第五章 藥用植物分子鑒定

1、試講人：田恩偉科室：藥植與中藥鑒定教研室Molecular Identification of Medicinal Molecular Identification of Medicinal PlantsPlants中藥材市場假藥多1. 了解遺傳標(biāo)記定義、類型、優(yōu)缺點，掌握分子遺傳標(biāo)記定義、原理和在藥用植物鑒定中的應(yīng)用。熟悉PCR的原理和步驟。2. 掌握常用的分子標(biāo)記（RFLP、RAPD、SSR、ISSR、SNP）原理和方法。3. 重點掌握藥用植物分子鑒定的方法和流程（以柴胡為例）。定義：由一對等位基因差異造成的，能夠明確區(qū)分，遺傳傳遞過程可以跟蹤的相對性狀或生物特征。如形態(tài)上的質(zhì)量性狀：花瓣

2、顏色、種子顏色、葉片顏色、葉片形狀、種子形狀等。遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見的外部特征-遺傳與環(huán)境、結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因綜合作用的結(jié)果，這種標(biāo)記可以用于研究物種間關(guān)系、分類和鑒定。l如植株高矮、花瓣顏色、葉片顏色、葉片形狀、種子形狀等。v優(yōu)點：簡單、直觀v缺點：僅對個體性狀的描述，得出的結(jié)論不完善；另外數(shù)量性狀易受環(huán)境影響。 遺傳標(biāo)記的類型遺傳標(biāo)記的類型孟德爾豌豆雜交試驗所研究的七對性狀都是典型的形態(tài)學(xué)遺傳標(biāo)記染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型如數(shù)目、大小、著絲點位置變異等。v優(yōu)點：直觀、快速而經(jīng)濟v缺點：但變異十分有限，當(dāng)染色體數(shù)目形態(tài)相似時難以分辨。 王喻寧等，2013生化標(biāo)記：指把植物體內(nèi)的

3、某些生化性狀作為遺傳標(biāo)記，如貯藏蛋白、同工酶等。這種標(biāo)記可用于繪制“指紋圖譜”進行植物系統(tǒng)發(fā)育、親緣關(guān)系和種類鑒定研究。同工酶：指夠催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但分子結(jié)構(gòu)、理化特性等不同的一組酶。3. 3. 生化標(biāo)記（生化標(biāo)記（Biochemical MarkersBiochemical Markers）v優(yōu)點：經(jīng)濟、方便、成本較低v缺點：結(jié)構(gòu)基因表達產(chǎn)物，對非結(jié)構(gòu)基因無能為力；所檢測位點只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時受發(fā)育時期和環(huán)境影響。4. 4. 分子標(biāo)記（分子標(biāo)記（molecular markersmolecular markers） 分子標(biāo)記是指能夠被檢測出來的DNA序列上的遺傳多態(tài)性（等位

4、差異）。TCTTGG GAGACTCACTATAGGCTACGCTACGCGTACATCAGATAG| | |TCTTGT TAGACTCACTATAG.GCGTACATCAGATAG品種品種1 1品種品種2 2堿基差異堿基差異長度差異長度差異兩個步驟：獲得目標(biāo)DNA片段：酶切，擴增（PCR）檢測不同樣品間目標(biāo)片段的差異（多態(tài)性）：電泳，分子雜交，DNA芯片（高通量）TCTTGG GAGACTCACTATAGGCTACGCTACGCGTACATCAGATAG| | |TCTTGT TAGACTCACTATAG.GCGTACATCAGATAG電泳方向電泳方向品種品種1 1品種品種2 2品種品種1

5、 1品種品種2 2長度差異片段電泳檢測長度差異片段電泳檢測：本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點：（1）不受季節(jié)、環(huán)境、基因表達與否的限制；（2）多態(tài)性高，存在著豐富的等位變異； （3）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個基因組；（4）多數(shù)分子標(biāo)記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。遺傳學(xué)上，把共顯性定義為F1代中，雙親的性狀同時表現(xiàn)的現(xiàn)象。共顯性能夠?qū)㈦s合體和純合體從表現(xiàn)上區(qū)分開。共顯性：F1P1F1通過比較藥用植物種間DNA分子遺傳多樣性差異來鑒別其種類的方法。 狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium 北柴胡Bupleurum chinenseChao et al.

