在20-50%（V/V）之間。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的溶液）之間。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的溶液pH接近等電點(diǎn)時(shí)，接近等電點(diǎn)時(shí)，引起沉淀所需加入有機(jī)溶

25、劑的量較少。引起沉淀所需加入有機(jī)溶劑的量較少。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)2. 酚類化合物及有機(jī)酸沉淀酚類化合物及有機(jī)酸沉淀 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH小于其等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶有小于其等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶有正電荷，容易與酚類化合物或有機(jī)酸酸根所帶的負(fù)電正電荷，容易與酚類化合物或有機(jī)酸酸根所帶的負(fù)電荷發(fā)生作用生成不溶性鹽而沉淀。荷發(fā)生作用生成不溶性鹽而沉淀。 這類化合物包括鞣酸（又稱單寧）、苦味酸（即這類化合物包括鞣酸（又稱單寧）、苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水楊酸等。三硝基苯酚）、三氯乙

26、酸、磺酰水楊酸等。 單寧是一種多酚類化合物的寡聚體，它們的酚羥基可單寧是一種多酚類化合物的寡聚體，它們的酚羥基可以解離而帶有負(fù)電荷，而且分子中的苯環(huán)、多個(gè)羥基以解離而帶有負(fù)電荷，而且分子中的苯環(huán)、多個(gè)羥基可以與蛋白質(zhì)發(fā)生非共價(jià)相互作用，結(jié)合在蛋白質(zhì)的可以與蛋白質(zhì)發(fā)生非共價(jià)相互作用，結(jié)合在蛋白質(zhì)的表面，然后在蛋白質(zhì)分子之間形成多點(diǎn)交連而成網(wǎng)絡(luò)表面，然后在蛋白質(zhì)分子之間形成多點(diǎn)交連而成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致聚集而沉淀結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致聚集而沉淀 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof.

27、 Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)四、聚合物沉淀四、聚合物沉淀 許多非離子型聚合物，包括聚乙二醇（許多非離子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用來）可用來進(jìn)行選擇性沉淀以純化蛋白質(zhì)。聚合物的作用認(rèn)為與進(jìn)行選擇性沉淀以純化蛋白質(zhì)。聚合物的作用認(rèn)為與有機(jī)溶劑相似，能降低水化度，使蛋白質(zhì)沉淀。此現(xiàn)有機(jī)溶劑相似，能降低水化度，使蛋白質(zhì)沉淀。此現(xiàn)象和雙水相的形成有聯(lián)系。若使低分子量的蛋白質(zhì)沉象和雙水相的形成有聯(lián)系。若使低分子量的蛋白質(zhì)沉淀，需加入大量淀，需加入大量PEG；而使高分子量的蛋白質(zhì)沉淀，；而使高分子量的蛋白質(zhì)沉淀，加入的量較小。加入的量較小。PEG是一種特別有用的沉淀劑，因?yàn)槭且环N

28、特別有用的沉淀劑，因?yàn)闊o毒，不可燃性且對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用而被廣無毒，不可燃性且對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用而被廣泛使用。泛使用。 一般一般PEG的分子量需大于的分子量需大于4000，最常用的是，最常用的是6000和和20000。所用的。所用的PEG濃度通常為濃度通常為20%，濃度再高，會(huì)，濃度再高，會(huì)使粘度增大，造成沉淀的回收比較困難。使粘度增大，造成沉淀的回收比較困難。PEG對(duì)后繼對(duì)后繼分離步驟影響較少，因此可以不必除去。分離步驟影響較少，因此可以不必除去。1. 非離子型聚合物沉淀法非離子型聚合物沉淀法大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)

29、生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)2. 聚電解質(zhì)沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法 有一些離子型多糖化合物可應(yīng)用于沉淀食品蛋白質(zhì)。有一些離子型多糖化合物可應(yīng)用于沉淀食品蛋白質(zhì)。如羧甲基纖維素，海藻酸鹽，果膠酸鹽和卡拉膠等。如羧甲基纖維素，海藻酸鹽，果膠酸鹽和卡拉膠等。它們的作用主要是靜電引力。如羧甲基纖維素能在它們的作用主要是靜電引力。如羧甲基纖維素能在pH值低于等電點(diǎn)時(shí)使蛋白質(zhì)沉淀。但加入量不能太值低于等電點(diǎn)時(shí)使蛋白質(zhì)沉淀。但加入量不能太多，否則會(huì)引起膠溶作用而重新溶解。多，否則會(huì)引起膠溶作用而重新溶解。 一些陰離子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以一些陰離子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一些陽離子聚合物如聚乙烯

