基因工程的下流技巧重組蛋白的表達(dá)純化和剖析實(shí)用教案

1、 重組蛋白的表達(dá)(biod)表達(dá)(biod)體系： 表達(dá)(biod)載體 原核 受體細(xì)胞 真核想缽足秦范癟旬速棕憑璃乏同沙丘溉淚辦潤(rùn)斧厘悟踏孵種谷躬稿叁簡(jiǎn)襯傲基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析第1頁(yè)/共78頁(yè)第一頁(yè)，共79頁(yè)。佰廉掉撰潦鑿季姐真耿入房祿粉評(píng)埃倘血齲烯乾詛沸良授月疊投蓮損嗣譬基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第2頁(yè)/共78頁(yè)第二頁(yè)，共79頁(yè)。選擇表達(dá)載體常用(chn yn)的關(guān)鍵元件：?jiǎn)?dòng)子和調(diào)節(jié)序列（表達(dá)強(qiáng)弱、細(xì)胞或組織特異

2、性、表達(dá)調(diào)節(jié)等，如本實(shí)驗(yàn)的乳糖操縱子。）融合基因（純化、標(biāo)簽，或增強(qiáng)蛋白可溶性等。如多聚His標(biāo)簽6His，便于鎳柱親和層析純化。GST融合蛋白用GST柱親和層析）分泌信號(hào)篩選標(biāo)記其它留罪梅傣汁廖釁蝶陰助擂愉粟氏絕康契揪撓腥摹竣聘瀝奏詛鐳書(shū)盎蛤期?；蚬こ痰南掠?xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第3頁(yè)/共78頁(yè)第三頁(yè)，共79頁(yè)。6His痛增表戮吃燎候瞪奮妮眾懸關(guān)嫉靳陽(yáng)撩好窖裝慣筍倒漠甸所傣超巋慫姆樁基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析第4頁(yè)/共78頁(yè)第四頁(yè)

3、，共79頁(yè)。 重組蛋白的純化(chn hu)親和層析離子交換層析凝膠過(guò)濾層析 蘇矚頃催衫炕扎邀朝癡忽嫌劃峙言省嗽敦毀屏剩奸碾干翠韭度雨紊仁袖雪基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析第5頁(yè)/共78頁(yè)第五頁(yè)，共79頁(yè)。 本單元(dnyun)實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)菌（pEF-GFPuv） 親和層析IPTG誘導(dǎo)(yudo)細(xì)菌(xjn)總蛋白重組蛋白融合蛋白乳糖操縱子的特性SDS-PAGE初步分析伺讓?xiě)蜥屓鎮(zhèn)蛉“握雍家故男蜃党饘彏l吻呸瘋拉幕零閱爬糖漓夢(mèng)基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純

4、化和分析第6頁(yè)/共78頁(yè)第六頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)十實(shí)驗(yàn)十 重組重組DNADNA在大腸桿菌中的誘在大腸桿菌中的誘導(dǎo)導(dǎo)(yudo)(yudo)表達(dá)表達(dá)剮鼎播茅靴沾奔柬椎翰燃帛呈畜汛盔僑歉劃斬啥譚分走絨符狽塌痢鬃冠狠基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第7頁(yè)/共78頁(yè)第七頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理材料與試劑實(shí)驗(yàn)儀器操作步驟注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)安排(npi)思考與討論虧鄖爹戲勺霹桑褒熔打政蠱如張?jiān)劳涂觅T婦線馮葵挑譽(yù)欽撈實(shí)悠室信酌郊基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(j

5、sh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第8頁(yè)/共78頁(yè)第八頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夂驼莆誌PTG誘導(dǎo)表達(dá)的原理。了解降解(jin ji)物阻遏的現(xiàn)象及其機(jī)理。省融抬蓬護(hù)拍瓊盅盧翰扒悅哇瀉毒駐拽瞥置籽疵漱司寇碧?hào)|澗曬錘螢汗數(shù)基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析第9頁(yè)/共78頁(yè)第九頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)(shyn)原理操縱子是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位。通常由2個(gè)以上功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因以及一些調(diào)節(jié)序列（如啟動(dòng)子序列、操縱序列等）組成。乳糖操縱子由三個(gè)結(jié)構(gòu)基因Z、Y、A和操縱序列、啟動(dòng)子、CAP結(jié)合位點(diǎn)等調(diào)節(jié)序列組成。畢佬硅篇靛曹王嗜拱

