化妝品微生物檢測培訓(xùn)

1、化妝品微生物檢測培訓(xùn)內(nèi)容一、化妝品檢測微生物種類1 .耐熱大腸桿菌群是一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5C培養(yǎng)24h-48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。2 .銅綠假單胞菌屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42C+C條件下能生長。3 .金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽胞，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。4 .霉菌和酵母菌霉菌是真菌的一部分，其特點是菌絲體較發(fā)達，無較大的子實體。酵母菌是真菌的一部分，細胞寬度（直徑）約26小，長度530小，有的則更長，個體形態(tài)有球狀、卵圓、橢圓、柱狀和香腸狀等。

2、二、微生物檢測方法1.基本操作規(guī)范無菌操作用于防止微生物進入人體組織或其它無菌范圍的操作技術(shù)稱為無菌操作。在各種生物實驗中，為了防止微生物地生長和繁殖影響實驗的進行，也要在無菌的環(huán)境下進行。無菌操作原則：1、環(huán)境要清潔，進行無菌操作前半小時，須停止清掃地面等工作。避免不必要的人群流動，防止塵埃飛揚。2、在執(zhí)行無菌操作時，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。3、執(zhí)行無菌操作前，先洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。4、夾取無菌物品，必須使用無菌持物鉗。進行無菌操作時，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區(qū)取物。5、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi)，不可暴露在空氣中過久。無菌物與

3、非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一經(jīng)打開即不能視為絕對無菌，應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回?zé)o菌容器內(nèi)。6、無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內(nèi)，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期，其中用物是否適量。7、酒精棉球罐每周消毒一次，容器內(nèi)敷料如干棉球、紗布塊等，不可裝得過滿，以免取用時碰在容器外面被污染。無菌操作規(guī)范：1、使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、三角瓶、藍蓋瓶、生理鹽水、（刻度）吸管、膠頭等都必須經(jīng)過無菌處理（高壓蒸汽滅菌鍋、75%酒精處理）。2、樣品外包裝、一次性針筒外包裝等在拆封前都必須用75%酒精棉球擦拭,3、使用超凈工作臺前必須提前20分鐘打開

4、紫外燈滅菌。4、酒精火T火焰5cm范圍內(nèi)可認為無菌，在打開或塞上三角瓶或試管塞子必須將瓶口和塞子同時在火焰上燒一圈，并在火焰無菌范圍內(nèi)打開或塞上塞子，接種或取樣時也必須在火焰無菌范圍內(nèi)；接種環(huán)、銀子、剪刀等金屬器具使用前必須在火焰上灼燒。5、接種完成后應(yīng)立即將平板、三角瓶放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使用過的器具應(yīng)馬上清洗、滅菌。樣品供試液的制備（注意無菌操作）洗發(fā)水、沐浴液一般為水溶性液體樣品，配制供試液時用滅菌吸管吸10mL樣品加到90mL滅菌生理鹽水（含玻璃珠的三角瓶）中，混勻后，制成1:10（10-1稀釋度）檢液。取樣、移液（注意無菌操作）取樣、移液時必須使用無菌的吸管或一次性滅菌針筒進行操作，每一

5、支吸管或針筒只能吸取同一樣品的同一稀釋度液體，取樣必須精確，進行移液時不能將吸管或針頭伸入容器中。劃線接種（注意無菌操作）提前配制相應(yīng)的培養(yǎng)基，滅菌，倒平板，待凝固后提前放入超凈工作臺中；選取平整、圓滑的接種環(huán)按無菌操作法挑取少量菌種，將沾菌接種環(huán)在培養(yǎng)基的邊緣劃原始線，而后使接種環(huán)在指力作用下作輕快的滑移動作，從培養(yǎng)皿的一個邊緣滑向另一個邊緣，滑動時用力要均勻，切勿將接種環(huán)嵌入培養(yǎng)基內(nèi)。劃完后將接種環(huán)在酒精燈火燃燒滅菌，放于原處，蓋好皿蓋，倒置培養(yǎng)皿，劃線全部完成后放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。2.革蘭氏染色原理：革蘭氏染色法是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚，經(jīng)過

