植物細胞工程試驗修改版

1、植物細胞工程實驗一培養(yǎng)基母液的制備一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)和掌握培養(yǎng)基母液的配制方法。在配制培養(yǎng)基前，為了使用方便和用量準確，常常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質(zhì)、激素類分別配制成比培養(yǎng)基配方需要量大若干倍的母液。當(dāng)配制培養(yǎng)基時，只需要按預(yù)先計算好的量吸取母液即可。二、實驗器材電子天平（稱量為0.0001g）、電子天平（稱量為0.01g）、燒杯（500ml、100ml、50ml）、容量并瓦11000ml、100ml、50ml、25ml）、細口瓶（1000ml、100ml、50ml、25ml）、藥勺、玻璃棒、電爐。三、實驗藥品NH4NO3、KNO3、CaC122H2O、MgSO47H2O、KH

2、2P。4、KI、H3BO3、MnSO44H2O、ZnSO47H2O、Na2MoO42H2O、CuSO45H2O、CoC126H2O、FeSO47H2O、Na2-EDTA2H2O、肌醇、煙酸、鹽酸口比哆醇（維生素B6）、鹽酸硫胺素（維生素Bi）、甘氨酸。四、實驗步驟每種母液均配制500ml,各成分的質(zhì)量如下：1、大量元素母液的配制表1MS培養(yǎng)基大量元素母液制備mg/L20稱量（mg）1NH4NO31650165002KNO3190019000蒸儲水定3CaCl22H2O4404400容至4MgSO47H2O3703700500ml5KH2PO41701700各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴大20倍

3、，用稱量為0.01g的電子天平稱取，用蒸儲水分別溶解，按順序逐步混合。后用蒸儲水定容到500ml的容量瓶中，即為20倍的大量元素母液。到入細口瓶，貼好標簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時，每配1L培養(yǎng)基取此液50ml。注意：配制大量元素母液時，某些無機成分如Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時要用純度高的雙蒸水溶解，藥品采用等級較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量雙蒸水使其充分溶解后才能混合，混合時應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等離子錯開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。CaC122H2O要

4、在最后單獨加入，在溶解CaCl22H2O時，蒸儲水需加熱沸騰，除去水中的CO2,以防沉淀。另外，CaC122H2O放入沸水中易沸騰，操作時要防止其溢出。2、微量元素母液的配制MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機鹽由7種化合物（除Fe）組成。微量元素用量較少，特別是CuS045H20、CoC126H2O。按照表2配方，用稱感量為0.0001g的電子天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時，每配制1L培養(yǎng)基，取彳量母液5mlo表2MS培養(yǎng)基微量元素母液的配制培養(yǎng)基濃度（mg/L）200(mg)1MnSO44H2O22.322302ZnSO47H2O8.68603H3BO36.26204KI0.84845Na2M

5、0042H2O0.25256CuSO45H2O0.0252.57CoCl26H2O0.0252.5注意：使用電子分析天平時注意不要把藥品撒到稱盤上，用完以后，用吸耳球?qū)⑻炱絻?nèi)的臟物清理干凈。3、鐵鹽母液的配制鐵鹽不是都需要單獨配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸儲水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時，配制1L取此液5ml。表3MS鐵鹽母液的配制培養(yǎng)基濃度mg/L）擴大200倍稱量（mg）1Na2-EDTA37.337302FeSO47H2O27

6、.82780注意：在配制鐵鹽時，如果加熱攪拌時間過短，會造成FeS04和Na2EDTA鰲合不徹底，此時若將其冷藏，F(xiàn)eS04會結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時，F(xiàn)eS04和Na?EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色（約加熱20-30min）,調(diào)pH值至5.5,室溫放置冷卻后，再冷藏。4、有機母液的配制MS培養(yǎng)基的有機成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸毗哆素。培養(yǎng)基中的有機成分原則上應(yīng)分別單獨配制。配制直接用蒸儲水溶解，注意稱量時用電子天平。注意：由于維生素母液營養(yǎng)豐富，因此貯藏時極易染菌。被菌類污染的維生素母液，有效濃度降低，并且易給后期培養(yǎng)

