【精品文檔】端粒和端粒酶ppt課件

1、端粒和端粒酶Telomeres and Enzyme TelomeraseTelomeres and Enzyme Telomerase武漢大學(xué)藥學(xué)院 郝春霖B 端粒酶telomerase C 科學(xué)思想Scientific thoughtsA 端粒telomeres Puzzles 1pDNA聚合酶特點(diǎn)(引物 方向53)p染色體復(fù)制之初可以由小RNA作引物起始合成,之后DNA聚合酶能以反鏈DNA為模板,以前合成的DNA為引物,合成新的DNA取代染色體中間的RNA引物;p線性染色體最末端的RNA引物無法被取代;p末端隱縮端 粒telomeres Assumptions 1.復(fù)制前聯(lián)體、環(huán)化lin

2、earcircle2.發(fā)卡構(gòu)造3.可變末端alterable terminal多個短反復(fù)序列(short repetitive sequences)4.蛋白質(zhì)干涉端 粒telomeres Puzzles 2 1939年,潛心玉米遺傳性狀研討的 Barbara McClintock (因發(fā)現(xiàn)玉米的轉(zhuǎn)座子獲諾貝爾學(xué)獎)留意到:在減數(shù)分裂后期偶爾產(chǎn)生的染色體斷裂很容易重新交融起來構(gòu)成“橋,在緊接著的有絲分裂中,這種染色體“斷裂-交融-橋-斷裂的循環(huán)不斷繼續(xù)。為什么染色體的自然末端不容易相互交融？端 粒telomeres 染色體的自然末端不同于非正常的DNA斷裂末端,它有一個特殊的構(gòu)造來防止染色體之間

3、的相互交融. 科學(xué)家Hermann Muller將這種特殊構(gòu)造命名為端粒(Telomere,在希臘語中,telos表示末端,meros表示片段).Assumptions 端 粒telomeres Experiments Elizabeth Blackburn端 粒telomeres 四膜蟲四膜蟲是一種特殊的方式生物，有兩個細(xì)胞核。小核很穩(wěn)定，含5對染色體，用于生殖傳代；而大核在接合細(xì)胞的發(fā)育過程中，染色體可斷裂成200300個小染色體，端粒非常豐富。端 粒telomeres Elizabeth Blackburn 1978年，Elizabeth Blackburn利用四膜蟲純化了rDNA,以r

4、DNA為模板經(jīng)過體外合成摻入dNTP的實(shí)驗(yàn)，推斷出四膜蟲的染色體上有由許多反復(fù)的5-CCCCAA-3六堿基序列組成的特殊構(gòu)造區(qū)域，此區(qū)域即端粒。端 粒telomeres 人工染色體 1980年，Elizabeth Blackburn在會議上對這一艱苦發(fā)現(xiàn)的報告,引起了Jack Szostak的極大興趣。 他那時候正試圖在釀酒酵母中構(gòu)建人工線性染色體，讓它可以在細(xì)胞中像自然染色體一樣復(fù)制。但當(dāng)環(huán)狀質(zhì)粒線性化并轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，很快就被降解掉。 端 粒telomeres 端粒序列的發(fā)現(xiàn)使Jack Szostak有時機(jī)把線性質(zhì)粒末端銜接到四膜蟲的端粒DNA ，然后再倒入酵母細(xì)胞中。奇觀發(fā)生了：線性質(zhì)粒不再

5、被降解，而是在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并復(fù)制。 這是人工染色體的最早雛形，它使得DNA的大片段克隆成為能夠，后來為人類基因組測序任務(wù)立下了汗馬功績。人工染色體端 粒telomeres 端 粒-穩(wěn)定線性染色體的末端構(gòu)造pDef. 存在于染色體末端的一段特殊的DNA反復(fù)序列p端粒和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中；p不同種類細(xì)胞的端粒反復(fù)單位不同，大多長約58bp;p端粒的構(gòu)造與功能具有保守性.端 粒telomeres 端粒的功能端 粒telomeres ABCDETPE效應(yīng)固定染色體位置維護(hù)染色體末端防止染色體復(fù)制時喪失決議細(xì)胞壽命端粒酶活性的發(fā)現(xiàn) Liz女士的實(shí)驗(yàn)室在研討四膜蟲端粒