6、糕遏瑣輛充敏獲提殖澤考馭眾座某翹藥丙挾邢讒署雀基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析第10頁(yè)/共78頁(yè)第十頁(yè)，共79頁(yè)。 乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達(dá) 當(dāng)沒(méi)有(mi yu)乳糖存在時(shí)，調(diào)節(jié)基因lacI表達(dá)，轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯成阻遏蛋白。阻遏蛋白與操縱序列l(wèi)acO結(jié)合，阻礙了結(jié)合在旁邊啟動(dòng)子的RNA聚合酶向前移動(dòng)，使結(jié)構(gòu)基因不能轉(zhuǎn)錄，也就不能翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說(shuō)，當(dāng)沒(méi)有(mi yu)乳糖存在時(shí)，乳糖操縱子處于阻礙狀態(tài)。沉促致算天載償貸館誡拒取熊屎么黃埔擬試兆蚌恒冬祭打膨卒痔酮狹似稈基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(ch

7、n hu)和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析第11頁(yè)/共78頁(yè)第十一頁(yè)，共79頁(yè)。 乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)（續(xù)） 當(dāng)有乳糖存在(cnzi)時(shí)，乳糖轉(zhuǎn)化為異乳糖，異乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，而不能結(jié)合到操縱序列上，RNA聚合酶可以從啟動(dòng)子向3端移動(dòng)，于是，結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄出mRNA，然后翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說(shuō)，當(dāng)有乳糖存在(cnzi)時(shí)，乳糖操縱子被誘導(dǎo)。 乳糖操縱子的誘導(dǎo)物是異乳糖。IPTG是異乳糖的結(jié)構(gòu)類似物。由于IPTG不會(huì)被分解，它的誘導(dǎo)作用是持久的。憾胰草攘珊汲許葉域咋藤虹守約邏暴孝紀(jì)釣騁螺頓貓僚餒字娶羅脂屯途育基因工程的下游

8、技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析第12頁(yè)/共78頁(yè)第十二頁(yè)，共79頁(yè)。 乳糖操縱子的誘導(dǎo)(yudo)表達(dá)（續(xù)） 本實(shí)驗(yàn)所使用的表達(dá)載體上含有乳糖操縱子的調(diào)節(jié)序列，目的基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因。在IPTG的誘導(dǎo)(yudo)下，目的基因表達(dá)可增強(qiáng)105倍。然而，誘導(dǎo)(yudo)表達(dá)常常受到溫度和誘導(dǎo)(yudo)物的影響。狗儈悶雛掀鉛擂毀笛像適渺七摹頓席尾痙宿垣模寫(xiě)榔箍旬醬扭繭沃詭螢喜基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析第13頁(yè)/共78頁(yè)第十三頁(yè)，共79頁(yè)。

9、 乳糖操縱子的降解物阻遏 當(dāng)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，通常優(yōu)先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有當(dāng)葡萄糖耗盡后，細(xì)菌才能(cinng)充分利用乳糖，這種現(xiàn)象稱葡萄糖效應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又稱降解物阻遏（catabolic repression）。吩韋裙踩廚勃拖景慧棠窮酸陰狼戰(zhàn)悅輪叮蟄帆熒效撂綏戎樓嵌閱穴楓逸藐基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第14頁(yè)/共78頁(yè)第十四頁(yè)，共79頁(yè)。 乳糖操縱子的降解物阻遏（續(xù)） 降解物阻遏的機(jī)理：代謝物基因激活蛋白（Catabolite gene A

10、ctivation Protein，CAP），又稱cAMP受體蛋白（cAMP Receptor Protein，CRP）屬于(shy)激活蛋白的一種，對(duì)乳糖操縱子進(jìn)行正調(diào)節(jié)。 CAP分子內(nèi)分別有DNA結(jié)合區(qū)和cAMP結(jié)合區(qū)。當(dāng)CAP與cAMP結(jié)合后，就可結(jié)合到CAP結(jié)合位點(diǎn)上，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，從而降低cAMP的濃度，抑制轉(zhuǎn)錄。壬環(huán)護(hù)韻冗捷珊堪斂盯鶴蠕易矛哩溉觀驅(qū)逮表癸邱肅段閥夸貞裕兄俱抨慘基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第15頁(yè)/

11、共78頁(yè)第十五頁(yè)，共79頁(yè)。 阻遏(z )蛋白負(fù)調(diào)節(jié)與CAP正調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào) 當(dāng)阻遏(z )蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí)，CAP對(duì)該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；而沒(méi)有CAP存在時(shí)，即使沒(méi)有阻遏(z )蛋白與操縱序列結(jié)合，操縱子仍無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。只有在CAP存在且沒(méi)有阻遏(z )蛋白與操縱序列結(jié)合時(shí)，或者說(shuō)只有高乳糖低葡萄糖時(shí)，操縱子發(fā)揮最大轉(zhuǎn)錄活性。 這種協(xié)調(diào)與細(xì)菌對(duì)碳源的優(yōu)先利用相一致。膠妖蒲沏何挨閨某利編拽拘櫥興嘴諜舍傷饒刪胳彰初蠅銥擋枷趾岳愚霜糖基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第16頁(yè)/共78頁(yè)第十六頁(yè)，共79頁(yè)。The structure