7、造成傷害，不宜再用。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是：配制母液時用無菌雙蒸儲水溶解維生素，并貯存在棕色無菌瓶中，或縮短貯藏時間。表4MS培養(yǎng)基有機物質(zhì)母液的制備度(mg/L)200稱量(mg)1甘氨酸22002肌醇100100003鹽酸硫胺素（Vbi）0.1104鹽酸比哆素（VB6）0.5505煙酸0.5505、激素母液配制植物組織培養(yǎng)中使用的激素種類及含量需要根據(jù)不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的終濃度以0.5mg/ml為好，需要注意的是：配制生長素類，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA,應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸儲水定容到一定的濃度。

8、細胞分裂素，例如KT,應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇加34滴1mol/L的鹽酸溶解，再用蒸儲水定容。配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。注意：所有的母液都應(yīng)保存在04C冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團則不能繼續(xù)使用。五、思考題：1、配制母液時為什么要按順序加入各藥品？溶解CaCl22H2O時，為什么要將蒸儲水加熱？2、根據(jù)所給母液濃度、蔗糖、瓊脂用量、pH值，按給出的培養(yǎng)基配方計算各種母液吸取量，填入下表。培養(yǎng)基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+瓊脂0.7%,pH5.8。表5按上述配方計算各種母液吸取量并填入下表藥品名稱母液濃度1L培養(yǎng)基母液吸取量0.3L培加基母液吸取星

9、大量兀素20倍液微量兀素200倍液鐵鹽200倍液有機物質(zhì)200倍液6-BA0.5mg/mlKT0.5mg/mlNAA0.5mg/ml蔗糖瓊脂PH值5.8實驗二培養(yǎng)基的配制與滅菌一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)培養(yǎng)基配制與滅菌的操作方法。對植物外植體進行離體培養(yǎng)時，要依靠培養(yǎng)基提供生長所需的營養(yǎng)成分。不同材料對培養(yǎng)基的要求不同，適當(dāng)?shù)脑O(shè)計和選用培養(yǎng)基，對植物組織培養(yǎng)取得成功至關(guān)重要的。另外，對組織培養(yǎng)物的脫分化和再分化等狀態(tài)的調(diào)控，次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等都是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分來實現(xiàn)的。培養(yǎng)基的主要成分包括無機營養(yǎng)物質(zhì)、碳源、有機物質(zhì)、植物生長物質(zhì)等。二、實驗器材電子天平、燒杯（1000ml）、醫(yī)用搪瓷量杯（

10、1000ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH試紙、吸耳球、線繩、封口膜、石棉網(wǎng)。三、實驗藥品蔗糖、瓊脂、1mol/LNaOH、HCl、各種培養(yǎng)基母液。四、實驗步驟（一）、培養(yǎng)基配制（以1LMS培養(yǎng)基為例）1、計量根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計算需要吸取母液的量，計算公式：吸取量ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）x1000ml/母液濃度（mg/L）。2、移液取1000ml瓷杯一只，按照計算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷缸中備用。注意：在使用提前配制的母液時，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重

11、新進行配制。用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次。量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳?，量?種，劃掉1種，以免出錯；移液管不能混用。3、稱取稱取7g瓊脂，30g蔗糖備用4、融化用搪瓷杯量取600的蒸儲水放在電爐上，煮沸，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加水定容至800ml,加入蔗糖，定容至1000ml,煮沸。注意：加瓊脂的時候要邊加入邊攪拌，在加熱瓊脂、制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，否則加

12、熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。5、調(diào)pH用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOHHCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙（5.47.0）測培養(yǎng)基的pH,一直到培養(yǎng)基的pH達到要求為止（在調(diào)制時要比目標pH值偏高0.20.5個單位，因為培養(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會下降0.20.5個單位左右，所以我們調(diào)PH值時一般要求培養(yǎng)基常溫PH值在5.8-6.3之間，我們可以適當(dāng)上調(diào)至6.3-6.4，以確保培養(yǎng)基的凝固）。注意：調(diào)配時要用玻璃棒不停的攪拌，使其充分混合。7、分裝溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的