6、 2014 Phytomedicine 中國柴胡有42種，17變種DNA分子標(biāo)記技術(shù)直接分析生物的基因型，與上述傳統(tǒng)的方法比較，具有下列優(yōu)點：遺傳穩(wěn)定性：DNA分子作為遺傳信息的直接載體，不受外界因素和生物體發(fā)育階段及器官組織差異的影響，每一個體的任一體細胞均含有相同的遺傳信息。因此，用DNA分子特征作為遺傳標(biāo)記進行物種鑒別更為準確可靠。遺傳多樣性：DNA分子是由G、A、C、T四種堿基構(gòu)成，為雙螺旋結(jié)構(gòu)的長鏈狀分子，生物體特定的遺傳信息便包含在特定的堿基排列順序中，不同物種遺傳上的差異表現(xiàn)在這4種堿基排列順序的變化，這就是生物的遺傳多樣性(genetic diversity)。比較物種間DNA

7、分子的遺傳多樣性的差異來鑒別物種就是DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別(identification by DNA molecular genetic marker)?；瘜W(xué)穩(wěn)定性：DNA分子作為遺傳信息的載體，除具有較高的遺傳穩(wěn)定性外，在諸多的生物大分子中，比蛋白質(zhì)、同功酶等具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性。不象蛋白質(zhì)和同功酶那樣，在生物體死亡后，很快失去生物活性，并迅速降解。在陳舊標(biāo)本中所保存下來的DNA仍能夠用于DNA分子遺傳標(biāo)記的研究。4.4 分子標(biāo)記的類型分子標(biāo)記的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段，也稱為三代DNA分子標(biāo)記：第一代分子標(biāo)記（以分子雜交為核心）：RFLP；第二代分子標(biāo)記（以PCR為核心）：RAPD；AFLP；

8、SSR；ISSR分子標(biāo)記第三代分子標(biāo)記（以DNA測序為核心）：單核苷酸多態(tài)性 (SNP)；表達序列標(biāo)簽(EST)；ITSPCR定義：是一種模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程的體外酶促合成特異性核酸片段的技術(shù)。PCR原理：以待擴增的兩條DNA鏈為模板，由一對人工合成的寡核苷酸引物(15-25堿基)介導(dǎo)，通過DNA聚合酶酶促反應(yīng)，在體外進行特異DNA序列擴增。PCRPCR三步驟三步驟模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右5 min，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的

9、互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物于72左右在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。 小結(jié)與思考小結(jié)與思考小結(jié)：小結(jié)：1. 四種類型遺傳標(biāo)記中，分子標(biāo)記具有其他遺傳標(biāo)記無法比擬的有點，遺傳穩(wěn)定性、多態(tài)性、化學(xué)穩(wěn)定性，在藥用植物或生藥鑒定中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記。2. PCR技術(shù)是分子標(biāo)記的基礎(chǔ)，PCR原理和步驟為：變性-退火-延伸。思考：思考： 1.分子標(biāo)記進行藥用植物鑒定依據(jù)的是什么？ 2.與三種傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記相比，分子標(biāo)記優(yōu)勢體現(xiàn)在哪些方面？ 3.理解PCR的原理和步驟。 參考書及

10、相關(guān)文獻資料參考書及相關(guān)文獻資料參考書：1.中藥生物工程,主編:高文遠,上海科學(xué)技術(shù)出版社.2中藥現(xiàn)代生物技術(shù),主編:胡之璧,人民衛(wèi)生出版社.3.中藥生物技術(shù),主編:賈景明,化學(xué)工業(yè)出版社.參考文獻： 1.徐紅, 王崢濤, 胡之璧.中藥DNA分子鑒定技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用J.中藥現(xiàn)代化, 2003,5(2):24-30.2. 海學(xué)忠.DNA分子標(biāo)記在中藥鑒定中的應(yīng)用進展J.中外健康文摘, 2012, 9(35):442-446.3.陳士林,郭寶林,張貴君等.中藥鑒定學(xué)新技術(shù)新方法研究進展J.中國中藥雜志, 2012, 37(8):1043-1055. 第二節(jié)常用的分子標(biāo)記1. 限制性片段長度多態(tài)性（

