尚靜靜大創(chuàng)總結(jié)報告ppt

1、低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片代謝產(chǎn)物含量變化的研究 項目編號：AH20141036405作者：尚靜靜 導(dǎo)師：劉童光老師目錄 (一）項目背景及意義（二）項目材料及實驗方法（三）項目實施過程 1.H2O2含量的測定及其變化 2.超氧陰離子自由基（O2.-）產(chǎn)生速率的測定及其變化 3.MDA含量的測定及其變化 4.可溶性糖含量的測定及其變化 5.可溶性蛋白質(zhì)含量的測定（四） 項目討論 1.H2O2含量的變化及O2.-產(chǎn)生速率與幼苗耐低溫的關(guān)系 2.低溫脅迫對甜瓜幼苗葉片MDA含量的影響及MDA與抗寒性的關(guān)系 3.低溫脅迫下可溶性糖含量變化與抗寒性的關(guān)系 4.可溶性蛋白含量的變化與抗寒性的關(guān)系（五） 項目難

2、題（六） 項目小結(jié)（七） 項目研究成果（八） 項目經(jīng)費使用情況（一）1.項目背景甜瓜（Cucumis melo L.）起源于熱帶非洲地區(qū)，屬于葫蘆科（Cucurbutaceae）甜瓜屬（Cucumis）的一年生蔓性草本作物。甜瓜是世界十大水果之一，果實營養(yǎng)豐富，色香味俱佳，多食甜瓜，有利于人體心臟和脾臟以及腸道系統(tǒng)的活動，深受人們喜愛。我國是世界上最早栽培甜瓜的國家之一，也是世界上甜瓜栽培面積最大、產(chǎn)量最高的國家之一。同時，其在國際市場上屬于高檔果品，市場潛力很大。（一）2.項目意義甜瓜喜溫耐熱，植株生長溫度以2530為宜，在我省夏季甜瓜有大量種植，甜瓜1445內(nèi)均可生長，溫度低于10時，會受

3、到不同程度的冷害。近年來，隨著我國設(shè)施園藝的快速發(fā)展，甜瓜保護地栽培日漸成為栽培、生產(chǎn)的主要方式。我國冬春季節(jié)甜瓜生產(chǎn)中經(jīng)常遭遇低溫冷害，長期低溫對甜瓜幼苗生長甚是不利，使得低溫冷害在反季節(jié)生產(chǎn)中問題變得日益突出。目前，在長江中下游地區(qū)，甜瓜的育苗期提前，最早可提前到元月份，定植期則可提前到2月份，在這段時間里外界溫度較低，若碰到連續(xù)的陰雨天氣，設(shè)施栽培內(nèi)則會出現(xiàn)長時間低溫(15)，將嚴重影響甜瓜的幼苗生長，引起其產(chǎn)量和品質(zhì)下降。本項目選擇安徽地區(qū)甜瓜主栽品種“早甜一號”為試材，其進行低溫處理，常溫下的葉片作為對照，測定葉片蔗糖、果糖、葡萄糖、淀粉等代謝產(chǎn)物含量的變化，探究低溫脅迫下甜瓜葉片代

4、謝產(chǎn)物含量變化的研究。冬春季節(jié)保護地栽培的低溫環(huán)境嚴重影響甜瓜的品質(zhì)、產(chǎn)量和經(jīng)濟效益，可見研究甜瓜的抗低溫性對甜瓜反季節(jié)栽培和設(shè)施栽培的穩(wěn)定發(fā)展，提高甜瓜的經(jīng)濟效益具有十分重要的意義。（二）項目材料及實驗方法1. 供試材料 甜瓜品種選用“早甜一號”，種子由安徽省農(nóng)科院園藝所蔬菜育種室提供。2. 試驗方法 選取籽粒飽滿、大小一致的種子溫湯浸種，55殺菌15min，30浸種8h，30培養(yǎng)箱中催芽。種子露白后播于5cm5cm的塑料穴盤中。苗期常規(guī)管理。待幼苗長到3葉1心時，移入光強為100molm-2s-1的SPX-250B-G型光照培養(yǎng)箱（上海博訊設(shè)備廠）內(nèi)，每天光照12h。試驗設(shè)處理T（晝/夜5