13、培養(yǎng)基倒入錐形瓶（50ml或100ml）中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/51/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝2530瓶。8、包扎用封口膜封口，扎好繩子，用記號筆做好標記注意：培養(yǎng)基中的部分成分在高溫滅菌時易發(fā)生化學(xué)變化，致使培養(yǎng)基pH值降低，從而使瓊脂凝固力下降，發(fā)生培養(yǎng)基滅菌前凝固，滅菌后不凝固現(xiàn)象。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是：調(diào)整培養(yǎng)基pH值，一般不低于5.6,若需酸性較強培養(yǎng)基，可適當(dāng)增加瓊脂用量，。（二）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基中含有大量的有機物質(zhì)，特別含糖量較高，是各種微生物滋生、繁殖的好場所。而接種材料需要在無菌條件下培養(yǎng)很長時間，如果培養(yǎng)基被污染，則達

14、不到培養(yǎng)的預(yù)期結(jié)果。因此，培養(yǎng)基的滅菌，是植物組織培養(yǎng)中十分重要的環(huán)節(jié)。常用的滅菌方法是高壓滅菌和過濾除菌。1、高壓蒸汽滅菌法把分裝好的培養(yǎng)基及所需滅菌的各種器具、蒸儲水等，放入高壓蒸汽滅菌鍋的消毒桶中，外層鍋內(nèi)加水，水位高度不超過支架高度。蓋好鍋蓋，上好螺絲，注意上螺絲要對角線上。加熱后，鍋上壓力表指針開始移動，當(dāng)指針移至0.5kg/cm2時，扭開放氣閥排除冷空氣，使壓力表指針回復(fù)零位。當(dāng)指針移至1.11.2kg/cm2時，即121c時，維持一定的時間。由于容器的體積不同，瓶壁的厚度不同，所以滅菌的時間也要適當(dāng)考慮，具體可以參考表1。取出培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基自然冷卻凝固。放置1d后再使用。表1培

15、養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必須的最少時間容器的體積（ml）在121c下最少滅菌時間（min）205015751502025050025301000表2飽和蒸汽壓力與其對應(yīng)的溫度溫度C飽和蒸汽壓力C2kg/cm磅/平方英寸2kg/cm磅/平方英寸0.001001.05515121.00.1412103.61.12516122.00.2814106.91.26618124.10.4426109.81.40620126.00.5638112.61.54322127.80.70310115.21.68124129.60.84412117.630134.50.98414119.950147.6150035200

16、040注意：鍋內(nèi)冷空氣必須排盡，否則壓力表指針雖達到一定壓力，但由于鍋內(nèi)冷空氣的存在事實上達不到應(yīng)有的溫度，因而影響滅菌效果。當(dāng)達到一定壓力后，注意在保持壓力過程中，嚴格遵守滅菌時間，時間過長會使一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養(yǎng)基成分，時間短則達不到滅菌效果。對蒸儲水，各種器具滅菌時，滅菌時間要適當(dāng)延長，壓力也要提高，一般在126c維持一個小時。另外三角瓶中的液體不超過總體積的70%否則當(dāng)溫度超過100c時,培養(yǎng)基會噴溢，造成培養(yǎng)瓶壁和封口膜的污染。消毒后的培養(yǎng)基不能立即用于接種，而應(yīng)放置24-72h。放置后如果培養(yǎng)基中沒有出現(xiàn)菌落，則說明培養(yǎng)基是無菌的，才可以用于接種。另外做好的培養(yǎng)基一般應(yīng)在

17、1-2周內(nèi)用完，短時間可存放于室溫條件，如不能盡快用完，應(yīng)放在4c條件下。2、過濾除菌培養(yǎng)基中某些成分是熱不穩(wěn)定的，在高溫濕熱滅菌中可能會降解。這類物質(zhì)需要進行過濾滅菌。例如一些生長因子，如赤霉素（GA）、玉米素、脫落酸、尿素和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。先將除去了不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基的其它成分經(jīng)高壓滅菌后置于超凈工作臺上冷卻至40C,再將過濾滅菌后的該化合物按計劃用量依次加入，搖勻，凝固后即可使用。如果是液體培養(yǎng)基，沒有凝固這個問題，則可在冷卻到室溫后再加入。除菌濾膜其孔徑尺寸一般要小于或等于0.4科處過濾滅菌的原理，是溶液通過濾膜時，細菌的細胞和抱子等因大