30、亞胺和以聚苯乙烯為骨及一些陽離子聚合物如聚乙烯亞胺和以聚苯乙烯為骨架的季胺鹽也曾用來沉淀乳清蛋白質(zhì)。聚丙烯酸能在架的季胺鹽也曾用來沉淀乳清蛋白質(zhì)。聚丙烯酸能在pH 8.8時(shí)沉淀時(shí)沉淀90%以上的蛋白質(zhì)，聚苯乙烯季胺鹽能以上的蛋白質(zhì)，聚苯乙烯季胺鹽能在在pH 10.4時(shí)沉淀時(shí)沉淀95%的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。 聚乙烯亞胺能與蛋白質(zhì)的酸性區(qū)域形成復(fù)合物，在中聚乙烯亞胺能與蛋白質(zhì)的酸性區(qū)域形成復(fù)合物，在中性時(shí)帶正電，可在污水處理中作絮凝劑，也廣泛用于性時(shí)帶正電，可在污水處理中作絮凝劑，也廣泛用于酶的純化中。酶的純化中。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu

31、化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)第三節(jié)第三節(jié) 化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用 許多蛋白質(zhì)在一般緩沖溶液中的穩(wěn)定性相當(dāng)?shù)停承┰S多蛋白質(zhì)在一般緩沖溶液中的穩(wěn)定性相當(dāng)?shù)?，某些酶蛋白溶液在酶蛋白溶液?7C 放置的半衰期僅幾個(gè)小時(shí)。放置的半衰期僅幾個(gè)小時(shí)。 這種穩(wěn)定性降低的原因常常是某些物理或化學(xué)因素破這種穩(wěn)定性降低的原因常常是某些物理或化學(xué)因素破壞了維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的天然狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性壞了維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的天然狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。的變性。 一、蛋白質(zhì)不可逆失活的化學(xué)因素一、蛋白質(zhì)不可

32、逆失活的化學(xué)因素1.強(qiáng)酸和強(qiáng)堿強(qiáng)酸和強(qiáng)堿大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué) 強(qiáng)的無機(jī)酸堿及有機(jī)酸堿都可以改變蛋白質(zhì)溶液的強(qiáng)的無機(jī)酸堿及有機(jī)酸堿都可以改變蛋白質(zhì)溶液的pH，引起蛋白質(zhì)表面必需基團(tuán)的電離，由于各氨基，引起蛋白質(zhì)表面必需基團(tuán)的電離，由于各氨基酸殘基所帶電荷的相互吸引或排斥使蛋白質(zhì)的空間酸殘基所帶電荷的相互吸引或排斥使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，造成蛋白質(zhì)分子聚集，導(dǎo)致不結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，造成蛋白質(zhì)分子聚集，導(dǎo)致不可逆失活?？赡媸Щ睢?另外，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下，肽鍵也容易被水解斷另外，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下，肽鍵也容易

33、被水解斷裂，天冬酰胺和谷酰胺側(cè)鏈的酰胺會(huì)發(fā)生脫氨作用，裂，天冬酰胺和谷酰胺側(cè)鏈的酰胺會(huì)發(fā)生脫氨作用，改變了原來蛋白質(zhì)表面的電荷分布，使蛋白質(zhì)構(gòu)象改變了原來蛋白質(zhì)表面的電荷分布，使蛋白質(zhì)構(gòu)象重新排布，結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)失去活性。重新排布，結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)失去活性。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)2.氧化劑氧化劑 各種氧化劑能夠氧化芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及甲硫氨各種氧化劑能夠氧化芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。其中酪氨酸側(cè)鏈的酚羥酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。其中酪氨酸側(cè)鏈的酚羥基可以被氧化成醌，后者可以與蛋白質(zhì)表面