6、初染和媒染，結(jié)晶紫和碘液形成特殊復(fù)合物，留在細胞壁內(nèi)，酒精無法脫色去除，呈現(xiàn)紫色；革蘭氏陰性菌由于其細胞壁較薄，酒精脫色能將結(jié)晶紫顏色脫去，經(jīng)過蕃紅（或沙黃）復(fù)染，最終呈紅色。操作步驟：革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具體操作方法是：1）涂片固定。2）草酸錢結(jié)晶紫染1分鐘（初染）。3）自來水沖洗。4）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘（媒染）。5）水洗，用吸水紙吸去水分。6）用95%酒精清洗，洗去染液（脫色）。7）蕃紅（或沙黃）染色液染1分鐘后，自來水沖洗（復(fù)染）。干燥，鏡檢。3鏡檢將待檢標(biāo)本取樣、制片，在顯微鏡下觀察、分析、判斷。顯微鏡操作步驟：1）調(diào)節(jié)合適亮度。2）將臨時裝片在

7、載物臺上適當(dāng)位置固定好。3）低倍物鏡對準(zhǔn)通光孔，使用粗準(zhǔn)焦螺旋將鏡筒自上而下的調(diào)節(jié)，眼睛在側(cè)面觀察，避免物鏡鏡頭接觸到玻片而損壞鏡頭和壓破玻片。4）通過目鏡觀察視野的變化，同時調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩慢上移，直至視野清晰為止。5）如果在視野中沒有被觀察對象，可以移動裝片，原則為欲上反下，欲左反右。6）如果不夠清晰，可以用細準(zhǔn)焦螺旋進一步調(diào)節(jié)。7）如果需要在高倍物鏡下觀察，可以轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器調(diào)換物鏡。如果視野較暗，可通過1的方法調(diào)節(jié)；如果不夠清晰，可通過6的方法調(diào)節(jié)，但是不可以用4的方法。8）如果需要在油鏡下觀察，現(xiàn)在高倍鏡下找到菌的位置，放下載物臺，在裝片上滴一滴香柏油，轉(zhuǎn)動接物鏡轉(zhuǎn)換盤，使油鏡頭

8、于鏡筒下方，俯身鏡旁側(cè)面在肉眼的觀察下，轉(zhuǎn)動粗準(zhǔn)焦螺旋使油鏡頭徐徐下降浸入香柏油內(nèi)，輕輕接觸玻片為止，轉(zhuǎn)動細準(zhǔn)焦螺旋，使視野物象達到最清晰的程度，觀察結(jié)束后，轉(zhuǎn)動粗準(zhǔn)焦螺旋放下載物臺，用沾乙醴的擦鏡紙向同一個方向擦拭油鏡，將香柏油擦凈。4微生物生化檢測1、耐熱大腸桿菌群：產(chǎn)酸產(chǎn)氣；G-;靛基質(zhì)實驗陽性。2、銅綠假單胞菌：G",氧化酶實驗陽性，綠膿菌素實驗陽性為銅綠假單胞菌；液化明膠實驗陽性，硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗陽性，42C生長試驗陽性亦為銅綠假單胞菌。3、金黃色葡萄球菌：G+;甘露醇發(fā)酵實驗陽性；凍干兔血漿實驗陽性。4、霉菌和酵母菌（計數(shù)）：虎紅培養(yǎng)基置28c±2C培養(yǎng)5do

9、三、微生物全檢過程1 .培養(yǎng)基的配制及滅菌需使用的培養(yǎng)基：卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、SCDLP培養(yǎng)基、十六烷三甲基澳化錢瓊脂培養(yǎng)基、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、硝酸鹽蛋白陳水培養(yǎng)基、普通瓊脂斜面培養(yǎng)基、BairdParkeri養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基、凍干兔血漿培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基一般買配制好的成品，按照說明進行配制。配制完成后分裝入三角瓶、藍蓋瓶、試管或培養(yǎng)皿中，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌條件一般為121C,20min。2 .單項檢測流程1、細菌總數(shù)：吸取1ml供試液（10-1）移入9ml無菌生理鹽水中，混勻制成10-2稀釋度菌液，

10、再吸取1ml10-2菌液移入9ml無菌生理鹽水中，混勻制成10-3稀釋度菌液；分別取1ml各稀釋度菌液移入培養(yǎng)皿中，每個稀釋度各用2個平皿，注入融化并冷至45C±1C左右的卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，充分搖勻。凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36c±1C培養(yǎng)48h±2h,觀察并記錄。另取一個不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36C±1C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h,為空白對照。2、耐熱大腸桿菌群：取10mL1:10稀釋的檢液，力口到10mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基中，置44.5C±0.