11、RFLP）RFLP原理： 基因組DNA經(jīng)限制酶切，可產(chǎn)生大量長短不一的片段。通過電泳可以將這些片段分離開。片段長的遷移速度慢，短的遷移速度快。 如果一對等位基因（序列）的限制酶切片段長度不同，則稱為RFLP。以標(biāo)有放射性同位素或化學(xué)標(biāo)記物質(zhì)、來自特定基因座的DNA片段為探針，可以檢驗該座位是否存在多態(tài)性。RFLP原理示意圖左邊：等位序列酶切電泳的結(jié)果右邊：用探針檢驗的結(jié)果。1.1 產(chǎn)生RFLP的原因點突變：單個堿基的改變（轉(zhuǎn)換或顛換），造成失去某個酶切位點或產(chǎn)生一個新的酶切位點，使突變型酶切片段變長或變短。插入突變：使突變型酶切片段變長。缺失突變：使突變型酶切片段變短。1.2 RFLP的檢測方

12、法酶切 電泳 Southern雜交 放射自顯影結(jié)核分枝桿菌基因組RFLP圖譜 uRFLP的優(yōu)點標(biāo)記廣泛存在于生物體內(nèi)，不受組織、環(huán)境和發(fā)育階段的影響。RFLP 標(biāo)記的等位基因是共顯性的，不受雜交的影響，可區(qū)分純合基因與雜合基因。可產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目很多，可覆蓋整個基因組。uRFLP的缺點標(biāo)記技術(shù)需要酶切，對DNA 質(zhì)量要求高；RFLP 的多態(tài)性程度偏低；分子雜交時會用到放射性同位素，對人體和環(huán)境都有害；探針的制備、保存和發(fā)放也很不方便；分析程序復(fù)雜、技術(shù)難度大、費時、成本高。1.遺傳學(xué)圖的構(gòu)建 結(jié)合RFLP連鎖圖，任何能用RFLP探針檢測出的基因及其DNA片段都可以通過回交，快速有效地進行轉(zhuǎn)移。2

13、.基因定位 利用RFLP技術(shù)能夠準確地標(biāo)記定位種質(zhì)中的目標(biāo)基因，結(jié)合雜交，回交及組織培養(yǎng)等技術(shù)就可以快速有效的將所需目標(biāo)基因的DNA片段引入栽培品種中，實現(xiàn)品種改良。3.遺傳多態(tài)性分析 運用RFLP技術(shù)可以盡可能多地保存那些在已知位點上有異態(tài)的品系，以求最大程度地保持品種的多樣性。4.細胞質(zhì)遺傳研究 RFLP技術(shù)是對DNA序列自然變異的直接檢測，只需選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶或DNA探針作分子標(biāo)記，因而對植物不同種屬或雜種后的細胞質(zhì)遺傳變異及基因型的鑒定具有較高的靈活性和靈敏性，從而能較好地應(yīng)用于細胞質(zhì)遺傳的研究。2.隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）RAPD原理：建立于PCR基礎(chǔ)之上，使用一系列具

14、有10個左右堿 基 的 單 鏈 隨 機 引 物 ， 以 較 低 的 退 火 溫 度（36），對基因組的DNA全部進行PCR擴增，以檢測多態(tài)性。由于整個基因組存在眾多反向重復(fù)序列，因此須對每一隨機引物單獨進行PCR。單一引物與反向重復(fù)序列結(jié)合，使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴增。引物結(jié)合位點DNA序列的改變以及兩擴增位點之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導(dǎo)致擴增片段數(shù)目和長度的差異，經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后通過EB(溴化乙錠)染色以檢測DNA片段的多態(tài)性。RAPD原理示意圖OPA1: 5-CAGGCCCTTC-3 OPD11: 5-AGCGCCATTG-3 OPD8: 5-GTGTGCCC

15、CA-3 OPD11OPD8OPA11 北柴胡(陜西) 2 北柴胡(河北) 3 竹葉柴胡 4 大葉柴胡 5 小葉黑柴胡 6 狹葉柴胡 M MarkerRAPD的應(yīng)用-分類鑒定RAPD analysis of 27 safflower accessions from eight different geographical regions with Operon primer AA-04. AA-04 produced seven polymorphic bands Lanes 1 and 26: ladder 1 Kb; Lanes 2 to 27: melon. Arrows indicat