34、的巰基、基可以被氧化成醌，后者可以與蛋白質(zhì)表面的巰基、氨基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成交聯(lián)產(chǎn)物。在堿性條件氨基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成交聯(lián)產(chǎn)物。在堿性條件下，半胱氨酸可以被下，半胱氨酸可以被Cu2+氧化成次磺酸或亞磺酸或磺氧化成次磺酸或亞磺酸或磺酸半胱氨酸。酸半胱氨酸。 分子氧、分子氧、H2O2以及過氧化物（如過氧甲酸）、氧自以及過氧化物（如過氧甲酸）、氧自由基等是最常見的氧化劑，在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的氧由基等是最常見的氧化劑，在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的氧化失活主要是通過活性氧（羥基自由基、超氧離子、化失活主要是通過活性氧（羥基自由基、超氧離子、過氧化氫、過氧化物）來完成的。這些氧化劑的殺菌過氧化氫、過氧化物

35、）來完成的。這些氧化劑的殺菌作用主要也是造成蛋白質(zhì)失活。作用主要也是造成蛋白質(zhì)失活。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)3.去污劑和表面活性劑去污劑和表面活性劑 去污劑一般分為離子型和非離子型兩大類，都具有長(zhǎng)鏈去污劑一般分為離子型和非離子型兩大類，都具有長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷埠陀H水的極性頭。當(dāng)少量的陰離子去污劑（如十疏水尾和親水的極性頭。當(dāng)少量的陰離子去污劑（如十二烷基磺酸鈉，二烷基磺酸鈉，SDS）單體加入到蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，去）單體加入到蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，去污劑與蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域結(jié)合，隨著加入量增加，污劑與蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域結(jié)合，隨著

36、加入量增加，與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，這時(shí)去污劑則以協(xié)同方與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，這時(shí)去污劑則以協(xié)同方式結(jié)合于蛋白質(zhì)其它位點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展，分子內(nèi)部式結(jié)合于蛋白質(zhì)其它位點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展，分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露，并進(jìn)一步與去污劑結(jié)合，直的疏水性氨基酸殘基暴露，并進(jìn)一步與去污劑結(jié)合，直到達(dá)到飽和為止，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。到達(dá)到飽和為止，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)4.

37、變性劑變性劑 高濃度脲（高濃度脲（8-10mol/L）和鹽酸胍（）和鹽酸胍（6 mol/L）常常用）常常用于蛋白質(zhì)變性和復(fù)性研究，由于脲或鹽酸胍與蛋白質(zhì)于蛋白質(zhì)變性和復(fù)性研究，由于脲或鹽酸胍與蛋白質(zhì)多肽鏈作用，破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)和多肽鏈作用，破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵，引起蛋白質(zhì)不可逆失活。高級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵，引起蛋白質(zhì)不可逆失活。 （1）脲和鹽酸胍）脲和鹽酸胍大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)（2）有機(jī)溶劑）有機(jī)溶劑 水互溶有機(jī)溶劑可以使酶、蛋白質(zhì)失去活性，是因水互溶有機(jī)溶劑可以使酶、蛋白質(zhì)

38、失去活性，是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑取代了蛋白質(zhì)表面的結(jié)合水，并通過疏為有機(jī)溶劑取代了蛋白質(zhì)表面的結(jié)合水，并通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，改變了溶液的介電常數(shù)，從水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，改變了溶液的介電常數(shù)，從而影響維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的非共價(jià)力的平衡。而影響維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的非共價(jià)力的平衡。 （3）螯合劑）螯合劑 結(jié)合金屬離子的試劑，如結(jié)合金屬離子的試劑，如EDTA等可以使金屬酶、等可以使金屬酶、金屬蛋白失活，這是因?yàn)榻饘俚鞍资Щ?，這是因?yàn)镋DTA與金屬離子形成配與金屬離子形成配位復(fù)合物，從而使酶失去金屬輔助因子造成的。位復(fù)合物，從而使酶失去金屬輔助因子造成的。 失去金屬輔助因子的酶或蛋白質(zhì)可以引起蛋白質(zhì)構(gòu)失去

