第七章 酶非水相催化

1、12Contents of Chapter 61、酶催化反應的介質(zhì)2、有機介質(zhì)反應體系 3、酶在有機介質(zhì)中的催化特性 4、有機介質(zhì)中酶催化反應的條件及其控制 GoGoGoGo5、酶非水相催化的應用 Go36.1 6.1 酶催化反應的介質(zhì)酶催化反應的介質(zhì)水是酶促反應最常用的反應介質(zhì)。水是酶促反應最常用的反應介質(zhì)。 但對于大多數(shù)有機化合物來說，水并不是一種適宜的溶劑。但對于大多數(shù)有機化合物來說，水并不是一種適宜的溶劑。因為許多有機化合物因為許多有機化合物(底物底物)在水介質(zhì)中難溶或不溶。在水介質(zhì)中難溶或不溶。 由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等由于水的存在，往往有利于如水解、消旋

2、化、聚合和分解等副反應的發(fā)生。副反應的發(fā)生。是否存在非水介質(zhì)能保證酶催化？是否存在非水介質(zhì)能保證酶催化？1984年，克利巴諾夫（年，克利巴諾夫（Klibanov）等人在有機介質(zhì)中進行了酶催化反）等人在有機介質(zhì)中進行了酶催化反應的研究，他們成功地在利用酶有機介質(zhì)中的催化作用，獲得酯類、肽應的研究，他們成功地在利用酶有機介質(zhì)中的催化作用，獲得酯類、肽類、手性醇等多種有機化合物，明確指出酶可以在水與有機溶劑的互溶類、手性醇等多種有機化合物，明確指出酶可以在水與有機溶劑的互溶體系中進行催化反應體系中進行催化反應。4酶的非水相催化p定義： 酶在非水相中進行的催化反應。p在非水相中，酶分子受到非水介質(zhì)的影

3、響，其催化特性有著很大不同。5酶非水相催化的幾種類型酶非水相催化的幾種類型p 有機介質(zhì)中的酶催化有機介質(zhì)中的酶催化 有機介質(zhì)中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應。 適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。酶在有機介質(zhì)中由于能夠基本保持其完整的結(jié)構(gòu)和活性中心的空間構(gòu)象，所以能夠發(fā)揮其催化功能。 酶在有機介質(zhì)中起催化作用時，酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性和熱穩(wěn)定性等都有改變 主要用于肽、酯類等生產(chǎn)，甾體轉(zhuǎn)化，功能高分子合成，手性藥物拆分等。6p氣相介質(zhì)中的酶催化氣相介質(zhì)中的酶催化 酶在氣相介質(zhì)中進行的催化反應。 適用于底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣

4、體的物質(zhì)的酶催化反應。 由于氣體介質(zhì)的密度低，擴散容易，因此酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點。p 超臨界介質(zhì)中的酶催化超臨界介質(zhì)中的酶催化 酶在超臨界流體中進行的催化反應。超臨界流體是指溫度和壓力超過某物質(zhì)超臨界點的流體。7 p離子液介質(zhì)中的酶催化離子液介質(zhì)中的酶催化 酶在離子液中進行的催化作用。離子液（離子液（ionic ionic liquidsliquids）是由有機陽離子與有機（無機）陰離子構(gòu)成的）是由有機陽離子與有機（無機）陰離子構(gòu)成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點鹽類在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)

5、域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點。 86.2 6.2 有機介質(zhì)反應體系有機介質(zhì)反應體系 非極性有機溶劑非極性有機溶劑酶懸浮體系酶懸浮體系( (微水介質(zhì)體系微水介質(zhì)體系) )用非極性有機溶劑取代所有的大量水，使固體酶懸浮在有機相中。但仍然含有必需的結(jié)合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。酶的狀態(tài)可以是結(jié)晶態(tài)、凍干狀態(tài)、沉淀狀態(tài)，或者吸附在固體載體表面上。 與水互溶的有機溶劑與水互溶的有機溶劑水單相體系水單相體系有機溶劑與水形成均勻的單相溶液體系。酶、底物和產(chǎn)物都能溶解在這種體系中。 非極性有機溶劑非極性有機溶劑水兩相水兩相/ /多相體系多相體系由含有溶解酶的水相和一個非極性的有機

