二氫黃酮醇4-還原酶基因

1、二氫黃酮醇二氫黃酮醇4 4還原酶基因還原酶基因?qū)W生：焦淑珍導(dǎo)師：劉雅莉2012-12-291 1 二氫黃酮醇二氫黃酮醇4 4還原酶基因的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制還原酶基因的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制 二氫黃酮醇二氫黃酮醇4 4還原酶（還原酶（dihydroflavonol 4dihydroflavonol 4reductasereductase，DFRDFR）屬）屬于于NADPH NADPH 依賴性短鏈還原酶家族，為單基因編碼。最近鑒定了葡萄依賴性短鏈還原酶家族，為單基因編碼。最近鑒定了葡萄（Vitis viniferaVitis vinifera）DFR DFR 的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其是由的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其是由3 3

2、 個(gè)亞基組成的復(fù)合物，個(gè)亞基組成的復(fù)合物， 具有專門的具有專門的NADPH NADPH 結(jié)合域。結(jié)合域。DFR DFR 是花青素生物合成途徑的關(guān)鍵酶，是花青素生物合成途徑的關(guān)鍵酶， 分別分別催化二氫堪非醇（催化二氫堪非醇（dihydrokaempferoldihydrokaempferol，DHKDHK）、二氫櫟皮黃酮）、二氫櫟皮黃酮（dihydroquercetindihydroquercetin，DHQDHQ） 和二氫楊梅黃酮（和二氫楊梅黃酮（dihydromyricetindihydromyricetin，DHMDHM）生成無色花葵素（生成無色花葵素（leucopelargonidinl

3、eucopelargonidin）、無色花青素（）、無色花青素（leucocyanidinleucocyanidin）和無色翠雀素（和無色翠雀素（leucodelphinidinleucodelphinidin），然后這些無色花青素在花色素苷合），然后這些無色花青素在花色素苷合成酶（成酶（anthocyanin synthaseanthocyanin synthase，ANSANS）和類黃酮）和類黃酮3 3O O糖基轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid 3flavonoid 3OglucosyltransferaseOglucosyltransferase，3GT3GT）的作用下合成各種花青素

4、。）的作用下合成各種花青素。由于由于DFR DFR 對(duì)底物的特異性和表達(dá)水平的不同，使植物呈現(xiàn)出各異的花色和對(duì)底物的特異性和表達(dá)水平的不同，使植物呈現(xiàn)出各異的花色和果色果色 DFR DFR屬于屬于NADPHNADPH依賴性的短鏈依賴性的短鏈DFRDFR還原酶超家族還原酶超家族 ，最早于最早于19851985年由年由O O ReillyReilly等從等從玉米玉米(Zeamays)(Zeamays)和和金魚草金魚草(Antirrhinum m “s)(Antirrhinum m “s)中分離出中分離出來來 。隨后，。隨后，BeldBeld等等 在在19891989年又以部分金魚草年又以部分金魚草

5、DFRDFR表型突變基因?yàn)樘奖硇屯蛔兓驗(yàn)樘结樶樂蛛x了矮牽牛分離了矮牽牛(Petunia hybrida)DFR(Petunia hybrida)DFR基因。至今，通過同源克隆等基因。至今，通過同源克隆等方法，已經(jīng)在擬南芥方法，已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsis thaliana)(Arabidopsis thaliana)、蘭花、蘭花(Bromheadia (Bromheadia finlaysoniana)finlaysoniana)、山茶、山茶(Camellia sinensis)(Camellia sinensis)、番茄、番茄(Lycopersiconesculentum)(Lyc