5、/5）、對照CK(25/25)兩個溫度組合處理。處理需先在晝/夜溫度15/10下預(yù)處理2d，再在5/5下處理8d。在低溫處理第2d、4d、6d、8d，于9:0010:00選取大小均勻植株的第二、三片真葉為材料測定各項指標(biāo)，每個處理重復(fù)3次。 摘取后迅速稱量、分裝并用液氮速凍，然后保存于-80超低溫冰箱，所有取樣結(jié)束后在實驗室內(nèi)進行各項指標(biāo)的測定。（三）項目實施過程超氧陰離子自由基（O2.-）產(chǎn)生速率的測定H2O2含量的測定可溶性糖含量的測定MDA含量的測定可溶性蛋白質(zhì)含量的測定1.1 H2O2含量的測定 參照Ferguson等1方法，利用丙酮抽取，Ti(IV)-PAR比色法測定。取1.5g保存

6、于-80超低溫冰箱的甜瓜葉片，剪碎后加入3ml預(yù)冷丙酮勻漿，4離心（10000r10min），取1ml上清液，加3ml萃取劑（CCl4:CHCl3=3:1,體積比）混勻，再加5ml蒸餾水混勻，離心（4000r/min,1min），上層水相為H2O2待測液。各取1ml待測液，一份為空白，加入終濃度為3Uml-1的過氧化氫酶（CAT），30保溫10min；另一份待測液，加入等體積高溫滅活的CAT酶液。兩組分別加1ml0.2molL-1、pH7.8的磷酸緩沖液，再加1ml0.2molL-1的Ti(IV)-PAR顯色劑，45水浴保溫20min，靜置1小時至室溫，測508nm的吸光值，根據(jù)A508值計算

7、H2O2。1.2 H2O2含量的變化 H2O2不是自由基，但由于它具有強氧化性，也是可以造成氧毒害的活性氧之一。低溫脅迫會造成植物的氧化損傷，引發(fā) H2O2的過量產(chǎn)生，如果細胞中積累的過量H2O2不能夠被及時清除，則會造成毒害作用，加重脅迫造成的損傷。結(jié)果表明，隨著低溫脅迫的時間的延長，過氧化氫的含量先增加后減少，如圖1所示。2.1 超氧陰離子自由基（O2.-）產(chǎn)生速率的測定 參照植物生理生化實驗原理和技術(shù)2，稱取0.2g甜瓜葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入1.6ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000r下離心20min，上清液即為提取液。

8、采用羥胺氧化法3首先量取0.5ml提取液置于試管中，分別加入0.5ml PBS（0.05M，pH7.8）、1ml 1mM鹽酸羥胺溶液后搖勻；置于25保溫1h后，依次先加入1ml 17mM對氨基苯磺酸、1ml 7mM -萘胺，混合后快速搖勻；再次置于25顯色20min進行測定；以水作為對照進行調(diào)零，取粉紅色水相液在530nm波長處測定吸光值。2.2 O2.-產(chǎn)生速率的變化 啟動膜脂過氧化或膜脂脫脂作用6是O2.-傷害植物的機理之一,從而使膜結(jié)構(gòu)被破壞。剛開始葉片是不是經(jīng)過低溫鍛煉，O2.-產(chǎn)生的速率都會增加。但是處理組比對照O2.-產(chǎn)生速率低，隨著時間延長甜瓜幼苗葉片在4d是達到峰值，之后O2.

9、-產(chǎn)生速率開始下降，處理組甜瓜幼苗葉片8d測得的O2.-產(chǎn)生速率比2d時減低12.24,如圖2所示。3.1 MDA含量的測定 取0.5g保存于-80超低溫冰箱的葉片，加入pH7.5的50mmol/L磷酸緩沖液10ml，于冰浴中研磨提取，按李柏林和梅慧生4的方法測定MDA的含量。3.2 MDA含量的變化 MDA是植物膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受害的重要指標(biāo)之一7。從圖3可以看出，無論是不是經(jīng)過低溫鍛煉，甜瓜幼苗葉片MDA含量都隨時間的延長而增加，且經(jīng)低溫脅迫的MDA含量高于對照，在處理2d時，MDA含量高于對照36.87,在處理8d時，MDA含量高于對照77.23，如圖3所示。4.1 可