16、e polymorphic markers used for analysis. RAPD的優(yōu)點：技術(shù)簡單，實驗周期短，信息量大，檢測速度快；DNA用量少；實驗設(shè)備簡單，不需DNA探針，設(shè)計引物也不需要預(yù)先克隆標(biāo)記或進行序列分析；不依賴于種屬特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，合成一套引物可以用于不同生物基因組分析；用一個引物就可擴增出許多片段，幾乎覆蓋整個基因組，而且不需要同位素，安全性好。RAPD缺點：顯性遺傳，不能識別雜合子位點，這使得遺傳分析相對復(fù)雜，在基因定位、作連鎖遺傳圖時，會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準確性下降；RAPD對反應(yīng)條件相當(dāng)敏感，包括模板濃度、Mg2+濃度，所以實驗的穩(wěn)定

17、性和重復(fù)性差。在 R A P D 和 R F L P 技 術(shù) 基 礎(chǔ) 上 建 立 了SCAR(Sequence characterized amplified r e g i o n s ， 序 列 特 異 性 擴 增 區(qū) 域 ) ，CPAS(Cleaved polymorphic amplified sequence，酶切擴增多態(tài)序列)和DAF(DNA amplified fingerprints，DNA擴增指紋)等標(biāo)記技術(shù)。這些技術(shù)的出現(xiàn)，進一步豐富和完善了第一代分子標(biāo)記，增加了DNA多態(tài)性的研究手段。SSR原理：u在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復(fù)序列，如重復(fù)單位長度在1565個核苷

18、酸的小衛(wèi)星DNA，重復(fù)單位長度在26個核苷酸的微衛(wèi)星DNA。u小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位點。由于重復(fù)單位的大小和序列不同以及拷貝數(shù)不同,從而構(gòu)成豐富的長度多態(tài)性。 定義：SSR （全稱為簡單序列長度多態(tài)性標(biāo)記）也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(多為15個) 堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA 序列，其中最常見的是雙核苷酸重復(fù)，即(CA) n和(TG) n，每個微衛(wèi)星DNA 的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目1060個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。l根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的特定短序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴增微衛(wèi)星片段。由于核心序列重復(fù)數(shù)目不同，因而擴增出不同長度的PC

19、R產(chǎn)物，這是檢測DNA 多態(tài)性的一種有效方法。l微衛(wèi)星序列在群體中通常具有很高的多態(tài)性，而且一般為共顯性，因此是一類很好的分子標(biāo)記。 SSRSSR：以：以2 26 6個堿基為單位的短重復(fù)序列個堿基為單位的短重復(fù)序列CAAGATCTTGGATTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCGTACATCAGATAG| |CAAGATCTTGGATTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTC.CGTACATCAGATAG上游引物上游引物下游引物下游引物SSR長度（重復(fù)數(shù)）長度（重復(fù)數(shù)）容易產(chǎn)生變異容易產(chǎn)生變異相對保守相對保守相對保守相對保守在SSR序列上設(shè)計引物PCR檢測

20、相鄰SSR位點之間區(qū)段的長度多態(tài)性穩(wěn)定性比RAPD好SSRSSR上游引物下游引物SNP原理：SNP主要是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性。也即SNP 是同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化。 主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換或顛換、以及單堿基的插入或缺失等。5. 單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)數(shù)量非常豐富，有廣闊應(yīng)用前景。數(shù)量非常豐富，有廣闊應(yīng)用前景。CAAGACAAGAT TCTTGGAGACTCTTGGAGACTC CACTATAGGCTACGCGTACATCACTATAGGCTACGCGTACATCA AG

21、ATAGGATAG | | | | | | | | | |CAAGACAAGAC CCTTGGAGACTCTTGGAGACTA AACTATAG.GCGTACATCACTATAG.GCGTACATCG GGATAGGATAGSNPuSNP的特點： SNP 與RFLP及SSR 標(biāo)記的不同有2 個方面：其一，SNP 不再以DNA 片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記； 其二，SNP 標(biāo)記分析完全摒棄了經(jīng)典的凝膠電泳，代之以最新的DNA 芯片技術(shù)。對成千上萬個克隆測序，用計算機分析數(shù)據(jù)和顯示最終結(jié)果。u檢測： DNA芯片技術(shù)，最新報道的微芯片電泳(Microchip electrop