6、opersiconesculentum)和水稻和水稻(Oryza sativa)(Oryza sativa)等植物中分離了等植物中分離了DFRDFR基因?；颉?0032003年年NakatsukaNakatsuka等分析了亞洲百合品種等分析了亞洲百合品種DFRDFR基因的時(shí)空表基因的時(shí)空表達(dá)模式，表明達(dá)模式，表明DFRDFR基因僅在花色素苷著色器官中表達(dá)，并且控制花器基因僅在花色素苷著色器官中表達(dá)，并且控制花器官的顯色模式。官的顯色模式。2 DFR2 DFR基因的分離基因的分離2000年年Aida等等 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法將通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法將DFR基因轉(zhuǎn)移到藍(lán)豬耳中，基因轉(zhuǎn)移

7、到藍(lán)豬耳中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化了反義基因的株系花冠變成淺藍(lán)色，而轉(zhuǎn)化了正義基因的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化了反義基因的株系花冠變成淺藍(lán)色，而轉(zhuǎn)化了正義基因的株系冠檐中的花色減少程度比冠筒的大。株系冠檐中的花色減少程度比冠筒的大。2004年年Fukusaki等等 成功利用成功利用針對(duì)針對(duì)CHS基因的基因的RNA干擾技術(shù)修飾了矮牽牛的花色，這項(xiàng)技術(shù)也可能適干擾技術(shù)修飾了矮牽牛的花色，這項(xiàng)技術(shù)也可能適用于用于DFR基因。基因。3 DFR 3 DFR 同源基因的結(jié)構(gòu)同源基因的結(jié)構(gòu) 不同物種中編碼不同物種中編碼DFR DFR 基因的核苷酸序列也存在種屬特異性，其功能可基因的核苷酸序列也存在種屬特異性，其功能可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和

8、翻譯階段能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯階段。據(jù)。據(jù)GenBank GenBank 上登錄的資料，裂葉牽牛上登錄的資料，裂葉牽牛( I( I nil) nil) 與圓葉牽牛與圓葉牽牛( I( I purpurea) purpurea) 基因組序列都包含基因組序列都包含3 3 個(gè)個(gè)DFR DFR 基基因因: DFR-A: DFR-A、DFR-B DFR-B 與與DFR-CDFR-C，它們呈串聯(lián)排列，并且都是由，它們呈串聯(lián)排列，并且都是由6 6 個(gè)外顯子個(gè)外顯子組成，具有相同的內(nèi)含子剪切位點(diǎn)，組成，具有相同的內(nèi)含子剪切位點(diǎn)，DFR-B DFR-B 基因比基因比DFR-ADFR-A、DFR-C DFR-C 有更長(zhǎng)

9、有更長(zhǎng)的內(nèi)含子序列的內(nèi)含子序列; ; 矮牽?；蚪M矮牽牛基因組中含有中含有3 3 個(gè)個(gè)DFR DFR 基因，分別定位在基因，分別定位在2 2、4 4、6 6 號(hào)染色體上號(hào)染色體上; ; 金魚草、擬南芥金魚草、擬南芥的的DFR DFR 基因由基因由6 6 個(gè)外顯子組成，內(nèi)含子剪個(gè)外顯子組成，內(nèi)含子剪切位點(diǎn)與牽?；ǖ氖且恢碌那形稽c(diǎn)與牽?；ǖ氖且恢碌? ; 高梁高梁基因組中含有基因組中含有2 2 個(gè)個(gè)DFR DFR 基因，呈串聯(lián)基因，呈串聯(lián)排列排列; ; 蔓越橘蔓越橘的基因組含有的基因組含有2 2 個(gè)個(gè)DFR DFR 基因，代表基因，代表2 2 個(gè)不同的座位，在編個(gè)不同的座位，在編碼的氨基酸序列中，