18、于濾膜孔徑而被阻。濾膜的吸附作用力也不容忽視，往往小于濾膜孔徑的細菌等亦不能透過。在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置。液量少時可用注射過濾器，它由注射器、濾器（可更換）、持著部分和針管等幾部分組成。注射器不必先經(jīng)高壓滅菌，而后面幾部分要預(yù)先用鋁箔或牛皮紙等包扎好，最好放在有螺旋蓋的玻璃罐中，經(jīng)高壓滅菌，濾器滅菌不應(yīng)超過121C。由于這個注射過濾滅菌器”小巧、方便、實用，在液量多時多用幾套這種裝置（亦可適當(dāng)重復(fù)使用）也能順利完成液體滅菌操作。在使用前按無菌操作要求將注射過濾滅菌器的幾個部分裝配在一起，把吸有需要過濾滅菌溶液的注射器插入細菌過濾器與之相配合的插接口，推壓注射器活塞桿，將溶液

19、壓過濾膜，從針管部分滴出的溶液就是無菌溶液了，但是濾膜不能阻擋病毒粒子通過。在一般情況下，人工配制的溶液不會含有使植物致病的病毒。更嚴格的實驗研究中，這一點仍不容忽視。毫無疑問，過濾滅菌過的溶液要按無菌操作要求盡快加入培養(yǎng)基中，以免重新遭到污染。實驗三培養(yǎng)材料滅菌和接種一、實驗?zāi)康呐c意義培養(yǎng)材料的滅菌與接種是組織培養(yǎng)過程中一個重要的環(huán)節(jié)。通過本實驗，領(lǐng)會無菌培養(yǎng)對實驗材料消毒，接種的要求，初步掌握培養(yǎng)材料滅菌，接種的操作技術(shù)。二、實驗器材超凈工作臺、鐐子、解剖刀、酒精燈、脫脂棉、燒杯、廣口瓶、培養(yǎng)皿。三、實驗藥品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸鈉、無菌水、胡蘿卜塊根、綠豆種子、培養(yǎng)基母液。四、

20、實驗步驟1、準備好培養(yǎng)基，無菌水，培養(yǎng)皿及接種工具。2、將培養(yǎng)基、無菌水、接種工具置于接種臺上，打開超凈臺紫外燈開關(guān)，同時打開接種室內(nèi)的紫外燈，用紫外燈照射至少25min,然后關(guān)室內(nèi)的紫外燈，開通風(fēng)開關(guān)，關(guān)閉臺內(nèi)的紫外燈，通風(fēng)10min后，再開日光燈進行無菌操作。3、接種前用肥皂洗手，特別是將手指洗凈，然后用沾有75%酉精的棉球把手消毒一次。4、將綠豆種子在流水下沖洗干凈。5、將種子放于200ml的廣口瓶中，用75%勺酒精溶?浸泡30s,無菌水沖洗，然后用0.1%升汞溶液（加入吐溫2滴）浸泡3、5、10min,期間不斷搖動溶液，用無菌水洗滌5次備用。6、解除三角瓶上捆扎的線繩，有必要的話可以用

21、沾有75%勺酒精棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培養(yǎng)基整齊排列在接種臺左側(cè)，然后用75%酉精擦洗接種臺表面。7、接種用的鐐子使用前插入95%勺乙醇溶液中，使用鐐子時在酒精燈上燒片刻，冷卻后待用。也可以插入培養(yǎng)基邊緣促使其冷卻。8、在酒精燈火焰旁揭去封口膜，將瓶口傾斜接近水平方向，用火焰灼燒瓶口，灼燒時應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動瓶口（接種時用左手托住三角瓶，呈斜向上方45度這樣既有利于，將外植體方便的送入培養(yǎng)基中，還能有效防止細菌落入三角瓶內(nèi)，如果瓶口直立朝上，可能會導(dǎo)致大量的細菌落入三角瓶內(nèi)，但如果三角橫放可能會導(dǎo)致液體培養(yǎng)基流到瓶口，甚至流出，增加染菌幾率。右手握住鐐子，注意鐐子的拿法。用酒精燈外焰灼燒三