22、horesis) ，可以高速度地檢測臨床樣品的SNP。 雜交型芯片將等位基因特異寡核苷酸共價固定在載體表面，用熒光標(biāo)記引物擴增基因組DNA，再與芯片上的寡核苷酸雜交形成信號，并行讀取芯片上不同SNP 熒光信號，獲得SNP 信息。uSNP的優(yōu)點 數(shù)量多，分布廣泛，檢測快速、易于實現(xiàn)自動化，遺傳穩(wěn)定性高。uSNP的缺點 成本高，錯誤信號多。uSNP標(biāo)記的應(yīng)用 種群生物學(xué)特征、遺傳性疾病檢測、疾病關(guān)聯(lián)分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基因組作圖和數(shù)量性狀定位等方面也有越來越多的應(yīng)用。第三節(jié)藥用植物的分子鑒定流程（實例）目前用于DNA測序的基因主要有：1.有葉綠體基因組的rbcL、matK；2.

23、核基因組的rRNA、ITS等(植物類)；3.線粒體基因組的cty-b(動物類)。rbcL：基因分辨率高，變異較均一分布，進化速率差異大，一般用于科級以上分類群研究。 matK：位于trnK基因的內(nèi)含子中，長約1500堿基，編碼成熟酶并參與RNA轉(zhuǎn)錄體中型內(nèi)含子的剪切，是葉綠體基因組蛋白編碼基因中進化速率最快的基因之一，變異較均一，一般用于種一級分類群親緣關(guān)系研究。rRNA是編碼核糖體DNA的基因，在植物中以重復(fù)連續(xù)排列方式存在，包含進化速率不等的編碼區(qū)、非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)和轉(zhuǎn)錄區(qū)，可選擇較保守的片斷如18S、5S的rRNA進行各種親緣關(guān)系研究。1. 串聯(lián)重復(fù)序列，拷貝可達50040000；不同ITS

24、拷貝間的序列趨于相近或完全一致 。核核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Nuclear ribosomeinternal transcribe spacer, ITS2 . 序 列 短 ， 具 有 長 度 保 守 性 (ITS1:187-298bp，ITS2:187-252bp)核核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Nuclear ribosomeinternal transcribe spacer, ITS3. 核苷酸序列的高度變異性 (每個區(qū)成對序列趨異百分率在410%)4. 兩側(cè)都有高度保守的序列收集中國境內(nèi)柴胡標(biāo)本29種36份，基本涵蓋民間入藥的所有品種。名稱憑證標(biāo)本采集時間采集地點多枝柴胡 B. polyclonum謝

25、暉0405170012004年5月云南會澤川滇柴胡 B. candollei謝暉0405170022004年5月云南會澤柴胡（栽培）B. chinense晁志、張道廣03080162003年8月陜西鎮(zhèn)巴小柴胡 B.hamiltonii晁志、張道廣03080012003年8月云南昆明狹葉柴胡（紅柴胡）B. scorzonerifolium晁志、張道廣03070012003年7月安徽肥東空心柴胡B. longicaule var. franchetii晁志、張道廣03080112003年8月陜西鎮(zhèn)巴竹葉柴胡 B. marginatum晁志、張道廣03080022003年8月云南昆明抱莖柴胡B. l

26、ongicaule var. mplexicaule晁志、張道廣03080032003年8月云南昆明麗江柴胡 B. rockii晁志、張道廣03080092003年8月云南麗江柴胡(野生) B. chinense晁志、張道廣03080202003年8月陜西鎮(zhèn)巴汶川柴胡（馬尾柴胡）B. wenchuanense晁志、張道廣03080512003年8月四川汶川馬爾康柴胡 B. malconense晁志、張道廣03080532003年8月四川汶川柴首 B. chaishoui晁志、張道廣03080542003年8月四川汶川四川柴胡 B. sichuanense晁志、張道廣03080522003年8月