11、5C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,如既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，繼續(xù)培養(yǎng)至48h,如仍既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報告為耐熱大腸菌群陰性。如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置36C±1C培養(yǎng)18h24h。同時取該培養(yǎng)液12滴接種到蛋白陳水中，置44.5C±0.5C培養(yǎng)24h±2h0經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。耐熱大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為耐熱大腸菌群，應(yīng)注意挑選。挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。在蛋白陳水培養(yǎng)液中，加入靛基

12、質(zhì)試劑約0.5mL,觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。3、銅綠假單胞菌：增菌培養(yǎng)：取1:10樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置36c±1C培養(yǎng)18h24h0如有銅綠假單胞菌生長，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍綠色。分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三甲基澳化錢瓊脂平板上，置36c±1C培養(yǎng)18h24h。凡銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴散有水溶性色素。在缺乏十六烷三甲基澳化錢瓊脂時也可用乙酰胺培養(yǎng)基進行分離，將菌液

13、劃線接種于平板上，置36C±1C培養(yǎng)24h±2h,銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基呈紅色，其他菌不生長。染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進行氧化酶試驗。氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片置于滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對苯二胺試液，在15s30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗陰性。綠膿菌素試驗：取可疑菌落2個一3個，分別接種在綠膿菌素測定培養(yǎng)基上，置36C±1C培養(yǎng)24h±

14、2h,加入氯仿3mL5mL,充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)，待氯仿提取液呈藍色時，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽陳水培養(yǎng)基中，置36c±1C培養(yǎng)24h±2h,觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽陳水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。明膠液化試驗：取銅綠假單胞菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置36c±1C培養(yǎng)24h±

15、;2h,取出放置于4c±2C冰箱10min30min,如仍呈溶解狀或表面溶解時即為明膠液化試驗陽性；如凝固不溶者為陰性。42c生長試驗：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置于42c±1C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h48h,銅綠假單胞菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。5、金黃色葡萄球菌：增菌：取1:10稀釋的樣品10mL接種到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置36c±1C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h±2h0分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取12接種環(huán)，劃線接種在BairdParker平板培養(yǎng)基，如無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置36

16、c±1C培養(yǎng)48h0在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在BairdParker平板培養(yǎng)基上為圓形，光滑，凸起，濕潤，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上，置36c±1C培養(yǎng)24h±2h0染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直至約為0.5m1mo甘露醇發(fā)酵試驗：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)

17、酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入高度為2mm3mm的滅菌液體石蠟，置36c±1C培養(yǎng)24h±2h,金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。血漿凝固酶試驗：吸取1:4新鮮血漿0.5mL,置于滅菌小試管中，加入待檢菌24h±2h肉湯培養(yǎng)物0.5mL?；靹?，置36C±1。叵溫箱或恒溫水浴中，每半小時觀察一次，6h之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5mL,分別加入無菌1:4血漿0.5mL,混勻,作為對照。6、霉菌和酵母菌：吸取1ml供試液（10-1）移入9ml無菌生理鹽水中，混勻制成10-2稀釋度菌液,再吸取1ml10

18、-2菌液移入9ml無菌生理鹽水中，混勻制成10-3稀釋度菌液；分別取1ml各稀釋度菌液移入培養(yǎng)皿中，每個稀釋度各用2個平皿，注入融化并冷至45c±1C左右的虎紅培養(yǎng)基，充分搖勻。凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置28c±2C培養(yǎng)5d,觀察并記錄。另取一個不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL虎紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置28c±2C培養(yǎng)5d,為空白對照。3檢測全過程圖解oowO。AmS飛(OQOgod。9ml滅菌生理鹽水加入約15ml卵磷混勻、靜置、冷卻、凝固、倒置*脂吐溫80培養(yǎng)基36+1C,48+h計數(shù)加入約15ml虎紅混勻、靜置、冷卻、凝固、倒置培養(yǎng)基*28±2C,5d計數(shù)90mlSCDLP液體培養(yǎng)基10ml雙倍乳糖膽鹽快培養(yǎng)基伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基蛋白陳水36±1C,18-24h*有菌生長>44.5+0.5C,24+2h>加入靛基質(zhì)0.5mlM判斷陰陽性,十六烷三甲基漠化鏤瓊脂培養(yǎng)基BairdParker平板培養(yǎng)基*36+1,36+1,結(jié)論四、其他驗證1 .凍干菌粉傳代培養(yǎng)購買回來的凍干粉菌種（0代）加入5ml適合增殖培養(yǎng)的培