10、溶性糖含量的測定 稱取2g低溫處理的甜瓜葉片，用10mL乙醇（分次加入）研碎，轉(zhuǎn)入離心管，于80下浸提1h，4000r離心，收集上清液；再分兩次用5mL80%乙醇將沉淀懸浮，80下浸提10min，并離心，取上清液合并，定容至25mL，混勻后取10mL用蒸發(fā)皿于烘箱中蒸干（分次加入），殘渣用1mL超純水溶解，并用0.22m濾膜進行過濾。利用高效液相色譜法來測定蔗糖、葡萄糖、果糖的含量。4.2 可溶性糖含量的變化表1 低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片可溶性糖含量的變化 由表1可以看出處理T（晝/夜5/5）的可溶性糖含量大與對照CK(25/25)的可溶性糖含量，同時蔗糖的含量最多，可溶性糖的含量隨著時間的延長

11、表現(xiàn)出先減少后增加的趨勢。5.1 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用馬斯亮藍比色法5，并以牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取0.2g甜瓜葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入1.6ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000r下離心20min，上清液即為酶粗提液。吸取20l提取液，加入0.05M、pH7.8磷酸緩沖液80l，即稀釋成0.1ml提取液；再加入2.9ml考馬斯亮藍G-250溶液，反應(yīng)2min后在595nm下比色，測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量（以100l緩沖液加2.9ml考馬斯亮藍G-250為對照調(diào)零）。按公式1計算樣品可溶性蛋白質(zhì)含量?？扇?/p>

12、性蛋白質(zhì)含量（mg/g）=(CVT)/(WVS1000) 公式1式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白質(zhì)含量（g）；VT為提取液總體積（稀釋后的體積ml）；VS為測定時所用提取液體積（ml，20l）；W為樣品鮮重（g）。5.2可溶性蛋白含量的變化 如圖4，處理組甜瓜幼苗葉片可溶性蛋白含量隨著時間的延長而增加，而且處理組可溶性蛋白的含量比對照組含量高。在處理2d、8d時甜瓜幼苗葉片可溶性蛋白含量分別是對照組的1.5倍、1.9倍，說明低溫脅迫下可溶性蛋白的含量比正常條件下增長的快。（四）小結(jié)與討論 1.H2O2含量的變化及O2.-產(chǎn)生速率與幼苗耐低溫的關(guān)系 SOD（超氧化物歧化酶）、POD（過氧化物酶）、C

13、AT（過氧化氫酶）是植物體內(nèi)活性氧清除劑。SOD是植物酶促防御系統(tǒng)的重要保護酶，它的活性大小與植物的抗寒性密切相關(guān)，因為它能防御或減輕活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害，保護正常代謝。已經(jīng)有不少研究證明，作為植物低溫脅迫下的膜保護酶POD，在植物遭受低溫逆境中，迅速清除或減輕低溫對植物的傷害，而提高抗寒能力。POD酶高植物在保護酶系統(tǒng)中主要起酶促降解過氧化氫的作用，從而使在低溫脅迫的過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)對細胞的迫害，表現(xiàn)出一定的抗逆性。CAT主要存在于過氧化體中，是脅迫條件下針對H2O2的過量產(chǎn)生起調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，作為H2O2的重要清潔劑，在維持H2O2的動態(tài)平衡中起了重要作用。SO

14、D、POD、CAT相互協(xié)調(diào)配合，清除過剩的自由基，使植物體內(nèi)的自由基維持在正常的動態(tài)平衡水平，來提高植物的抗逆性8。本試驗在對H2O2的含量和O2.-的產(chǎn)生速率測定的同時，也對SOD、POD、CAT的活性進行了檢測。結(jié)果表明，而隨著低溫脅迫時間的延長，H2O2的含量和O2.-的產(chǎn)生速率先增加后減少，SOD、POD、CAT的活性也是先增加后降低。SOD、POD、CAT的活性增加的可能原因是低溫(5)處理初期，甜瓜幼苗O2.-的產(chǎn)生速率和H2O2含量增加，誘導(dǎo)了SOD、POD等保護酶活性的提高，從而推測O2.-的產(chǎn)生速率和H2O2含量增加可以提高低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片SOD、POD、CAT的活性，

15、說明低溫脅迫初期H2O2含量的增加可以提高甜瓜幼苗的抗寒性。4d后H2O2的含量和O2.-的產(chǎn)生速率下降的可能原因是低溫脅迫下細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞、呼吸速率減慢導(dǎo)致。2.低溫脅迫對甜瓜幼苗葉片MDA含量的影響及MDA與抗寒性的關(guān)系 MDA是膜脂過氧化分解的產(chǎn)物，MDA的積累能對膜和細胞造成進一步的傷害，通常用其作為膜脂過氧化指標(biāo)來表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)的強弱9。從試驗結(jié)果可以看出，隨著低溫脅迫時間的延長，MDA含量明顯增加，是因為活性氧產(chǎn)生過剩，而導(dǎo)致膜脂氧化作用加強，說明低溫對甜瓜葉片的細胞膜造成了破壞。我們從圖中看到處理組低溫鍛煉后，隨時間的延長MDA含量雖在逐漸增加，但是