27、四川汶川南方大葉柴胡B. longiradiatum f. australe晁志、張道廣03070032003年7月安徽黃山韭葉柴胡 B.kunmingense潘勝利03871981年8月云南昆明窄竹葉柴胡B. marginatum var. stenophyllum潘勝利05061993年7月云南昆明線葉柴胡 B. angustissimum潘勝利05161993年8月寧夏同心矮小柴胡B. hamiltonii var. humile潘勝利03201980年8月云南麗江大葉柴胡B. longiradiatum var. breviradiatum潘勝利04601986年8月黑龍江尚志煙臺柴胡

28、B. chinense f. vanheurckii潘勝利04991992年8月山東青島瀘西柴胡 B.luxiense潘勝利04141983年8月云南建水長白柴胡 B. komarovianum潘勝利04701986年8月吉林長白山大苞柴胡 B. euphorbioides潘勝利04681986年8月吉林長白山大葉柴胡B. longiradiatum var. breviradiatum王峻03090012003年9月黑龍江細莖有柄柴胡B. petiolulatum var. tenerum晁志、張道廣03080102003年8月云南麗江北柴胡 B. chinense晁志、張道廣0300001

29、2003年8月陜西太白山窄竹葉柴胡 B. marginatum var. stenophyllum晁志、張道廣03080552003年8月甘肅柴胡 B. gansuense潘勝利05131993年8月甘肅榆中縣柴胡（栽培）B. chinense謝暉、劉峰林、徐志斌0407210012004年7月甘肅小隴山柴胡 B. chinense謝暉、劉峰林、徐志斌0407240012004年7月甘肅天水黑柴胡 B. smithii謝暉0407270012004年7月甘肅榆中黃花鴨趾柴胡B. commelynoideum var. flaviflorum謝暉0407280012004年7月甘肅榆中興安柴胡

30、B. sibiricum潘勝利05191993年8月內(nèi)蒙古大青山銀州柴胡 B. yinchowense謝暉、劉峰林、徐志斌0407230012004年7月甘肅小隴山小柴胡 B. hamiltonii徐士奎04080012004年8月川滇交界基因組DNA提?。?分別使用CTAB法和植物基因組小量抽提試劑盒提取植物基因組DNA。1%瓊脂糖電泳檢測。-20冰箱保存，備用。 材料與方法 ITS序列擴增：ITS序列采用5P、4P雙引物進行擴增，引物序列分別為：“ITS 5P”- 5 GGA AGG AGA AGT CGT AAC AAG G TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3。反應(yīng)

31、體系(50L)：10PCR發(fā)應(yīng)緩沖液5.0L，dNTP (2.5mmol/L each ) 3.0L, Taq酶1U，引物(10mol/L)各5.0L，模板1-5 L。反應(yīng)程序：93 5min，55 2min；93 30s，55 45s，70 45s，循環(huán)35次；70 5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒對目標(biāo)條帶進行純化，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，備用。 單克隆挑選與測序膠回收純化后的ITS序列直接測序，部分結(jié)果有雙峰出現(xiàn)。此結(jié)果可能與多拷貝在進化過程中尚未形成完全一致的序列有關(guān)，因此通過使用T載體，隨機挑取單克隆測序以獲得樣品ITS序列。序列分析：1. ClustalX軟件進行進行比對，

32、選擇一條嚴格一致序列作為該樣本的代表序列，并于Genbank登陸。2.使用DNAssist 2.2軟件對本研究中獲得的序列進行兩兩比對，并計算同源性。同時所獲得序列與外類群序列進行兩兩比對，計算同源性。 結(jié)果：圖1. 1瓊脂糖凝膠電泳檢測試劑盒提取所得植物基因組DNA。圖中標(biāo)號為樣品編號。60ng15ng為不同量的DNA上樣，其分子量為48kb，用以標(biāo)示完整植物基因組的大小，同時對獲得的DNA樣本半定量，上樣體積均為5L。 圖2. 1.5瓊脂糖凝膠電泳檢測不同樣本ITS序列擴增結(jié)果。M標(biāo)示分子量Marker L2000，數(shù)字標(biāo)號為樣品編號。PCR產(chǎn)物及其左側(cè)分子量Marker為同塊膠電泳檢測，