6、溶劑(高脂溶性)相所組成的兩相體系。不管采用何種有機介質(zhì)反應體系，酶催化反應的介質(zhì)中都含有機溶劑和一不管采用何種有機介質(zhì)反應體系，酶催化反應的介質(zhì)中都含有機溶劑和一定量的水。它們都對催化反應有顯著的影響。定量的水。它們都對催化反應有顯著的影響。 水對有機介質(zhì)中酶催化反應的影響水對有機介質(zhì)中酶催化反應的影響 酶在有機介質(zhì)中進行催化反應時，水是不可缺少的成水是不可缺少的成分分之一。有機介質(zhì)中的水含量多少對酶的空間構(gòu)象空間構(gòu)象、酶的催化活性催化活性、酶的穩(wěn)定性穩(wěn)定性、酶的催化反應速度催化反應速度等都有密切關(guān)系，水還與酶催化作用的底物和反應產(chǎn)物的底物和反應產(chǎn)物的溶解度溶解度有關(guān)。 水對酶分子空間構(gòu)象影

7、響 酶分子只有在空間構(gòu)象完整的狀態(tài)下，才具有催化功能。在無水的條件下，酶的空間構(gòu)象被破壞，酶將變性失活。故此，酶分子需要一層水化層，以維持其完整的空間構(gòu)象。維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量稱為必需水（的最低水量稱為必需水（essential wateressential water）。10 水對酶催化反應速度影響 有機介質(zhì)中水的含量對酶催化反應速度有顯著影響。例如馬肝醇脫氫酶在含水量極低的情況下，酶催化反應速度隨含水量增加而增加。 在催化反應達到最大時的含水量稱為最適水含量最適水含量。 相同的酶，反應體系的最適含水量隨有機溶劑種類、固定化載體特性、修飾劑種

8、類等不同而不同。反應體系中有機溶劑對酶催化反應的影響反應體系中有機溶劑對酶催化反應的影響 常用的有機溶劑有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。 在有機溶劑對酶的活力、酶的穩(wěn)定性、酶的催化特性和酶的催化速度都有顯著影響。 1、有機溶劑對酶的結(jié)構(gòu)和功能影響 在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以較好地保持其完整的空間結(jié)構(gòu)。在有機溶劑中，酶分子不能直接溶解，而是懸浮在溶劑中進行催化反應。根據(jù)酶分子的特性和有機溶劑的特根據(jù)酶分子的特性和有機溶劑的特性的不同，保持其空間結(jié)構(gòu)完整性的情況也有所性的不同，保持其空間結(jié)構(gòu)完整性的情況也有所差別差別。 122、有機溶劑對酶活性的影

9、響 極性較強的有機溶劑，如甲醇，乙醇等，會奪取酶分子的結(jié)合水，影響酶分子微環(huán)境的水化層，從而降低酶的催化活性,甚至引起酶的變性失活。因此應選擇好所使用的溶劑，控制好介質(zhì)中的含水量，或者經(jīng)過酶分子修飾提高酶分子的親水性，避避免酶在有機介質(zhì)中因脫水作用而影響其催化活性免酶在有機介質(zhì)中因脫水作用而影響其催化活性。 3、有機溶劑對底物和產(chǎn)物分配的影響 有機溶劑與水之間的極性不同，在反應過程中會影響底物和產(chǎn)物的分配底物和產(chǎn)物的分配，從而影響酶的催化反應。136.3 酶在有機介質(zhì)中的催化特性酶在有機介質(zhì)中的催化特性 酶在有機介質(zhì)中起催化作用時，由于有機溶劑的極性與水有很大差別，對酶的表面結(jié)構(gòu)、活性中心的結(jié)