10、碼的氨基酸序列中， 24 24 個(gè)氨基酸有差異。由此可以看出，個(gè)氨基酸有差異。由此可以看出，不同種屬的不同種屬的DFR DFR 氨基酸序列或核苷酸序列存在一定的差異，分析氨基酸序列或核苷酸序列存在一定的差異，分析DFR DFR 同源基因的結(jié)同源基因的結(jié)構(gòu)對(duì)研究其種屬間的功能至關(guān)重。構(gòu)對(duì)研究其種屬間的功能至關(guān)重。 4 DFR 4 DFR 基因底物的特異性基因底物的特異性 DFR DFR 對(duì)底物的特異性和表達(dá)水平不同，使植物呈現(xiàn)出各異的花色和果色。對(duì)底物的特異性和表達(dá)水平不同，使植物呈現(xiàn)出各異的花色和果色。不同來源的不同來源的DFR DFR 對(duì)對(duì)3 3 種底物的親和性有差別種底物的親和性有差別，如

11、矮牽牛，如矮牽牛DFR DFR 主要催化主要催化DHMDHM，其次是其次是DHQDHQ，而對(duì)，而對(duì)DHK DHK 則無作用。在矮牽牛和蘭花則無作用。在矮牽牛和蘭花( Cymbidium hybrida) ( Cymbidium hybrida) 中，中，DFR DFR 能有效催化能有效催化DHQ DHQ 和和DHM DHM 并在花瓣中積累矢車菊素和飛燕草素，但是不能并在花瓣中積累矢車菊素和飛燕草素，但是不能有效地還原有效地還原DHK DHK 。在非洲菊。在非洲菊( Gerbera hybrida) ( Gerbera hybrida) 中，中，DFR DFR 能利用全部能利用全部3 3種二種二

12、氫黃酮醇作為催化底物，是橙色的天竺葵素存在于非洲菊但不存在于矮牽牛氫黃酮醇作為催化底物，是橙色的天竺葵素存在于非洲菊但不存在于矮牽牛中的原因。中的原因。通過矮牽牛、玉米和金魚草等植物通過矮牽牛、玉米和金魚草等植物DFR DFR 基因序列的比對(duì)基因序列的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)DFR DFR 的底物結(jié)合特性是由一段保守序列決定的，其中的底物結(jié)合特性是由一段保守序列決定的，其中134 134 位氨基酸是控制位氨基酸是控制DFRDFR底物結(jié)合特性最為保守的氨基酸殘基底物結(jié)合特性最為保守的氨基酸殘基; Johnson ; Johnson 等也鑒定了等也鑒定了DFR DFR 與底物與底物專一性結(jié)合有關(guān)的區(qū)域，并通

13、過改變?cè)搮^(qū)域的一個(gè)氨基酸使專一性結(jié)合有關(guān)的區(qū)域，并通過改變?cè)搮^(qū)域的一個(gè)氨基酸使DFR DFR 優(yōu)先催化優(yōu)先催化DHKDHK。由此可見，由此可見，DFR DFR 的底物催化選擇性是決定花色的主要原因。的底物催化選擇性是決定花色的主要原因。5 DFR 5 DFR 基因底物特異性的分子基礎(chǔ)基因底物特異性的分子基礎(chǔ) 不同物種的不同物種的DFRDFR與底物的結(jié)合區(qū)域是高度保守的，與底物的結(jié)合區(qū)域是高度保守的，DFR DFR 的氨基酸序列的氨基酸序列決定其底物的種類。研究發(fā)現(xiàn)，決定其底物的種類。研究發(fā)現(xiàn)，其第其第134 134 位的氨基酸殘基直接決定底物位的氨基酸殘基直接決定底物的特異性的特異性。根據(jù)。根

14、據(jù)DFR DFR 的第的第134 134 位氨基酸殘基的種類可分為位氨基酸殘基的種類可分為3 3 種種: :其其134 134 位上有一個(gè)天冬酰胺殘基位上有一個(gè)天冬酰胺殘基( Asn) ( Asn) ，因此被稱為，因此被稱為Asn Asn 型型DFRDFR。其。其134 134 位位上有一個(gè)天冬氨酸殘基上有一個(gè)天冬氨酸殘基( Asp) ( Asp) ，不能有效地把，不能有效地把DHK DHK 還原為無色花葵素，還原為無色花葵素，這一類這一類DFRDFR被稱為被稱為Asp Asp 型型DFRDFR。矮牽牛和蘭花。矮牽牛和蘭花( Bromheadia ( Bromheadia finlaysoni