6、序列的過程中還發(fā)現(xiàn)了一個有趣的景象:帶著四膜蟲端粒DNA的人工染色體導(dǎo)入到酵母后,被加上了酵母的端粒而不是四膜蟲的端粒序列. 由于端粒是由反復(fù)序列組成的,當(dāng)時人們普遍猜測同源重組是延伸端粒補(bǔ)償染色體末端隱縮的機(jī)制.但是同源重組只能復(fù)制出更多本身的序列,為什么在四膜蟲端粒上加的是酵母的端粒序列而不是四膜蟲本身的序列呢?這個景象是同源重組無力解釋的.端 粒 酶telomerase Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的實(shí)驗(yàn) 四膜蟲在接合細(xì)胞的大核發(fā)育過程中,大核產(chǎn)生了非常豐富的小染色體,每一個小染色體都在末端加上了端粒,可以推測:假設(shè)“酶的假說成立,此時細(xì)胞內(nèi)的

7、酶活性應(yīng)該是非常高的.重組 or 酶?端 粒 酶telomerase 用四膜蟲的核抽提液與體外的端粒DNA進(jìn)展溫育,試圖在體外檢測到這個酶的活性,看到端粒的延伸. Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的實(shí)驗(yàn)端 粒 酶telomerase 經(jīng)過不斷優(yōu)化條件,尤其是把底物換成體外合成的高濃度的端粒DNA后,Carol經(jīng)過曝光x光片,清楚地看到了“酶的活性:在測序膠的同位素曝光片上,端粒底物明顯被重新加上了DNA堿基,而且每六個堿基構(gòu)成一條很深的帶,與四膜蟲端粒反復(fù)根本單位為六個堿基正好吻合. Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider

8、 的實(shí)驗(yàn)端 粒 酶telomerase 這種酶活性不依賴于DNA模板,只對四膜蟲和酵母的端粒DNA進(jìn)展延伸,而對隨即序列的DNA底物不延伸;并且該活性不依賴于DNA聚合酶. 而同源重組對序列沒有特異性要求,并且依賴于DNA聚合酶的活性. 至此,她們廓清了這兩種假說,證明了有一種酶來延伸端粒DNA,即端粒酶(telomerase)Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的實(shí)驗(yàn)端 粒 酶telomerase Nobel Prize in Medicine Awarded for Creaking DNA Puzzle端粒酶亞基Liz實(shí)驗(yàn)室與Tom Cech協(xié)作,對端

9、粒酶活性進(jìn)一步定性.用RNA酶處置樣品,降解樣品的RNA酶活性消逝用蛋白酶消化酶活性消逝 端 粒 酶telomerase RNA亞基有一段RNA序列正好和四膜蟲的端粒DNA序列互補(bǔ),端粒酶正式利用RNA亞基的這段序列作為模板反復(fù)復(fù)制出端粒DNA端粒酶RNA亞基的發(fā)現(xiàn)端 粒 酶telomerase Daniel Gottschling Daniel Gottschling利用利用TPETPE效應(yīng)設(shè)計出實(shí)驗(yàn)效應(yīng)設(shè)計出實(shí)驗(yàn), ,挑選酵母挑選酵母RNARNA亞基基因亞基基因: : 把把URAURA和和ADEADE連個基因經(jīng)過遺傳重組的方法置入端粒區(qū)連個基因經(jīng)過遺傳重組的方法置入端粒區(qū)域域, ,由于由于

10、TPETPE效應(yīng)效應(yīng),URA,URA和和ADEADE不表達(dá)不表達(dá). . 酵母只能在含有酵母只能在含有uraciluracil的培育基中生長的培育基中生長, ,且克隆是紅色的且克隆是紅色的. . 再轉(zhuǎn)入再轉(zhuǎn)入cDNAcDNA表達(dá)庫表達(dá)庫, ,某些調(diào)控端粒長度的基因經(jīng)過過表某些調(diào)控端粒長度的基因經(jīng)過過表達(dá)可以改動端粒的長度達(dá)可以改動端粒的長度. .假設(shè)端粒長度變得足夠短假設(shè)端粒長度變得足夠短,TPE,TPE效應(yīng)就會消逝效應(yīng)就會消逝,URA,URA和和ADEADE兩個基因就會啟動表達(dá)兩個基因就會啟動表達(dá). . 這種短端粒的酵母可以在不含有這種短端粒的酵母可以在不含有uraciluracil的培育基中