33、每組PCR反應(yīng)均設(shè)有陰性對照，結(jié)果均為陰性。上樣量5L。 結(jié)果：圖3. 1.5瓊脂糖凝膠電泳檢測不同樣本PCR擴增產(chǎn)物目標(biāo)條純化結(jié)果。M標(biāo)示分子量Marker DL2000，數(shù)字標(biāo)號為樣品編號。 結(jié)果：圖4. 1.0瓊脂糖凝膠電泳檢測6號、9號DNA樣本PCR產(chǎn)物純化后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10細胞結(jié)果。 結(jié)果：36份樣品中共獲得27條ITS序列的嚴格一致序列名稱序列編號Genebank登錄號多枝柴胡B. polyclonumY1DQ285463川滇柴胡B. candolleiY2DQ285471柴胡（栽培）B. chinenseS1DQ285452小柴胡B.hamiltoniiY3DQ28547

34、2狹葉柴胡（紅柴胡）B. scorzonerifoliumO1DQ285465空心柴胡B. longicaule var. franchetiiS2DQ285453竹葉柴胡B. marginatumY4DQ285467抱莖柴胡B. longicaule var. amplexicauleY5DQ285469麗江柴胡B. rockiiY6DQ285458柴胡(野生)B. chinenseS3DQ285449汶川柴胡（馬尾柴胡）B. wenchuanenseC1DQ285461馬爾康柴胡B. malconenseC2DQ285446柴首B. chaishouiC3DQ285462四川柴胡B. si

35、chuanenseC4DQ285447南方大葉柴胡B. longiradiatum f. australeA1DQ285460窄竹葉柴胡B. marginatum var. stenophyllumY7DQ285468線葉柴胡 B. angustissimumN1DQ285464細莖有柄柴胡B. petiolulatum var. tenerumY8DQ285459柴胡 B. chinenseS4DQ285450窄竹葉柴胡B. marginatum var. stenophyllumO2DQ285466柴胡（栽培）B. chinenseG2DQ285448柴胡 B. chinenseG3DQ2

36、85451黑柴胡 B. smithiiG4DQ285455黃花鴨趾柴胡B. commelynoideum var. flaviflorumG5DQ285456興安柴胡 B. sibiricumM1DQ285457銀州柴胡 B. yinchowenseG6DQ285454小柴胡 B.hamiltoniiO3DQ285470A1Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8A1南方大葉柴胡Y1多枝柴胡97.37Y2川滇柴胡90.9090.31Y3小柴胡90.4189.9898.84Y4竹葉柴胡89.9289.8293.7193.21Y5抱莖柴胡89.4189.6694.3794.0495.52Y6麗江柴胡97.

37、8596.7290.1089.6089.4489.27Y7窄竹葉柴胡87.9387.3692.5592.0696.8594.3687.62Y8細莖有柄柴胡97.3796.2289.6489.1488.9888.8299.5187.17G2柴胡（栽培）96.5395.8990.5690.0189.2489.4096.3787.4295.72ITS序列比對結(jié)果Results of the homologous alignment of ITS sequences A1Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8G2G3G4G5G6C1C2C3C4M1G3柴胡95.37 94.91 89.59 89.09 88

38、.78 88.10 95.71 87.11 95.23 97.52G4黑柴胡98.02 97.21 90.43 89.60 89.93 89.93 97.85 88.12 97.37 96.53 95.71G5黃花鴨趾柴胡98.18 97.37 90.59 90.10 90.10 90.10 98.02 88.28 97.53 96.70 95.87 99.83G6銀州柴胡96.69 96.88 90.91 90.41 89.92 89.92 97.69 88.10 97.20 98.51 97.69 97.69 97.85C1汶川柴胡97.03 97.54 89.64 89.62 89.13

39、 89.13 96.54 87.48 96.05 95.55 94.73 97.03 97.20 96.71C2馬爾康柴胡96.03 95.40 90.23 89.74 89.07 89.07 95.87 87.09 95.39 99.67 97.19 96.20 96.37 98.18 95.22C3柴首97.03 97.70 89.46 89.46 88.96 89.13 96.54 87.15 96.05 95.55 94.73 97.03 97.20 96.70 98.85 95.22C4四川柴胡96.03 95.73 90.25 89.75 89.26 89.26 95.87 87.