15、ana)finlaysoniana)的的DFR DFR 屬于這類屬于這類; ;其第其第134 134 位氨基酸殘基既不是天冬位氨基酸殘基既不是天冬酰胺也不是天冬氨酸，因此被稱為酰胺也不是天冬氨酸，因此被稱為非非Asn /Asp Asn /Asp 型型DFRDFR。植物中植物中Asn Asn 型型DFR DFR 分布廣泛，單子葉植物中都是分布廣泛，單子葉植物中都是Asn Asn 型型DFRDFR，Asp Asp 型型DFR DFR 只分布在部只分布在部分雙子葉植物中分雙子葉植物中。此外。此外 , ,只有少數(shù)植物含有非只有少數(shù)植物含有非 Asn Asn Asp Asp 型型 DFR. DFR. 有

16、有些同種植物中的不同些同種植物中的不同 DFR DFR 也分成不同的組也分成不同的組 , ,如豆科植物百脈根的如豆科植物百脈根的DFR1DFR1屬于非屬于非 Asn Asn Asp Asp 型型; DFR2 ; DFR2 和和 DFR3 DFR3 則屬于則屬于Asp Asp 型型; ;而而 DFR4 DFR4 和和 DFR5 DFR5 屬于屬于AsnAsn型型; ;苜蓿的苜蓿的 DFR1 DFR1 屬于屬于Asn Asn 型型, ,而而 DFR2 DFR2則屬于則屬于 Asp Asp 型等型等 在比較在比較幾種重要植物的幾種重要植物的 DFR DFR 時(shí)發(fā)現(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn) 植物界中的大多數(shù)植物界中的大

17、多數(shù) DFR DFR 都是都是 Asn Asn 型型Asp Asp 型和非型和非 Asn Asn Asp Asp 型型 DFR DFR 數(shù)量有限數(shù)量有限 并且在進(jìn)化上分布較遠(yuǎn)由此推測(cè)并且在進(jìn)化上分布較遠(yuǎn)由此推測(cè) Asp Asp 型和非型和非 Asn Asn Asp Asp 型型 DFR DFR 有可能是由有可能是由 Asn Asn 型進(jìn)化來的。型進(jìn)化來的。6 DFR 6 DFR 基因的時(shí)空表達(dá)特性基因的時(shí)空表達(dá)特性不同物種的不同物種的DFR DFR 基因在不同發(fā)育期與不同部位的時(shí)空表達(dá)特性也有所基因在不同發(fā)育期與不同部位的時(shí)空表達(dá)特性也有所不同不同。亞洲百合的。亞洲百合的2 2 個(gè)植株中粉紅色

18、被片帶有斑點(diǎn)的個(gè)植株中粉紅色被片帶有斑點(diǎn)的“Montreux”DFR “Montreux”DFR 基因在著色的被片花藥、花絲、雌蕊和紅色的鱗片中大量表達(dá)，其表基因在著色的被片花藥、花絲、雌蕊和紅色的鱗片中大量表達(dá)，其表達(dá)量隨著花的生長(zhǎng)發(fā)育而增加開花期間達(dá)到最高。而黃色被片無斑達(dá)量隨著花的生長(zhǎng)發(fā)育而增加開花期間達(dá)到最高。而黃色被片無斑“ConnecticutKing”“ConnecticutKing”的的DFR DFR 基因僅在著色的花藥與紅色的鱗片中表達(dá)，基因僅在著色的花藥與紅色的鱗片中表達(dá)，在在2 2 個(gè)植株的未著色的葉子、莖與白色的鱗片中都沒有檢測(cè)到個(gè)植株的未著色的葉子、莖與白色的鱗片中都