39、金屬輔助因子的酶或蛋白質(zhì)可以引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生較大改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)活力不可逆的喪失。象發(fā)生較大改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)活力不可逆的喪失。 但是，螯合劑可以螯合對(duì)蛋白質(zhì)有害的金屬離子，但是，螯合劑可以螯合對(duì)蛋白質(zhì)有害的金屬離子，使那些不需要金屬離子的蛋白質(zhì)穩(wěn)定。使那些不需要金屬離子的蛋白質(zhì)穩(wěn)定。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)5.重金屬離子和巰基試劑重金屬離子和巰基試劑 在金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用中，一些重金屬離在金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用中，一些重金屬離子，如子，如Hg2+、Cd2+、Pb2+能與蛋白質(zhì)分子中的半胱能與蛋白質(zhì)分

40、子中的半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反應(yīng)，使蛋白質(zhì)不可逆沉淀而變性失活。反應(yīng)，使蛋白質(zhì)不可逆沉淀而變性失活。 巰基試劑，如巰基乙醇等通過還原蛋白質(zhì)分子內(nèi)的巰基試劑，如巰基乙醇等通過還原蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵而使蛋白質(zhì)失去活性，但這個(gè)過程一般是可二硫鍵而使蛋白質(zhì)失去活性，但這個(gè)過程一般是可逆的。而低分子量的含二硫鍵的試劑可與蛋白質(zhì)中逆的。而低分子量的含二硫鍵的試劑可與蛋白質(zhì)中的巰基作用，形成混合二硫鍵，造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)的巰基作用，形成混合二硫鍵，造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致其失活。生變化，導(dǎo)致其失活。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)

41、院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)LysArg水大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)蛋白質(zhì)不可逆失活的化學(xué)因素蛋白質(zhì)不可逆失活的化學(xué)因素 強(qiáng)酸和強(qiáng)堿強(qiáng)酸和強(qiáng)堿 強(qiáng)的酸堿可強(qiáng)的酸堿可以改變蛋白以改變蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)溶液的pH引起蛋白質(zhì)引起蛋白質(zhì)表面必需基表面必需基團(tuán)的電離，團(tuán)的電離，使蛋白質(zhì)的使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造生變化，造成蛋白質(zhì)分成蛋白質(zhì)分子聚集，導(dǎo)子聚集，導(dǎo)致變性。致變性。 氧化劑氧化劑 氧化劑甲硫氧化劑甲硫氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸和胱氨氨酸和胱氨酸殘基。酪酸殘基。酪氨酸

42、側(cè)鏈的氨酸側(cè)鏈的酚羥基可以酚羥基可以被氧化成醌被氧化成醌再與巰基、再與巰基、氨基發(fā)生邁氨基發(fā)生邁克爾加成反克爾加成反應(yīng)形成交聯(lián)應(yīng)形成交聯(lián)產(chǎn)物。產(chǎn)物。 表面活性劑表面活性劑變性劑變性劑 重金屬離子重金屬離子去污劑與蛋去污劑與蛋白質(zhì)表面的白質(zhì)表面的疏水區(qū)域結(jié)疏水區(qū)域結(jié)合，導(dǎo)致蛋合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展，白質(zhì)伸展，分子內(nèi)部的分子內(nèi)部的疏水性氨基疏水性氨基酸殘基暴露酸殘基暴露從而使蛋白從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不可質(zhì)發(fā)生不可逆變性。逆變性。 脲或鹽酸胍脲或鹽酸胍與蛋白質(zhì)多與蛋白質(zhì)多肽鏈作用，肽鏈作用，破壞了蛋白破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)維質(zhì)分子內(nèi)維持其二級(jí)結(jié)持其二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵。構(gòu)的氫鍵。有機(jī)溶劑也有機(jī)溶劑