22、角瓶瓶口和瓶壁，使瓶口和瓶壁的細菌灼燒死亡。）左手持瓶，使其靠近火焰，在接種的過程中瓶口始終不能離酒精燈太遠，右手將燒過的鐐子觸動培養(yǎng)基部分，使其冷卻，夾取綠豆種子，將其放在培養(yǎng)基上，用鐐子輕輕按一下，使其部分浸入培養(yǎng)基。每瓶可放4-6個外植體。9、轉(zhuǎn)動瓶口灼燒，將封口膜從酒精燈火焰上過一下，蓋上封口膜，扎好繩子，標上接種日期、材料名稱、姓名等。10、將接種材料移到培養(yǎng)室培養(yǎng)。注思(1)從室外取得材料，要用自來水沖洗數(shù)分鐘，對表面不光滑或長有絨毛等結(jié)構(gòu)不容易洗凈的材料，沖洗時間要長，必要時要用毛刷刷洗。(2)外植體消毒劑的選擇要綜合考慮消毒效果、不同材料對滅菌劑的耐受力、滅菌劑的去除等因素，最

23、好選用兩種消毒劑交替浸泡，初次實驗滅菌時間要設(shè)置一定的時間梯度來確定最佳的滅菌時間。常用的消毒劑見表1。(3)工作臺接種時，應(yīng)盡量避免做明顯擾亂氣流的動作(比如說、笑、打噴嚏)，以免影響氣流，造成污染。另外操作過程中要不時用75%勺酒精擦拭雙手。(4)接種前培養(yǎng)基出現(xiàn)大量污染現(xiàn)象，若菌類只存在于培養(yǎng)基表面，且主要是真菌時，可能是因培養(yǎng)瓶密封不嚴或放置培養(yǎng)基的環(huán)境不潔凈，菌類種群密度過大所致。若菌類存在于培養(yǎng)基內(nèi)部，則可能是由使用污染的貯藏母液引起。另外培養(yǎng)瓶不潔凈，滅菌不徹底也是導(dǎo)致接種前培養(yǎng)基污染的原因。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是：保持環(huán)境潔凈，杜絕使用污染的母液，嚴格高壓蒸汽滅菌程序，保證滅菌

24、時間。(5)接種后培養(yǎng)基出現(xiàn)大面積污染、菌落分布不勻，此種情況主要是接種過程中發(fā)生的污染所致?？赡苁墙臃N室不潔凈、菌類池子過多、鐐子帶菌、操作人員手未徹底消毒、操作人員呼吸及超凈工作臺。出現(xiàn)故障等原因引起。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是：保持無菌接種室潔凈，并定期用甲醛等熏蒸滅菌；在接種前無菌室用紫外燈滅菌時間不低于20-30min;用75%酉精噴霧殺菌降塵，超凈工作臺開啟15-20min后方可使用；鐐子等接種工具嚴格徹底滅菌，且接種時使用1次滅菌1次；操作過程中經(jīng)常用75剛精等消毒劑擦洗手部等措施。(6)接種后外植體周圍發(fā)生菌類污染可能因外植體表面滅菌不徹底所致。解決方法是外植體用飽和洗滌劑浸泡10

25、-15min,自來水沖洗0.5-2h后，再選擇適宜的滅菌劑消毒，一般用0.1-0.2%升汞滅菌最好。對于一些凹凸不平或有茸毛的外植體采用滅菌劑中加“吐溫-80”等濕潤劑的辦法，增加其滲透性，以提高殺菌效果。表1植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑使用濃度%火菌時間(min)乙醇7075易0.13好氯化汞0.10.2較難215最好漂白粉飽和溶液易530很好次氯酸鈣910易530很好次氯酸鈉2易530很好過氧化氫1012515好五、思考題1、接種后污染調(diào)查觀察：接種后25天的污染情況，填入下表:觀察日期接種日期接種數(shù)污染數(shù)污染率主要污染菌種污染率（%=（污染的外植體數(shù)/總接種外植體數(shù)）X100%如果培養(yǎng)材料