10、合部位和底物性質(zhì)都會產(chǎn)生一定的影響，從而顯示出與水相介質(zhì)中不同的催化特性. 底物特異性：底物特異性：在有機介質(zhì)中，由于酶分子活性中心在有機介質(zhì)中，由于酶分子活性中心的結(jié)合部位與底物之間的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變，致使的結(jié)合部位與底物之間的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變，致使酶的底物特異性發(fā)生改變。酶的底物特異性發(fā)生改變。 不同有機溶劑具有不同極性，所以在不同有機介質(zhì)中酶的底物專一性不同。14 立體選擇性：立體選擇性：酶在有機介質(zhì)中催化與水溶液中催酶在有機介質(zhì)中催化與水溶液中催化相比較，由于介質(zhì)特性發(fā)生變化，而引起酶的化相比較，由于介質(zhì)特性發(fā)生變化，而引起酶的立體選擇性發(fā)生變化。立體選擇性發(fā)生變化。 一般說，酶在水溶

11、液中立體選擇性較強，而在有一般說，酶在水溶液中立體選擇性較強，而在有機溶劑中立體選擇性較差。機溶劑中立體選擇性較差。 區(qū)域選擇性：區(qū)域選擇性：酶在有機介質(zhì)中催化時，具有區(qū)域酶在有機介質(zhì)中催化時，具有區(qū)域選擇性，即酶能夠選擇底物分子中某一區(qū)域的基選擇性，即酶能夠選擇底物分子中某一區(qū)域的基團優(yōu)先進行反應。團優(yōu)先進行反應。15 鍵選擇性：鍵選擇性：即在有機介質(zhì)中當?shù)孜锓肿又袃煞N以上的即在有機介質(zhì)中當?shù)孜锓肿又袃煞N以上的鍵與酶反應時，酶對其中一種鍵優(yōu)先進行反應。鍵與酶反應時，酶對其中一種鍵優(yōu)先進行反應。 鍵的選擇性與酶的來源和有機介質(zhì)性質(zhì)有關(guān)。鍵的選擇性與酶的來源和有機介質(zhì)性質(zhì)有關(guān)。 熱穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定

12、性：許多酶在有機介質(zhì)中熱穩(wěn)定性優(yōu)于水溶液。許多酶在有機介質(zhì)中熱穩(wěn)定性優(yōu)于水溶液。 主要由于有機介質(zhì)中缺少使酶分子變性失活的水分主要由于有機介質(zhì)中缺少使酶分子變性失活的水分子。子。某些酶在有機介質(zhì)與水溶液中的熱穩(wěn)定性某些酶在有機介質(zhì)與水溶液中的熱穩(wěn)定性 酶 介質(zhì)條件 熱穩(wěn)定性豬胰脂肪酶三丁酸甘油酯水， pH7.0T1/2 26 hT1/2 2 min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2 =1.5 hT1/2 2 min脂蛋白脂肪酶甲苯，90，400 h活力剩余40胰凝乳蛋白酶正辛烷，100水，pH 8.0, 55T1/2 = 80 minT1/2 = 15 min枯草桿菌蛋白酶正辛

13、烷，110T1/2 = 80 min核糖核酸酶壬烷，110，6 h水，pH 8.0, 90活力剩余95T1/2 24 hT1/2 10 min限制性核酸內(nèi)切酶 （Hind ）正庚烷，55，30d活力不降低-葡萄糖苷酶2-丙醇，50，30 h活力剩余80溶菌酶環(huán)己烷，110水T1/2 =140 minT1/2 = 10 min本章目錄17 酶在有機介質(zhì)中由于水分子的減少，相對來說酶分子的構(gòu)象表現(xiàn)出比水溶液中更具有“剛性剛性”特點。因而使通過選擇不同性質(zhì)的溶劑來調(diào)控酶因而使通過選擇不同性質(zhì)的溶劑來調(diào)控酶的某些特性成為可能。的某些特性成為可能。例如在有機溶劑中，可以利用酶與配體的相互作用性質(zhì)，誘導改