16、MDA含量增加的幅度小于對照MDA含量增加的幅度，說明甜瓜幼苗對低溫的敏感性降低，這意味著甜瓜的抗寒性增強。3.低溫脅迫下可溶性糖含量變化與抗寒性的關(guān)系 可溶性糖是細胞內(nèi)的保護物質(zhì)，它能降低冰點，來提高原生質(zhì)保護能力，它保護蛋白質(zhì)膠體避免遇冷變性凝固10。由表1可知，處理組的可溶性糖含量比對照組含量大，并且可溶性糖含量表現(xiàn)出先減少后增加的現(xiàn)象，說明低溫脅迫給甜瓜幼苗生長造成影響，可能因質(zhì)量代謝活動，糖的合成和向其他器官轉(zhuǎn)移平衡被打破，當(dāng)糖含量減少到一定程度時，植物會調(diào)整其自身的代謝迅速提高糖含量，來適應(yīng)逆境環(huán)境。已有研究表明，低溫誘導(dǎo)淀粉水解酶活性，加速淀粉水解，增加可溶性糖的含量，提高細胞液

17、濃度，從而提高抗寒性11。簡令成12認為，在低溫脅迫的初期，植物可能依賴其細胞內(nèi)可溶性糖含量的增加來抵御低溫傷害。因此，可以利用適當(dāng)?shù)牡蜏貙τ酌缣幚硎箍扇苄蕴呛吭黾?，提高滲透調(diào)節(jié)能力，來提高甜瓜的抗寒性。此外，徐躍進13的研究成果表明，隨著溫度的降低，西葫蘆的可溶性糖含量也比一般的品種高。由于甜瓜和西葫蘆都屬于葫蘆科，他們的生理生化是相似的，因此在甜瓜早季節(jié)種植以及溫室大棚種植時，品種的選擇對甜瓜抗寒性也是很重要的。4.可溶性蛋白含量的變化與抗寒性的關(guān)系 已有研究表明，低溫脅迫引起植物細胞蛋白質(zhì)的變化，主要表現(xiàn)在可溶性蛋白和酶類的變化及產(chǎn)生抗寒性蛋白，而可溶性蛋白具有較強的親水性，它能明顯增

18、強細胞的持水力，可溶性蛋白的增加可以束縛更多的水分，減少低溫脅迫下原生質(zhì)因結(jié)冰而受到傷害致死的機會，從而提高植物提抗寒性。本試驗結(jié)果為低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片可溶性蛋白含量增加，表明低溫誘導(dǎo)新蛋白的產(chǎn)生，這可能是機體對低溫環(huán)境適應(yīng)的表現(xiàn)，而新蛋白的產(chǎn)生可有利于甜瓜的抗寒性。（五） 項目難題 本試驗只是對甜瓜葉片的幾種主要代謝產(chǎn)物進行測定，在測定淀粉含量是由于多次滴定碘液測定都沒有出新沉淀，而放棄淀粉含量測定實驗。甜瓜對低溫逆境的適應(yīng)過程極為復(fù)雜，需要多項生理生化過程的統(tǒng)一和協(xié)調(diào)，諸多的生理生化過程之間的相互關(guān)聯(lián)程度以及更深層次的作用機理需要繼續(xù)研究。（六）項目小結(jié) 綜上所述，低溫脅迫初期H2O2含量的增加，可以刺激保護酶活性增強，來減少低溫對甜瓜的傷害。因此，用適當(dāng)濃度的H2O2溶液噴施甜瓜葉片，可以提高甜瓜的抗寒性。低溫脅迫會使MDA含量增加，使細胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，但隨著脅迫時間的延長，MDA含量增加的幅度減慢說明，甜瓜葉片開始適應(yīng)低溫環(huán)境?？扇苄蕴鞘抢浜蛢龊l件下細胞的保護物質(zhì)，其含量與多數(shù)植物抗寒性成正比，可溶性蛋白含量的增加可以增強細胞的滲透調(diào)節(jié)功