43、也會(huì)會(huì)引起蛋白引起蛋白質(zhì)變性失活質(zhì)變性失活Hg2+、Cd2+、Pb2+能與蛋能與蛋白質(zhì)分子中白質(zhì)分子中的半胱氨酸的半胱氨酸的巰基、組的巰基、組氨酸的咪唑氨酸的咪唑基以及色氨基以及色氨酸的吲哚基酸的吲哚基反應(yīng)，使蛋反應(yīng)，使蛋白質(zhì)不可逆白質(zhì)不可逆沉淀而變性沉淀而變性失活。失活。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)二、化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用二、化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響，保持其生物活性的能力。根據(jù)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)等存保持其生物活性的能力。根據(jù)

44、生物體內(nèi)蛋白質(zhì)等存在的狀態(tài)，可以利用化學(xué)物質(zhì)或化學(xué)方法使蛋白質(zhì)在的狀態(tài)，可以利用化學(xué)物質(zhì)或化學(xué)方法使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化，以有利于蛋白質(zhì)在體外的應(yīng)用。穩(wěn)定化，以有利于蛋白質(zhì)在體外的應(yīng)用。 通過研究蛋白質(zhì)的變性及穩(wěn)定性，可以了解蛋白質(zhì)通過研究蛋白質(zhì)的變性及穩(wěn)定性，可以了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能與穩(wěn)定性的關(guān)系等。的結(jié)構(gòu)功能與穩(wěn)定性的關(guān)系等。 在蛋白質(zhì)（酶）分離、純化、儲(chǔ)藏和應(yīng)用中，可以在蛋白質(zhì)（酶）分離、純化、儲(chǔ)藏和應(yīng)用中，可以通過化學(xué)方法使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。常用的方法有：通過化學(xué)方法使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。常用的方法有： 固定化：將酶或蛋白質(zhì)多點(diǎn)連接于載體上（無機(jī)載固定化：將酶或蛋白質(zhì)多點(diǎn)連接于載體上（無機(jī)載體、高分子載體）

45、；體、高分子載體）； 添加劑：保護(hù)蛋白質(zhì)（酶）不受氧化劑氧化、不受添加劑：保護(hù)蛋白質(zhì)（酶）不受氧化劑氧化、不受變性劑變性等；變性劑變性等； 化學(xué)修飾：共價(jià)交聯(lián)，使蛋白質(zhì)構(gòu)象固化?；瘜W(xué)修飾：共價(jià)交聯(lián)，使蛋白質(zhì)構(gòu)象固化。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)穩(wěn)定劑穩(wěn)定劑 共溶劑共溶劑 糖類，醇糖類，醇氨基酸及氨基酸及其衍生物其衍生物無機(jī)鹽，無機(jī)鹽，甘油，聚甘油，聚乙二醇等乙二醇等常用常用1-4M1-4M濃度共溶濃度共溶劑來穩(wěn)定劑來穩(wěn)定蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。細(xì)胞器。 抗氧化劑抗氧化劑 底物、輔酶底物、輔酶 金屬離子金屬離子 化學(xué)交

46、聯(lián)劑化學(xué)交聯(lián)劑半胱氨酸，半胱氨酸，2-2-巰基乙醇巰基乙醇還原谷胱甘還原谷胱甘肽，二巰基肽，二巰基赤蘚醇等巰赤蘚醇等巰基試劑可防基試劑可防止巰基氧化止巰基氧化植物抗氧化植物抗氧化劑如兒茶酚劑如兒茶酚黃酮等也具黃酮等也具有保護(hù)作用有保護(hù)作用酶可被底酶可被底物輔酶、物輔酶、競(jìng)爭(zhēng)性抑競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑及反制劑及反應(yīng)產(chǎn)物等應(yīng)產(chǎn)物等所穩(wěn)定。所穩(wěn)定。金屬離子不金屬離子不僅可以影響僅可以影響酶的活性，酶的活性，還可以影響還可以影響酶的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性如如CaCa2+2+多位多位點(diǎn)結(jié)合使得點(diǎn)結(jié)合使得蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子成為緊密的成為緊密的活性形式?；钚孕问健＝宦?lián)劑可在交聯(lián)劑可在相隔較近的相隔較近的兩個(gè)氨基酸兩個(gè)氨基