14、變酶分子的構(gòu)象，調(diào)控酶的底物專一性,、立體選擇性和手性選擇性等。 有機介質(zhì)酶催化反應的優(yōu)點有機介質(zhì)酶催化反應的優(yōu)點18 由于引起酶變性的許多因素都與水的存在有關(guān)由于引起酶變性的許多因素都與水的存在有關(guān), , 因此因此在有機介質(zhì)中酶的穩(wěn)定性得到顯著提高。在有機介質(zhì)中酶的穩(wěn)定性得到顯著提高。 由于有機溶劑的存在由于有機溶劑的存在, , 水量減少，大大降低了許多水量減少，大大降低了許多需要水參與的副反應需要水參與的副反應，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和?；D(zhuǎn)移等。 在有機介質(zhì)中進行的酶促反應，可以省略產(chǎn)物的萃在有機介質(zhì)中進行的酶促反應，可以省略產(chǎn)物的萃取分離過程取分離過程, ,提高收率。提高收率。 1

15、96.4 6.4 有機介質(zhì)中酶催化反應有機介質(zhì)中酶催化反應的條件及其控制的條件及其控制 酶在有機介質(zhì)中可以催化多種反應，主要包括：合成反應、轉(zhuǎn)移反應、醇解反應、氨解反應、異構(gòu)反應、氧化還原反應、裂合反應等。 主要應控制的條件有：主要應控制的條件有：酶的種類和濃度酶的種類和濃度底物的種類和濃度底物的種類和濃度有機溶劑的種類有機溶劑的種類水含量水含量溫度溫度pHpH離子強度離子強度本章目錄206.5 6.5 酶非水相催化的應用酶非水相催化的應用 酶 催化反應 應用 脂肪酶脂肪酶 肽合成 青霉素G前體肽合成 酯合成 醇與有機酸合成酯類 轉(zhuǎn)酯 各種酯類生產(chǎn) 聚合 二酯的選擇性聚合 ?；?甘醇的酰基化

16、蛋白酶 肽合成 合成多肽 ?；?糖類酰基化羥基化酶 氧化 甾體轉(zhuǎn)化過氧化物酶 聚合 酚類、胺類化合物的聚合多酚氧化酶多酚氧化酶 氧化 芳香化合物的羥基化 膽固醇氧化酶 氧化 膽固醇測定醇脫氫酶 酯化 有機硅醇的酯化手性藥物兩種對映體的藥理作用手性藥物兩種對映體的藥理作用 藥物名稱有效對映體的作用另一種對映體的作用普萘洛爾（Propranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Penicillamine）羥基苯哌嗪(Dropropizine)反應停（Thalidomide）酮基布洛芬（Ketoprofen）喘速寧（Trtoquinol）乙胺丁醇（Ethambutol）萘必洛爾（Kebiv

17、olol）S構(gòu)型，治療心臟病,-受體阻斷劑S構(gòu)型，消炎、解熱、鎮(zhèn)痛S構(gòu)型，抗關(guān)節(jié)炎S構(gòu)型，鎮(zhèn)咳S構(gòu)型，鎮(zhèn)靜劑S構(gòu)型，消炎S構(gòu)型，擴張支氣管S,S構(gòu)型，抗結(jié)核病右旋體，治療高血壓,-受體阻斷劑R構(gòu)型，鈉通道阻滯劑R構(gòu)型，療效很弱R構(gòu)型，突變劑R構(gòu)型，有神經(jīng)毒性R構(gòu)型，致畸胎R構(gòu)型，防治牙周病R構(gòu)型，抑制血小板凝集R,R構(gòu)型，致失明左旋體，舒張血管 1992年，美國FDA明確要求對于具有手性特性的化學藥物，都必需說明其兩個對映體在兩個對映體在體內(nèi)的不同生理活性、藥理作用以及藥物代謝動力學情況體內(nèi)的不同生理活性、藥理作用以及藥物代謝動力學情況。許多國家和地區(qū)也都制定了有關(guān)手性藥物的政策和法規(guī)。這大大