26、大部分發(fā)生污染，說明消毒劑浸泡的時間短；若接種材料雖然沒有污染，但材料已發(fā)黃，組織變軟，表明消毒時間過長，組織被破壞死亡；接種材料若沒有出現(xiàn)污染，生長正常，即可以認為消毒時間適宜。2、外植體用消毒劑消毒后，為什么要用無菌水漂洗？有時候會在消毒溶液中加入12滴的表面活性物質(zhì)，例如吐溫-80或吐溫-20,為什么？3、在接種過程中，通過哪些措施來防止細菌對接種工具，接種材料的污染？4、對外植體表面消毒時為什么常用“兩次消毒法”？實驗四胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)誘導(dǎo)植物外植體形成愈傷組織的方法。植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成的重要因素，對有些植物材料而言，生長素和細胞分裂素對保

27、持愈傷組織的快速生長是必要的，特別是兩者結(jié)合使用時，能更強烈的刺激愈傷組織的形成。二、實驗器材超凈工作臺、鐐子、解剖刀、酒精燈、棉球、燒杯、廣口瓶、培養(yǎng)皿三、實驗藥品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸鈉、無菌水、胡蘿卜塊根、培養(yǎng)基母液、2,4-D、水解酪蛋白（CH）。四、實驗步驟1、培養(yǎng)基配置誘導(dǎo)胡蘿卜愈傷組織的培養(yǎng)基為：MS+24-D1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH5.8。愈傷組織增殖培養(yǎng)基：MS+24-D0.5mg/L+CH500mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH5.8。將配好的培養(yǎng)基，高溫蒸汽滅菌之后，冷卻，在室內(nèi)觀察1-2天，如不生長細菌則表明滅菌

28、測底，再將這些培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌操作臺內(nèi)，紫外照射30mins以上。2、胡蘿卜營養(yǎng)根的消毒。將胡蘿卜塊根在自來水下沖洗干凈，用小刀切去外圍組織。將胡蘿卜切段，每段厚約0.5-1cm。把胡蘿卜段用無菌水漂洗干凈。用75%勺酒精溶液浸泡30so用0.1%氯化汞浸泡2、5、10、12min,在浸泡過程中用鐐子攪拌，以使消毒充分。這里設(shè)置梯度是為了探究最佳的升汞消毒時間，我們直接采用的是10mins的消毒時間。浸泡過的胡蘿卜段用無菌水沖洗3-5次，洗去殘留的氯化汞殘留液。3、解除三角瓶上捆扎的線繩，有必要的話可以用沾有75%勺酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培養(yǎng)基處理整齊排列在接種臺左側(cè)，然后用7

29、5%酉精擦洗接種臺表面。4、胡蘿卜營養(yǎng)根切片胡蘿卜營養(yǎng)根由外向內(nèi)依次分為皮層、形成層和中軸三部分。在切片消毒之前首先除去皮層的最外層，以減少胡蘿卜營養(yǎng)根的帶菌量。形成層的分生能力最強，是產(chǎn)生愈傷組織的主要部分，因此在切片時應(yīng)使每一個切片上都有形成層。具體操作方法和步驟如下：胡蘿卜的截面圖沿圖中豎線切開沿圖中豎線切成首先沿橫線把胡蘿卜段切開兩邊部分棄去（如圖）切片，每片厚0.5-1mm圖1胡蘿卜營養(yǎng)根切片的制作注意：消毒以后的所有操作過程，都應(yīng)在超凈工作臺上進行，操作所用的鐐子、解剖刀和剪刀使用前插入95叱醇溶液中，使用時在酒精燈火焰上熾燒片刻，冷卻后再切割。5、輕輕打開封口膜，將三角瓶口在火焰