47、酸殘基之間，殘基之間，或蛋白質(zhì)與或蛋白質(zhì)與其他分子之其他分子之間（如固定間（如固定化載體）發(fā)化載體）發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生交聯(lián)反應(yīng)使蛋白質(zhì)的使蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定。構(gòu)象穩(wěn)定。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)三、化學(xué)物質(zhì)的共價(jià)修飾作用三、化學(xué)物質(zhì)的共價(jià)修飾作用 化學(xué)物質(zhì)與生物大分子的共價(jià)作用常常涉及到物質(zhì)化學(xué)物質(zhì)與生物大分子的共價(jià)作用常常涉及到物質(zhì)的生理活性（包括藥理、毒理等），如何判斷化合的生理活性（包括藥理、毒理等），如何判斷化合物與蛋白質(zhì)分子中的哪類基團(tuán)作用，在體外主要用物與蛋白質(zhì)分子中的哪類基團(tuán)作用，在體外主要用化合修飾的方法。

48、化合修飾的方法。 該方法是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的一種重要的基礎(chǔ)該方法是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的一種重要的基礎(chǔ)手段。手段。 1.1.生物體內(nèi)蛋白質(zhì)加合物的形成生物體內(nèi)蛋白質(zhì)加合物的形成 許多化學(xué)毒物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損害與其親電代謝產(chǎn)物許多化學(xué)毒物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損害與其親電代謝產(chǎn)物同細(xì)胞大分子的親核部位同細(xì)胞大分子的親核部位(如蛋白質(zhì)的巰基如蛋白質(zhì)的巰基)發(fā)生不可發(fā)生不可逆結(jié)合具有密切關(guān)系。逆結(jié)合具有密切關(guān)系。大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué) 當(dāng)外源化合物的活性代謝產(chǎn)物與細(xì)胞內(nèi)重要生物大當(dāng)外源化合物的活性代謝產(chǎn)物與細(xì)胞內(nèi)重要生物大分子

49、，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等共價(jià)結(jié)合，發(fā)生烷分子，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等共價(jià)結(jié)合，發(fā)生烷基化或芳基化，即導(dǎo)致基化或芳基化，即導(dǎo)致DNA損傷、蛋白質(zhì)正常功能損傷、蛋白質(zhì)正常功能喪失，乃至細(xì)胞的損傷或死亡、外源化合物與生物喪失，乃至細(xì)胞的損傷或死亡、外源化合物與生物大分子相互作用主要有兩種方式：非共價(jià)結(jié)合和共大分子相互作用主要有兩種方式：非共價(jià)結(jié)合和共價(jià)結(jié)合。價(jià)結(jié)合。 (1)可與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的化合物可與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的化合物 除少數(shù)烷化劑外，絕大多數(shù)外源化合物需經(jīng)體內(nèi)代除少數(shù)烷化劑外，絕大多數(shù)外源化合物需經(jīng)體內(nèi)代謝活化，轉(zhuǎn)變成親電子的活性代謝物，再與細(xì)胞內(nèi)謝活化，轉(zhuǎn)變成親電子的活性代謝物，再與細(xì)胞內(nèi)

50、生物大分子中的親核部位和基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，例生物大分子中的親核部位和基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，例如蛋白質(zhì)分子中的親核基團(tuán)、如蛋白質(zhì)分子中的親核基團(tuán)、DNA、RNA及一些小及一些小分子物質(zhì)如谷胱甘肽等的親核部位等。分子物質(zhì)如谷胱甘肽等的親核部位等。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)(2)蛋白質(zhì)分子中的可反應(yīng)基團(tuán)蛋白質(zhì)分子中的可反應(yīng)基團(tuán) 致癌物分子量的大小不同，反應(yīng)是不同的，分子量致癌物分子量的大小不同，反應(yīng)是不同的，分子量較小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和較小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和氯乙烯的環(huán)氧化物、丙烯酰