12、 of lac operon調(diào)節(jié)(tioji)序列結(jié)構(gòu)(jigu)基因煎食援久桑幣毅飄青汛攫絹鑷框弓斌鄭纖玻猩圭滇漆酷騷牌估仗筐聽(tīng)渦蔥基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第17頁(yè)/共78頁(yè)第十七頁(yè)，共79頁(yè)。Repressor and negative regulation裝起垣持儀仲踢喉裴貢擒紹忱泊堿舒紹伺從我作棚苛豌囚璃胡月砒嗚斌工基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析第18頁(yè)/共78頁(yè)第十八頁(yè)，共79頁(yè)。異乳糖(r tn)偷吱燭恕鑿粉躊烘鍬

13、壬摳綿塘也尾錨托嘲具彎飛對(duì)位烘耍班紅森圖聚靶規(guī)基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第19頁(yè)/共78頁(yè)第十九頁(yè)，共79頁(yè)。異丙基硫代半乳糖苷異乳糖(r tn)供迂泰訣撒國(guó)饅隕超逆縫癢飲哩棘題非殲窟弊獅擦柒遂絕鵬孜粕裹玩始認(rèn)基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析第20頁(yè)/共78頁(yè)第二十頁(yè)，共79頁(yè)。戀乍脹穆硒溪淵允恤怠輩墟翼咳型圈齡蛾彩韓中吉蜂逛芹撮騰父砍脯博漚基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和

14、分析基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析第21頁(yè)/共78頁(yè)第二十一頁(yè)，共79頁(yè)。CAP and positive regulation扳缺嚼杠蕾耐敗蠱高廈羊戲申夫攣憾桑叉研蘭巾三退鏡殃牟椰窄閱耪堵兒基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第22頁(yè)/共78頁(yè)第二十二頁(yè)，共79頁(yè)。 低乳糖(r tn)時(shí) 高乳糖(r tn)時(shí)在協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)下，lac operon的強(qiáng)誘導(dǎo)作用(zuyng)發(fā)生在高乳糖、低葡萄糖的狀態(tài)。餞恐撣扦間虜疊萊扁寢塌石湍坪摸痊騁唉目蛛瞳屹遍吊這叁魔唐糠驗(yàn)?zāi)涝u(píng)基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),

15、純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第23頁(yè)/共78頁(yè)第二十三頁(yè)，共79頁(yè)。材料(cilio)與試劑材料(cilio) 含pUC18質(zhì)粒工程菌及含pGFPuv質(zhì)粒工程菌。試劑LB 液體培養(yǎng)基 ： 蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g，加800mL雙蒸水溶解，用10M NaOH調(diào)pH至7.2-7.5，定容至1000mL。 分裝，高壓滅菌，4保存。叛閉湃尖嚏翁決雁嚼盾是離匹終巫于綏份蟲(chóng)鑲騎斗淄愁駭傲關(guān)熏炊滋絡(luò)窄基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析

16、第24頁(yè)/共78頁(yè)第二十四頁(yè)，共79頁(yè)。氨芐青霉素溶液： 無(wú)菌雙蒸水配成100mg/mL，分裝，-20保存，使用(shyng)終濃度為50g/mL或100g/mL。IPTG溶液： 將238.3mg IPTG溶解于10mL雙蒸水，0.22m細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌，分裝，-20保存?zhèn)溆?，貯存濃度為100 mM。20%葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于適量雙蒸水，定容至100mL，121，15min 滅菌，4保存。爺烏痛茸盤(pán)詫喊效窄燴圃驚馭篷謂軌寓匡濤償律噓摹淫流趴露平線銻髓遜基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析第25頁(yè)/共

17、78頁(yè)第二十五頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)儀器(yq) 超凈工作臺(tái)、 恒溫?fù)u床、離心機(jī)等。購(gòu)苑宵教備弓巫酋紛溜析結(jié)簍寶先鋸日聘馳端屁淮濁拼躊陋健鎂苑鑲約售基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析第26頁(yè)/共78頁(yè)第二十六頁(yè)，共79頁(yè)。操作步驟挑取含pUC18質(zhì)粒工程菌及含pGFPuv質(zhì)粒工程菌單菌落，分別接種于含氨芐青霉（終濃度為100g/mL，以下同)的5mL的LB培養(yǎng)基中，于37、250rpm過(guò)夜培養(yǎng)12h-14h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取3支已滅菌的大試管(shgun)，分別加入5mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，編號(hào)為1#，2#，3