30、上方灼熱滅菌，同時把長鐐子也放在火焰上方灼燒，將燒過的鐐子觸動培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的外植體，然后將培養(yǎng)皿打開一小縫，用鐐子取出切好的胡蘿卜切片放到培養(yǎng)基表面，用鐐子輕輕向下按一下，使切片部分進入培養(yǎng)基。在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)動三角瓶一圈使瓶口灼熱滅菌。然后用封口膜封口，同時在三角瓶上寫上培養(yǎng)材料、接種日期、姓名等。注意：植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成的極為重要的因素，研究具體問題要設(shè)置一定的濃度梯度，以尋找最佳濃度。五.思考題1、觀察接種的外植體在接種1周后產(chǎn)生愈傷組織的顏色和質(zhì)地，計算愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率（=（形成愈傷組織的材料數(shù)/總接種材料數(shù)）X100%2、分析影響愈

31、傷組織誘導(dǎo)和分化的主要原因。實驗六植物細胞懸浮培養(yǎng)與同步化一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)和掌握植物細胞懸浮培養(yǎng)的常規(guī)方法以及同步化的方法。植物離體細胞作為生物反應(yīng)器具有生產(chǎn)周期短、提取簡單、易規(guī)?；?、不受外界環(huán)境干擾，而且產(chǎn)量高、化學(xué)穩(wěn)定性和化學(xué)特性好等特點，利用植物離體細胞培養(yǎng)進行有用次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)一直受到研究者們的重視，也有成功的先例。同時，研究發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)條件下，細胞系的種類以及培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基的組成、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度對目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有很大的影響。二、實驗器材超凈工作臺、震蕩搖床、各種接種工具、手動吸管泵、尼龍網(wǎng)、移液管、吸耳球、漏斗、離心管、離心機。三、實驗藥品培養(yǎng)基母液、2,

32、4-D、蔗糖、瓊脂。四、實驗步驟1、誘導(dǎo)愈傷組織形成（參見實驗四）。2、制備液體培養(yǎng)基：MS+24-D1mg/L+蔗糖3%將配好的培養(yǎng)基，高溫蒸汽滅菌之后，冷卻，在室內(nèi)觀察1-2天，如不生長細菌則表明滅菌測底，再將這些培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌操作臺內(nèi)，紫外照射30mins以上。3、在超凈工作臺上，從形成愈傷組織的培養(yǎng)瓶中，挑取質(zhì)地松弛、生長旺盛的愈傷組織、放入盛有30ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，用鐐子輕輕捏碎愈傷組織。每瓶接入約2g重的愈傷組織，（或直接挑取蓬松的愈傷組織，用鐐子敲碎，之后加入到30ml的培養(yǎng)基中，再吹打均勻，形成細胞懸液，再稀釋至培養(yǎng)基中。）置于震蕩搖床固定，在黑暗條件下或弱散射光下10

33、0r/min震蕩培養(yǎng)。4、將胡蘿卜懸浮細胞培養(yǎng)物搖勻后倒在或滴入孔徑較大的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)漏斗中（孔徑47m,81m或更大）。5、如果網(wǎng)眼被細胞團堵塞，可用吸管反復(fù)吸、吹。6、再用無菌培養(yǎng)基沖洗殘留在網(wǎng)上的細胞團。7、重復(fù)步驟46次。8、將通過較大孔徑的細胞懸浮液，再通過較細孔徑的尼龍網(wǎng)過濾（如31m,26m）,用吸管反復(fù)吸、吹。9、經(jīng)過分級過濾的“同步化”細胞離心（50g,5min）,收集后加入液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)或進一步同步化。（同步化，和懸浮繼代培養(yǎng)都沒做，所以后面幾步不用寫。）五、思考題1、研究細胞懸浮培養(yǎng)的意義何在？挑選愈傷組織進行懸浮培養(yǎng)需注意什么問題？2、建立細胞懸浮系的步驟包括哪

34、些？一個良好的懸浮細胞培養(yǎng)體系應(yīng)該具有什么樣的特征？實驗七月季組織培養(yǎng)一、實驗?zāi)康呐c意義掌握利用莖段作為外植體進行無性繁殖的方法月季屬薔薇科，在觀賞植物中占有重要地位。根據(jù)其栽培技術(shù)的要求，以往的傳統(tǒng)方法，多采用野薔薇種子播種，在2-3年生的實生苗上嫁接，此法不僅繁殖系數(shù)小，且成本較高，生長緩慢，自從組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，使得月季育苗發(fā)展迅速。二、實驗器材超凈工作臺、鐐子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿、解剖刀。三、實驗藥品MS培養(yǎng)基母液，6-BA、NAA、IAA、蔗糖、瓊脂、酒精、氯化汞。四、實驗步驟1、培養(yǎng)基的配制增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖3%+瓊脂0