51、胺等，與蛋白質(zhì)作用時(shí)，氯乙烯的環(huán)氧化物、丙烯酰胺等，與蛋白質(zhì)作用時(shí)，所形成的加合物依賴于外源化合物與各種氨基酸反所形成的加合物依賴于外源化合物與各種氨基酸反應(yīng)的相對(duì)速率。應(yīng)的相對(duì)速率。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)試劑類型試劑類型化合物或前體化合物或前體反應(yīng)機(jī)制反應(yīng)機(jī)制烷基化烷基化芳香基化芳香基化鹵代物鹵代物親核取代親核取代環(huán)氧化物環(huán)氧化物硫酸烷基酯硫酸烷基酯活潑的烯烴活潑的烯烴1,4-1,4-加成加成羰基化合物羰基化合物醛醛形成希夫堿形成希夫堿?；；袡C(jī)酸酐、酰氯等有機(jī)酸酐、酰氯等親核取代或加成親核取代或加成磷

52、?；柞；袡C(jī)磷有機(jī)磷親核取代親核取代自由基自由基OH、CCl3自由基反應(yīng)自由基反應(yīng)具有親電氮化合物具有親電氮化合物芳香胺芳香胺 親核取代親核取代大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)2.氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的修飾氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的修飾 蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的修飾是通過選擇性的試劑或親和蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的修飾是通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化合反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。其中的一個(gè)重要作用是用來探化合反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。其中的一個(gè)重要作用是用來探測(cè)活性部位的結(jié)構(gòu)。測(cè)活性部位的結(jié)

53、構(gòu)。 理想情況下，修飾試劑只是有選則地與某一特定的理想情況下，修飾試劑只是有選則地與某一特定的殘基反應(yīng)，很少或幾乎不引起蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變殘基反應(yīng)，很少或幾乎不引起蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化?；?。 在此基礎(chǔ)上，從該基團(tuán)的修飾對(duì)蛋白質(zhì)分子的生物在此基礎(chǔ)上，從該基團(tuán)的修飾對(duì)蛋白質(zhì)分子的生物活性所造成的影響，就可以推測(cè)出被修飾的殘基在活性所造成的影響，就可以推測(cè)出被修飾的殘基在該蛋白質(zhì)分子中的功能。該蛋白質(zhì)分子中的功能。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)3.巰基的化學(xué)修飾巰基的化學(xué)修飾 5,5-二硫二硫-2-硝基苯甲酸硝基苯甲酸(DT

54、NB)，又稱為，又稱為Ellman試劑，試劑，目前已成為最常用的巰基修飾試劑。目前已成為最常用的巰基修飾試劑。DTNB可與巰基反可與巰基反應(yīng)形成二硫鍵，產(chǎn)生的應(yīng)形成二硫鍵，產(chǎn)生的5-巰基巰基-2-硝基苯甲酸陰離子在硝基苯甲酸陰離子在412nm具有很強(qiáng)的吸收，可以通過光吸收變化監(jiān)測(cè)反應(yīng)具有很強(qiáng)的吸收，可以通過光吸收變化監(jiān)測(cè)反應(yīng)程度。程度。有機(jī)汞試劑是最早使用的巰基修飾試劑之一，其中最常有機(jī)汞試劑是最早使用的巰基修飾試劑之一，其中最常用的是對(duì)氯汞苯甲酸，該化合物溶于水形成羥基衍生物，用的是對(duì)氯汞苯甲酸，該化合物溶于水形成羥基衍生物，與巰基相互作用時(shí)與巰基相互作用時(shí)255nm處光吸收具有較大的增強(qiáng)效

55、應(yīng)。處光吸收具有較大的增強(qiáng)效應(yīng)。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)4.氨基的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)修飾 有許多化合物都可用來修飾賴氨酸殘基，三硝基苯磺有許多化合物都可用來修飾賴氨酸殘基，三硝基苯磺酸酸(TNBS)就是其中非常有效的一種。就是其中非常有效的一種。TNBS與賴氨酸與賴氨酸殘基反應(yīng)，在殘基反應(yīng)，在420nm和和367nm能夠產(chǎn)生特定的光吸收。能夠產(chǎn)生特定的光吸收。 在蛋白質(zhì)序列分析中，用于多肽鏈在蛋白質(zhì)序列分析中，用于多肽鏈N-末端殘基的測(cè)定末端殘基的測(cè)定的化合修飾方法的化合修飾方法2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯(DN