40、27 95.56 99.67 97.19 96.20 96.37 98.18 95.39 99.33 95.39M1興安柴胡98.18 97.37 90.59 90.10 90.10 90.10 98.02 88.28 97.53 96.70 95.87 99.83 99.83 97.85 97.20 96.37 97.20 96.37O1狹葉柴胡97.85 97.21 90.74 90.25 90.25 89.92 97.36 88.43 96.88 96.36 95.87 97.85 98.02 97.52 96.87 96.03 97.36 96.20 98.51ITS序列比對結(jié)果Res

41、ults of the homologous alignment of ITS sequences A1 Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 G2 G3 G4 G5 G6 C1 C2 C3 C4 M1 O1 O2 O3 N1 S1S2S3S4O2窄竹葉柴胡89.4288.6793.7193.2199.5095.3688.9496.8588.4988.9188.6089.4489.6089.4288.6388.5888.4788.7889.6089.75O3小柴胡90.4190.3199.5099.0194.0494.5490.2692.8889.8090.7389.7590.599

42、0.7691.0789.7990.4089.6290.4190.7690.9093.87N1線葉柴胡97.8597.0490.7690.2690.2690.1097.3688.7896.8896.3795.8797.8598.0297.5296.8796.0496.8796.0498.0299.0089.7790.92S1柴胡（栽培）96.3895.8989.7989.2989.2988.8096.8787.4896.2297.3697.8696.7196.8797.6995.5597.0395.7297.0396.8796.7188.9689.9596.71S2空心柴胡96.3696.228

43、9.5789.0789.0788.9196.3787.5896.0597.5296.6996.8697.0397.6995.7297.1995.7297.0297.0396.5388.7489.7496.5397.53S3柴胡（野生）96.5395.8990.7390.2389.4089.5796.3787.5895.8999.1797.6996.7096.8698.6895.7298.8495.7298.8496.8696.5389.0790.8996.5397.5397.68S4柴胡96.3695.3790.5690.0789.2289.3996.2087.4095.8999.0197.5

44、296.5396.7098.5195.7298.6896.0598.6896.7096.8688.8990.7396.3797.3697.5299.50Carum carvi71.5771.5070.0271.3671.9771.7171.9570.1571.7171.8572.4071.7871.9571.9071.2971.5270.7971.5771.9572.4071.8171.8572.2872.6572.3572.5271.97Conioselinum chinense73.2273.0773.8473.6872.6473.0973.6070.7873.1973.6873.5573

45、.4373.6073.7272.9873.3473.1573.3973.6074.2172.4774.0173.6073.3173.6873.8474.30Oenanthe javanica71.0769.6271.0371.0370.8170.0070.9668.8270.5670.3670.5870.4170.6370.9169.3670.3669.1970.0870.6370.9170.1571.1970.3070.3570.1570.7070.78Laserpitium hispidum69.0968.9769.0469.7067.6667.5070.1366.8369.9068.87

46、69.0969.4769.6469.4268.7068.5469.1968.6069.6469.4267.0069.2169.3169.5269.0469.0469.15ITS序列比對結(jié)果Results of the homologous alignment of ITS sequences 本研究中獲得的柴胡屬植物ITS序列與外類群ITS序列（來源于芹亞科芹族Carum carvi，Conioselinum chinense， Oenanthe javanica和同亞科 Laserpitieae(Thapsiae)族Laserpitium hispidum）比對同源性均小于75%，而序列間兩

47、兩比對同源性均大于87%。 柴胡屬內(nèi)同源性大于99%（表中以黃色標(biāo)示）的共有6個組合，分別為：（1）G2 B. chinense柴胡（栽培）C2 B. malconense馬爾康柴胡C4 B. sichuanense四川柴胡S3 B. chinense柴胡（野生） S4 B. chinense柴胡；（2）G4 B. smithii黑柴胡G5 B. commelynoideum var. flaviflorum黃花鴨趾柴胡M1 B. sibiricum興安柴胡；討論討論2 2：O1 B. scorzonerifolium狹葉柴胡N1 B. angustissimum線葉柴胡；（4）Y6 B. rockii麗江柴胡Y8 B. petiolulatum var. tenerum細莖有柄柴胡；（5）Y4 B. marginatum竹葉柴胡O2 B. marginatum var. stenophyllum窄竹葉柴胡