35、.7%生根培養(yǎng)基：1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%將配好的培養(yǎng)基，高溫蒸汽滅菌之后，冷卻，在室內(nèi)觀察1-2天，如不生長細菌則表明滅菌測底，再將這些培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌操作臺內(nèi)，紫外照射30mins以上。2、外植體的獲得：選用嫩莖為材料，取帶芽的莖段，一般以頂端以下第3-10節(jié)上的芽為好，采回枝條剪去葉柄，再剝?nèi)ジ皆谇o上的皮刺，先用自來水沖洗枝條表面的塵土，然后把枝條截成2-3cm小段，每段帶1-2個側(cè)芽，用70%酒精滅菌20s,再用0.1%氯化汞溶液浸泡10min,再用無菌水沖洗4-5次。3、接種：將滅好菌的材接種到滅好菌的培養(yǎng)基上。（接種過程中同樣要注意無菌操作）。（由于是

36、平板接種4、培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度24C-26C,光照時間8-10h,光照強度12001x。5、分芽繼代：將叢生芽分割繼代。6、生根培養(yǎng)：選取苗長2cm以上的壯苗作為生根材料，接種到生根培養(yǎng)基上，一般在接種后一周開始觀察，約10d后發(fā)現(xiàn)有少量苗生根，20d后即可移栽。7、移栽：將培養(yǎng)有試管苗的三角燒瓶打開，在溫室中煉苗2d,然后取出洗去根部瓊脂，移至盛有珍珠巖與細沙（1:1）的花缽中，每天澆營養(yǎng)液，移栽成活率可達80%以上。五、思考題1 .查閱相關(guān)文獻，設(shè)計篩選月季芽增殖體系建立的最佳激素組合。2 .查閱相關(guān)文獻，了解植株的快繁的方法和大致過程。試驗八蘭花的組織培養(yǎng)一、實驗?zāi)康呐c意義：了解蘭花植物組培

37、的過程，進一步熟悉無菌操作技術(shù)。實驗原理：二、實驗器材：超凈工作臺、鐐子、酒精燈、棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿、解剖刀。三、實驗藥品：MS培養(yǎng)基母液，6-BA、NAA、2,4-D、蔗糖、瓊脂、75%酒精、0.1%氯化汞。四、實驗材料：蘭花一盆。五、實驗步驟：1.培養(yǎng)基的配制：愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+3%瓊脂+0.7%蔗糖+NAA5mg/l+6-BA0.5mg/l將配好的培養(yǎng)基，冷卻至50C,時倒在已滅菌的平板中，蓋好蓋子，并用封口膜封好平板，高溫蒸汽滅菌之后，在室內(nèi)觀察1-2天，如不生長細菌則表明滅菌測底，再將這些培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌操作臺內(nèi)，紫外照射30mins以上。（由于我們采用的是一次性的塑料平板，

38、所以我們是將滅菌好的了培養(yǎng)基，冷卻至50c時，轉(zhuǎn)入無菌操作臺，倒平板，封口后，待其冷卻凝固，之后再紫外消毒30mins后接的種。2.外植體獲得，選取一年生的蘭花嫩葉，一般一年生的嫩葉呈黃綠色。并取嫩葉的幼嫩部位，作為外植體。3.外植體洗滌，將采好的葉片至于自來水系沖洗10mins把葉片上的塵埃洗凈，在用洗滌劑輕輕刷洗葉片，再用無菌水清洗干凈，噴灑酒精，轉(zhuǎn)入無菌操作臺。4 .外植體消毒，將葉片用75%酒精消毒30s,再用0.1%升汞消毒6mins,用無菌水清洗3-5次。5 .外植體切取，用酒精棉擦拭刀片和鐐子，并用酒精燈灼燒。再打開，用已高溫蒸汽滅菌后的培養(yǎng)皿，將蘭花葉片切成0.5cm大小的小塊，接入培養(yǎng)基中。6、培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度2