18、推動了手性藥物拆分的研究和生產(chǎn)應用。目前提出注冊申請和正在開發(fā)的手性藥物中，單一對映體藥物占絕大多數(shù)。 一、手性藥物拆分一、手性藥物拆分22青霉素酰化酶催化叔亮氨酸拆分青霉素酰化酶催化叔亮氨酸拆分NH2COOHHNCOOHPhacNH2COOHHNCOOHPhacDL-TlePhacCl10% NaOH+PGAN-Phac-(DL)-TleN-Phac-(D)-TleL-TleShu-Lai Liu，Dongzhi Wei*, et al., Bioprocess and Biosystems Engineering, 2006(In press).Shu-Lai Liu，Dongzhi We

19、i*, et al., Preparative Biochemistry & Biotechnology, 2006(In press).23青霉素?；冈诎被岵鸱种械膽嗝顾仵；冈诎被岵鸱种械膽糜肅OOHHNCOCOO-HNCOCOOHHNCOPGACOO-HNCOCOOHCOO-COO-NH3+N-Phac-DL-TleN-Phac-D-TlePAAL-TleN-Phac-DL-TleN-Phac-D-TlePAAOrganic PhaseAqueous Phase水水-乙酸丁酯雙相體系中叔亮氨酸的拆分乙酸丁酯雙相體系中叔亮氨酸的拆分消除副產(chǎn)物苯乙酸的抑制消除副產(chǎn)物苯乙酸的

20、抑制24二、手性高分子聚合物的制備二、手性高分子聚合物的制備 1 可生物降解的聚酯的合成 2 糖脂的合成脂肪酶脂肪酶- -位置選擇性酯化反應位置選擇性酯化反應OCH2OHOHOHOHOH+RCH2COOH吡啶DMFOCH2OHOHOHOHRCH2COO 葡萄糖苷葡萄糖苷-6-O-6-O-酰基衍生物是一種可生物降解的非離子酰基衍生物是一種可生物降解的非離子表面活性劑，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下表面活性劑，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下進行選擇性酯化得到：進行選擇性酯化得到：26糖酯的合成糖酯的合成27脂肪酶脂肪酶- -消旋化合物選擇性酯化消旋化合物選擇性酯化+ R2OHRR1

21、COOOHRorSR1COOOHR 有機溶劑 脂肪酶 R1COOR2+HOOHR潛手性丙二醇 以以2-2-取代取代-1,3-1,3-丙二醇和脂肪酸為原料，在有機溶丙二醇和脂肪酸為原料，在有機溶劑介質(zhì)中用脂肪酶劑介質(zhì)中用脂肪酶(CCL)(CCL)或豬肝酯酶（或豬肝酯酶（PLEPLE）催化酯化反）催化酯化反應，可得到較高光學純度的應，可得到較高光學純度的R R- -或或S-S-酯。酯。28脂肪酶脂肪酶- -消旋化合物的拆分消旋化合物的拆分乙酸異丙酯乙酸乙烯醇酯 PSL 消旋化合物 RRSS+RCOOCH3OAcRCOOCH3OHRCOOCH3OHRCOOCH3OAcRCOOCH3OH有機溶劑 有機