11、生長的培育基中生長, ,并且酵母克隆顯示出白色并且酵母克隆顯示出白色端粒酶RNA亞基的發(fā)現(xiàn)端 粒 酶telomerase 端粒酶催化亞基 端粒酶既然可以利用RNA模板亞基來復(fù)制DNA,那么很容易推測這個蛋白亞基能夠具有RNA dependent DNA polymerase活性(依賴于RNA的DNA聚合酶活性),即逆轉(zhuǎn)錄酶活性.更進(jìn)一步說,它的蛋白質(zhì)序列里應(yīng)該包含逆轉(zhuǎn)錄酶特有的構(gòu)造區(qū)域. ETS1 ETS2 ETS3 ETS4(CD13) 體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)共表達(dá)了端粒酶的催化亞基和RNA亞基,在體外重建了端粒酶活性端 粒 酶telomerase Nature:端粒酶的活化勝利逆轉(zhuǎn)未老先衰實(shí)驗(yàn)

12、鼠衰老過程哈佛科學(xué)家最近破天荒地令年老的老鼠器官獲得新生，勝利逆轉(zhuǎn)衰老過程，這項(xiàng)突破成果或有望防治腦退化癥(老人癡呆癥)、糖尿病和心臟病等疾病，甚至有望翻開永久青春的奧妙，進(jìn)一步邁向研制“長生不老藥。研討員豢養(yǎng)了一些經(jīng)基因改造的老鼠，令它們因缺乏“端粒而未老先衰，出現(xiàn)嗅覺衰退、腦部減少、不育、腸部和脾臟受損等疾病，使它們皮膚、大腦、內(nèi)臟和其它器官老化。 將這些老鼠分為兩組，把一種名為“TERT的定時釋放藥物，植入其中一組老鼠的皮下，重啟它們體內(nèi)休眠的“端?；颉?結(jié)果在短短2個月內(nèi)，有注射TERT的老鼠體內(nèi)長出許多新的細(xì)胞，主要器官運(yùn)作功能改善，身體差不多完全“返老還童，當(dāng)中雄性的老鼠更恢復(fù)生

13、育功能。實(shí)驗(yàn)鼠最終活到正常鼠的壽命，但并不比普通鼠壽命長。 進(jìn)展研討的德皮尼奧博士表示，實(shí)驗(yàn)鼠對人類而言，就像一個40歲的人，身體未老先衰像80多歲的老人，而這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)?zāi)孓D(zhuǎn)衰老過程，把他變回50歲普通。 德皮尼奧說：“這些是嚴(yán)重衰老的動物，但經(jīng)過一個月治療后，它們已有詳細(xì)康復(fù)跡象，包括腦部長出新的細(xì)胞。他指出，這是初次有老鼠實(shí)驗(yàn)勝利把衰老過程逆轉(zhuǎn)，意味著一些老化的器官也有“重生的能夠。 不過，要把這一科技運(yùn)用于人體身上將會較為困難，老鼠終身中都能制造端粒，但是人類到成年后便會自動“關(guān)掉這種，從而阻止細(xì)胞增長失控，以免轉(zhuǎn)化成癌癥。因此，提升人體的“端粒程度雖然或有助減緩衰老速度，但同時添加患癌的風(fēng)險。 德皮尼奧以為，“TERT療法假設(shè)是分階段進(jìn)展，和只用于身體沒有癌細(xì)胞及較為年青的人身上，療法或?qū)θ梭w平安。牛津大學(xué)生物化學(xué)家考克斯以為，這項(xiàng)研討“非常重要，證明原那么上短期恢復(fù)成人體內(nèi)的“端粒，能令年老的組織重生和恢復(fù)生理功能。 科學(xué)思想pPuzzlespAssumptionsp方式生物p生化技術(shù)p靜心閱讀文獻(xiàn)和縝密思索,找出問題的關(guān)鍵,并對課題進(jìn)展精心討論和設(shè)計 Time will tell which connections between telomerase and health will endure We did not set out to find a new