高效液相色譜法測(cè)定撲熱息痛的含量

1、高效液相色譜高效液相色譜高效液相色譜法測(cè)定撲熱息法測(cè)定撲熱息法測(cè)定撲熱息痛的含量痛的含量痛的含量吉林大學(xué)國(guó)家級(jí)生物實(shí)吉林大學(xué)國(guó)家級(jí)生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心驗(yàn)教學(xué)示范中心1、目的要求、目的要求2、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)原理3、試劑與器材、試劑與器材4、實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)步驟5、注意事項(xiàng)、注意事項(xiàng)6、思考題、思考題吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心目的要求目的要求目的要求目的要求目的要求目的要求1掌握用外標(biāo)法對(duì)比法測(cè)定藥物含量的實(shí)驗(yàn)掌握用外標(biāo)法對(duì)比法測(cè)定藥物含量的實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果計(jì)算方法步驟和結(jié)果計(jì)算方法2熟悉高效液相色譜儀的使用方法熟悉高效液相色譜儀的使用方法吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心吉林

2、大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 撲熱息痛即對(duì)乙酰氨基酚，其稀堿溶撲熱息痛即對(duì)乙酰氨基酚，其稀堿溶液在液在257 1nm波長(zhǎng)處有最大吸收，可用波長(zhǎng)處有最大吸收，可用于定量測(cè)定。由于在其生產(chǎn)過程中，有于定量測(cè)定。由于在其生產(chǎn)過程中，有可能引入對(duì)氨基酚等中間體，這些雜質(zhì)可能引入對(duì)氨基酚等中間體，這些雜質(zhì)也有紫外吸收。如果用分光光度法測(cè)定，也有紫外吸收。如果用分光光度法測(cè)定，雜質(zhì)會(huì)對(duì)含量測(cè)定的準(zhǔn)確性造成干擾。雜質(zhì)會(huì)對(duì)含量測(cè)定的準(zhǔn)確性造成干擾。因此，可采用具有分離能力的高效液相因此，可采用具有分離能力的高效液相色譜法將被測(cè)物和雜質(zhì)分離開測(cè)定，則色譜法將被測(cè)物和雜

3、質(zhì)分離開測(cè)定，則雜質(zhì)對(duì)被測(cè)物含量測(cè)定的干擾即被消除。雜質(zhì)對(duì)被測(cè)物含量測(cè)定的干擾即被消除。吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心試劑與器材試劑與器材試劑與器材試劑與器材試劑與器材試劑與器材 高效液相色譜儀高效液相色譜儀 色譜柱：色譜柱：ODS柱（柱（150mm4.6mm,5um） 流動(dòng)相：甲醇流動(dòng)相：甲醇-水（水（40：60）流速：）流速：1.0ml/min 檢測(cè)波長(zhǎng)：檢測(cè)波長(zhǎng)：257nm SGE 50ul 微量注射器微量注射器吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1、配制對(duì)照品溶液、配制對(duì)照品溶液 2、樣品溶液

4、的配制、樣品溶液的配制 3、進(jìn)樣分析、進(jìn)樣分析 4、記錄格式記錄格式5、結(jié)果計(jì)算、結(jié)果計(jì)算 吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制： 分別取母液分別取母液（1mg/ml）5ml，4ml，3ml，2ml，1ml，加入標(biāo)號(hào)，加入標(biāo)號(hào)5-標(biāo)號(hào)標(biāo)號(hào)1的的100ml容量瓶中，并用容量瓶中，并用去離子水稀釋至刻度，搖勻。用注射器吸取標(biāo)準(zhǔn)去離子水稀釋至刻度，搖勻。用注射器吸取標(biāo)準(zhǔn)品品1 ml，過，過0.45um濾膜，濾液轉(zhuǎn)移到濾膜，濾液轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管管中，分別標(biāo)記。用微量注射器進(jìn)樣，記錄色譜圖中，分別標(biāo)記。用微量注射器進(jìn)樣，記錄色譜圖的峰面積和出峰

5、時(shí)間。的峰面積和出峰時(shí)間。 注意！注意！ 0.45um濾膜可重復(fù)使用，但須反復(fù)潤(rùn)濾膜可重復(fù)使用，但須反復(fù)潤(rùn)洗！洗！吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 供試品溶液的配制：供試品溶液的配制： 精密稱取對(duì)乙酰氨基酚粉末精密稱取對(duì)乙酰氨基酚粉末3mg，置，置100ml的的容量瓶中，加適量去離子水，振搖，容量瓶中，加適量去離子水，振搖，60水浴水浴水解水解40min，放冷，放冷10min，待基本溶解完全，待基本溶解完全，加去離子水至刻度，搖勻即得。加去離子水至刻度，搖勻即得。吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心進(jìn)樣分析進(jìn)樣分析 ： 用注射器吸取供試品約用注射器吸

6、取供試品約1ml，經(jīng)過，經(jīng)過0.45um濾膜，濾液轉(zhuǎn)移到濾膜，濾液轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中。管中。用微量注射器吸取用微量注射器吸取EP管中供試品管中供試品0.1ml ，進(jìn)樣。記錄色譜圖的峰面積。進(jìn)樣。記錄色譜圖的峰面積。 吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 供試品濃度的計(jì)算供試品濃度的計(jì)算 將標(biāo)1-標(biāo)5按濃度-峰面積對(duì)應(yīng)關(guān)系做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將供試品峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出供試品濃度。吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1 此實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意進(jìn)樣量的一此實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意進(jìn)樣量的一致，因此，采用注射過量的樣品體積，通致，因此，采用注射過量的樣品體積，通過進(jìn)樣環(huán)（過進(jìn)樣環(huán)（loop）來定量進(jìn)樣。）來定量進(jìn)樣。 2如果出現(xiàn)色譜峰分離不完全的現(xiàn)象如果出現(xiàn)色譜峰分離不完全的現(xiàn)象，則可以通過調(diào)整色譜柱的長(zhǎng)度，調(diào)整流，則可以通過調(diào)整色譜柱的長(zhǎng)度，調(diào)整流動(dòng)相中甲醇和水的比例，以改善分離效果動(dòng)相中甲醇和水的比例，以改善分離效果，使雜質(zhì)峰和樣品峰完全分離。，使雜質(zhì)峰和樣品峰完全分離。吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心思考題思考題思考題思考題思考題思考題1我們欲每次進(jìn)樣我們欲每次進(jìn)樣20ul，為何卻要進(jìn)，為何卻要進(jìn)樣樣10