56、FD)法、丹磺酰法、丹磺酰氯氯(DNS)法和法和)苯異硫氰酸酯苯異硫氰酸酯(PITC)法都是常用的氨基法都是常用的氨基修飾方法修飾方法。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)5.羧基的化學(xué)修飾羧基的化學(xué)修飾 水溶性的碳化二亞胺類特定修飾蛋白質(zhì)分子的羧基水溶性的碳化二亞胺類特定修飾蛋白質(zhì)分子的羧基基團(tuán)，目前已成為一種應(yīng)用最普遍的標(biāo)準(zhǔn)方法，它基團(tuán)，目前已成為一種應(yīng)用最普遍的標(biāo)準(zhǔn)方法，它在比較溫和的條件下就可以進(jìn)行。在比較溫和的條件下就可以進(jìn)行。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化

57、學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)6.咪唑基的化合修飾咪唑基的化合修飾 焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的修飾組氨酸殘基的是最常用的修飾組氨酸殘基的試劑。該試劑在接近中性的情況下表現(xiàn)出比較好試劑。該試劑在接近中性的情況下表現(xiàn)出比較好的專一性，與組氨酸殘基反應(yīng)使咪唑基上的的專一性，與組氨酸殘基反應(yīng)使咪唑基上的1個(gè)氮個(gè)氮羧乙基化，并且使得在羧乙基化，并且使得在240nm處的光吸收增加。處的光吸收增加。該取代反應(yīng)在堿性條件下是可逆的，可以重新生該取代反應(yīng)在堿性條件下是可逆的，可以重新生成組氨酸殘基。成組氨酸殘基。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物

58、學(xué)化學(xué)生物學(xué)四、蛋白質(zhì)光譜探針?biāo)?、蛋白質(zhì)光譜探針 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定是生物化學(xué)和其他生物學(xué)科中經(jīng)蛋白質(zhì)的定量測(cè)定是生物化學(xué)和其他生物學(xué)科中經(jīng)常涉及的分析內(nèi)容，也是臨床診斷和檢驗(yàn)疾病治療常涉及的分析內(nèi)容，也是臨床診斷和檢驗(yàn)疾病治療效果的重要指標(biāo)，還是藥物和食品分析的常見項(xiàng)目。效果的重要指標(biāo)，還是藥物和食品分析的常見項(xiàng)目。 所謂蛋白質(zhì)光譜探針，就是能與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作所謂蛋白質(zhì)光譜探針，就是能與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的無機(jī)離子、有機(jī)小分子或絡(luò)合物，這些物質(zhì)與用的無機(jī)離子、有機(jī)小分子或絡(luò)合物，這些物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合生成超分子復(fù)合物之后，體系的光譜性蛋白質(zhì)結(jié)合生成超分子復(fù)合物之后，體系的光譜性質(zhì)發(fā)生變化，從而

59、可以提供蛋白質(zhì)濃度或結(jié)構(gòu)方面質(zhì)發(fā)生變化，從而可以提供蛋白質(zhì)濃度或結(jié)構(gòu)方面的信息。的信息。 蛋白質(zhì)的定量分析方法很多，但研究最多、應(yīng)用最蛋白質(zhì)的定量分析方法很多，但研究最多、應(yīng)用最廣的還是吸光光度法、熒光分析法和共振光散射等廣的還是吸光光度法、熒光分析法和共振光散射等分子光譜探針。分子光譜探針。 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Prof. Dr. J.T. Liu化學(xué)生物學(xué)化學(xué)生物學(xué)蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)吸吸光光探探針針金金屬屬探探針針雙縮脲在堿性溶液中與雙縮脲在堿性溶液中與 Cu2+生成紫生成紫紅色化合物的反應(yīng)。肽和蛋白質(zhì)化紅色化合物的反應(yīng)。肽和蛋白質(zhì)化合物都有雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色合物都有雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色化合物，在化合物，在540nm具有光吸收。具有光吸收。 雙縮脲法雙縮脲法Folin-Lowry法法 將雙縮脲試劑和將雙縮脲試劑和Folin酚試劑酚試劑(磷鉬磷鉬酸鹽磷