22、介質(zhì)中用脂肪酶有機介質(zhì)中用脂肪酶(PSL)(PSL)催化酯化用于催化酯化用于-羥基羥基- -,-,-不飽和酯的拆分?？梢员苊飧狈磻陌l(fā)生。不飽和酯的拆分?？梢员苊飧狈磻陌l(fā)生。29脂肪酶脂肪酶- -內(nèi)酯合成反應內(nèi)酯合成反應 -羥基酸或它的酯在脂肪酶催化下，發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化作用得到內(nèi)酯化合物。內(nèi)酯可繼續(xù)反應形成開鏈寡聚物.內(nèi)酯化產(chǎn)物形式主要取決于羥基酸的長度外，也取決于脂肪酶的類型、溶劑及溫度等。30R = H 或烷基寡聚物二聚物 內(nèi)酯有機溶劑脂肪酶 有機溶劑 有機溶劑 脂肪酶 脂肪酶mHO(CH2)nOCOROOC(CH2)nO(CH2)nCO(CH2)nOCO(CH2)nOCOH(CH2)nO

23、ROC31三 酚樹脂的合成例 辣根過氧化物酶在二氧六環(huán)與水混溶的均一介質(zhì)體系中，可以催化苯酚等酚類物質(zhì)聚合，生成酚類聚合物32四 導電有機聚合物的合成例 辣根過氧化物酶可以在與水混溶的有機介質(zhì)（如丙酮、乙醇、二氧六環(huán)等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。 聚苯胺-導電裝置33五 發(fā)光有機聚合物的合成例 辣根過氧化物酶可以在有機介質(zhì)中催化對苯基苯酚合成聚對苯基苯酚，將這種聚合物制成二極管，可以發(fā)出藍光。34六 食品添加劑的生產(chǎn) 利用芳香醛脫氫酶生成香蘭素35七 多肽的合成例 a-胰蛋白酶可以催化N- 乙酰色氨酸與亮氨酸合成二肽 水中反應合成率為0.1%以下 在乙酸乙酯和微量水組成的系統(tǒng)中，合成率可達1

24、00%36八 甾體轉(zhuǎn)化例 可的松轉(zhuǎn)化為氫化可的松的酶促反應，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯組成的系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化率高達100%和90%37九、生物柴油生產(chǎn)九、生物柴油生產(chǎn)生物柴油是利用生物油脂生產(chǎn)的有機燃料，是由動物、植物或微生生物柴油是利用生物油脂生產(chǎn)的有機燃料，是由動物、植物或微生物油脂與小分子醇類經(jīng)過酯交換反應而得到的脂肪酸酯類物質(zhì)。可物油脂與小分子醇類經(jīng)過酯交換反應而得到的脂肪酸酯類物質(zhì)?？梢源娌裼妥鳛椴裼桶l(fā)動機的燃料使用。以代替柴油作為柴油發(fā)動機的燃料使用。 生物油脂的來源：菜子油，豆油，椰子油，棕櫚油、蓖麻油、棉籽油，葵花籽 油，廢食用油等.優(yōu)點：優(yōu)點：（1） 具有良好的環(huán)境屬性（2）

25、 具有較好的低溫發(fā)動機啟動性能。（3） 具有較好的潤滑性能。（4） 具有較好的安全性能。（5） 具有良好的燃料性能。（6） 具有可再生性能。38從生物質(zhì)到生物柴油從生物質(zhì)到生物柴油生物柴油生產(chǎn)裝備生物柴油生產(chǎn)裝備39美國生物柴油發(fā)展趨勢美國生物柴油發(fā)展趨勢特性生物柴油常規(guī)柴油冷濾點（CFPP）夏季產(chǎn)品 ()-100 冬季產(chǎn)品 ()-20-2020的密度 (g/mL)0.880.8340動力粘度 (mm2/s)4624閃點 ()10060可燃性（十六烷值）5649熱值 (ml/l)3235燃 燒 功 效 （ 柴 油=100%），(%)104100硫含量（w, %0.0010.2氧含量（v, %）100燃燒1 kg燃料按化學計算 法 的 最 小 空 氣 耗量(kg)12.514.5