19、沒有檢測(cè)到DFDF基因基因的表達(dá)。可見，的表達(dá)。可見，DFRDFR基因僅在花色素苷著色的器官中表達(dá)，并且此種基基因僅在花色素苷著色的器官中表達(dá)，并且此種基因的表達(dá)與花色素苷的產(chǎn)生相協(xié)調(diào)。百脈根因的表達(dá)與花色素苷的產(chǎn)生相協(xié)調(diào)。百脈根( Lotus japonicus) ( Lotus japonicus) 的基的基因組中存在著因組中存在著5 5 個(gè)個(gè)DFR DFR 因，能產(chǎn)生因，能產(chǎn)生6 6 個(gè)具有功能的個(gè)具有功能的mRNAmRNA，具有不同的，具有不同的組織特異性。組織特異性。Shimada Shimada 等檢測(cè)了百脈根的果實(shí)等檢測(cè)了百脈根的果實(shí)( ( 種子和豆莢種子和豆莢) ) 、花、花、

20、莖、葉、根和根瘤中的莖、葉、根和根瘤中的DFR DFR 基因的表達(dá)效果，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)效果，發(fā)現(xiàn)DFR1 DFR1 存在于所有器存在于所有器官里，官里，DFR2 DFR2 主要積累在除了葉的其他器官中，而主要積累在除了葉的其他器官中，而DFR3 DFR3 只在莖和葉中只在莖和葉中特異表達(dá)，特異表達(dá)，DFR4 DFR4 和和DFR5 DFR5 除了根中微量表達(dá)外主要在地上部分。除了根中微量表達(dá)外主要在地上部分。這些這些研究結(jié)果表明研究結(jié)果表明DFR DFR 基因表達(dá)主要伴隨著花瓣組織著色的進(jìn)行，它的時(shí)基因表達(dá)主要伴隨著花瓣組織著色的進(jìn)行，它的時(shí)空表達(dá)特性與種屬特異性有關(guān)。研究顯示，不同物種的空表

21、達(dá)特性與種屬特異性有關(guān)。研究顯示，不同物種的DFR DFR 基因表達(dá)基因表達(dá)特性研究對(duì)該基因的轉(zhuǎn)基因遺傳操作具有重要意義。特性研究對(duì)該基因的轉(zhuǎn)基因遺傳操作具有重要意義。7 DFR 7 DFR 結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子 植物基因啟動(dòng)子是重要的順式作用元件植物基因啟動(dòng)子是重要的順式作用元件 ，位于結(jié)構(gòu)基因，位于結(jié)構(gòu)基因 5 5端上游端上游區(qū)，指導(dǎo)全酶與模板的正確結(jié)合?；罨瘏^(qū)，指導(dǎo)全酶與模板的正確結(jié)合?；罨?RNA RNA 聚合酶，決定轉(zhuǎn)錄的方向聚合酶，決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率，直接影響基因的表達(dá)。和效率，直接影響基因的表達(dá)。 六倍體小麥有六倍體小麥有 3 3 種種 DFR DFR 基因基因 T

22、aDFRTaDFRA TaDFRA TaDFRB TaDFRB TaDFRC C 分別分別位于染色體位于染色體 3A3A，3B 3B 和和 3D3D上，都有上，都有 3 3 個(gè)內(nèi)含子。在個(gè)內(nèi)含子。在 3 3 種種DFR DFR 基因啟基因啟動(dòng)子序列中存在動(dòng)子序列中存在 Myb Myb 類轉(zhuǎn)錄因子類轉(zhuǎn)錄因子P P的結(jié)合位點(diǎn)，它和的結(jié)合位點(diǎn)，它和 G Gbox box 的核心元的核心元件共同調(diào)控件共同調(diào)控 DFR DFR 基因的表達(dá)，這一結(jié)構(gòu)可能調(diào)控小麥基因的表達(dá)，這一結(jié)構(gòu)可能調(diào)控小麥 DFR DFR 基因的組織基因的組織特異性表達(dá)，在特異性表達(dá)，在 TaDFRTaDFRB B 中有中有 3 3

23、個(gè)這種元件。而個(gè)這種元件。而 TaDFRTaDFRA A 和和TaDFRTaDFRC C 只有只有2 2個(gè)，因此個(gè)，因此 TaDFRTaDFRB B 的表達(dá)量要比其他的表達(dá)量要比其他2 2種種 DFR DFR 基因在小麥基因在小麥的子葉的子葉 根和種皮等器官中的表達(dá)量高。根和種皮等器官中的表達(dá)量高。 葡萄葡萄 DFR DFR 基因的啟動(dòng)子含有基因的啟動(dòng)子含有 G Gbox box 類元件類元件 bZIP bZIP 和和 Myb Myb 類轉(zhuǎn)錄類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)葡萄的啟動(dòng)子和因子的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)葡萄的啟動(dòng)子和 uidA uidA 葡糖苷酶融合構(gòu)成融合葡糖苷酶融合構(gòu)成融合體，共同調(diào)節(jié)體，共

24、同調(diào)節(jié) DFR DFR 基因的表達(dá)基因的表達(dá) 3 3 種調(diào)控因子共同作用使葡萄種調(diào)控因子共同作用使葡萄 DFR DFR 基基因在根，莖和葉等幾乎所用組織中都有表達(dá)。因在根，莖和葉等幾乎所用組織中都有表達(dá)。 將葡萄將葡萄 DFR DFR 基因的啟動(dòng)子與基因的啟動(dòng)子與 GUS GUS 基因融合后轉(zhuǎn)化紅色蘋果細(xì)基因融合后轉(zhuǎn)化紅色蘋果細(xì)胞懸浮體系，能夠檢測(cè)到胞懸浮體系，能夠檢測(cè)到 GUS GUS 和和 uidA uidA 基因的表達(dá)，同時(shí)基因的表達(dá)，同時(shí) DFR DFR 基基因的表達(dá)量增加。因的表達(dá)量增加。8 DFR 8 DFR 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 迄今發(fā)現(xiàn)的花青素合成調(diào)節(jié)因子主要包括迄今發(fā)

25、現(xiàn)的花青素合成調(diào)節(jié)因子主要包括 Myb Myb 轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子，Myc Myc 家族的家族的 bHLH bHLH 轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄因子和 WD40 WD40 蛋白。其中蛋白。其中 Myb Myb 轉(zhuǎn)錄因子含有保轉(zhuǎn)錄因子含有保守的守的 DNA DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 每個(gè)每個(gè) Myb Myb 結(jié)構(gòu)域約含結(jié)構(gòu)域約含 515152 52 個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸殘基，包含一系列高度保守的殘基和間隔序列，并含有特異的殘基，包含一系列高度保守的殘基和間隔序列，并含有特異的 DNA DNA 序列識(shí)別區(qū)和啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)。如玉米的序列識(shí)別區(qū)和啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)。如玉米的 C1 P1 C1 P1 和和 P P基因；基因；bHLH bHLH 家族蛋白都有一個(gè)螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域和家族蛋白都有一個(gè)螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域和 4 4 個(gè)保守功個(gè)保守功能區(qū)域能區(qū)域 bHLH bHLH 轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到特異的轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到特異的 DNA DNA 序列上。某些序列上。某些 bHLH bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在花青素途徑調(diào)控中需要與轉(zhuǎn)錄因子在花青素途徑調(diào)控中需要與 Myb Myb 類轉(zhuǎn)錄因子共同類轉(zhuǎn)錄因子共同作用，如金魚草作用，如金魚草 Delila Delila 基因?；颉D40 WD40 重復(fù)