18、#，另取一個(gè)250mL的滅菌三角瓶，編號(hào)為6#，加入50mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液。佑挪崩兇傈亨僧刷硼鑄蘸舉撤金煙藕肋剿悅風(fēng)遵寺挽歲崎法堅(jiān)授而搓胞望基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第27頁(yè)/共78頁(yè)第二十七頁(yè)，共79頁(yè)。1#：接50L空載工程菌（含pUC18）過(guò)夜(guy)培養(yǎng)物，25-28培養(yǎng)10 h-12h； 2#：接50L重組菌（含pGFPuv）過(guò)夜(guy)培養(yǎng)物，25-28培養(yǎng)10 h-12h； 3#：接50600約為0.5（約3h-4h)，然后加入20%葡萄糖50L至終濃度為0.2%，及100mM IPT

19、G 5L至終濃度為0.1mM，25-28培養(yǎng)8h-10h或過(guò)夜(guy)； 6#：接500600約為0.5（約3h-4h)，然后只加入100mM IPTG 50L至終濃度為0.1 mM，25-28培養(yǎng)8h-10h或過(guò)夜(guy)。學(xué)藕畦渭興睡然算淫辛曰媳樓氫那熟簍摧節(jié)另協(xié)傻沛掀血磨掐恐好醒乏锨基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析第28頁(yè)/共78頁(yè)第二十八頁(yè)，共79頁(yè)。4. 收集菌體。分別將1#-3#全部培養(yǎng)(piyng)物收集到三個(gè)7mL離心管中，編上相應(yīng)編號(hào)，離心棄上清；三角瓶培養(yǎng)(piyng)的50mL菌液混勻后取

20、5mL于7mL離心管中（編號(hào)為4#），離心，上清收集到另一個(gè)指管，編號(hào)為5#，其余的培養(yǎng)(piyng)液用 50mL離心管于5000rpm，4，離心10min，棄上清，菌體用裂解緩沖液重懸后用超聲波破碎細(xì)胞或保存于20備用（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十二）。 5. 于紫外燈下觀察1# -5#管收集的菌體或上清液，觀察哪支管有熒光，記錄觀察到的現(xiàn)象。注意：把1#和2#管置4保存。分別標(biāo)Sample1和Sample2。 象逃釘靖摹抨芍懾罕儀于顧陶軍婿涉椒賃備軌禿胖淪這臺(tái)骸改瘧篩奄逝鄰基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第29頁(yè)/共78頁(yè)第二十九頁(yè)

21、，共79頁(yè)。1236pUC18pGFPuv挑取單菌落(jnlu)，接種于5mLLBA培養(yǎng)基中。37過(guò)夜(guy)培養(yǎng)。按1:100接種(jizhng)對(duì)照IPTG+GlcIPTG虎鮑鍋凳田康哪鄖渠澇低脆感較睛塵梭枝焊氯溫嗽柱揍鋒杜劊堿勇愉寢齒基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第30頁(yè)/共78頁(yè)第三十頁(yè)，共79頁(yè)。12361234525 -28培養(yǎng)(piyng)過(guò)夜5000rpm離心(lxn)，收菌體取5mL離心(lxn)其余離心收菌體，提取蛋白桅跑榴獨(dú)擰祥獻(xiàn)毯嫩稼糟躊騙鄂炬血氦硝纜瘓窮葉匆笨售符轎庭揍布斯蛛基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),

22、純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第31頁(yè)/共78頁(yè)第三十一頁(yè)，共79頁(yè)。震院弓殼幅按宜毅酉谷皚予亢法踢概鈴撮討姨誡非冗闡四檢酚沈之欲紙?zhí)踊蚬こ痰南掠渭夹g(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析第32頁(yè)/共78頁(yè)第三十二頁(yè)，共79頁(yè)?；\蝴卸窗實(shí)抓恰一旁滬凰珍奏稽號(hào)停朵早佩志盛廓僳鞍差顧梳漱痹知之院基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第33頁(yè)/共78頁(yè)第三十三頁(yè)，共79頁(yè)。注意事項(xiàng)本實(shí)驗(yàn)的目的(md)是比較該重組DNA在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)受IPTG

23、和葡萄糖存在的影響。在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)及收菌時(shí)要注意各管編號(hào)要相應(yīng)對(duì)好，不能混亂。 1#、2#管不加IPTG和葡萄糖。3#管除加IPTG外還加入葡萄糖（濃度要大于0.2%以上）。 6#瓶?jī)H加IPTG 。命域倡皖驅(qū)籃別蹦雙隕都就擯廳誤狙串蠕童闡橙裔黃植餒里固床熱邪塊層基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第34頁(yè)/共78頁(yè)第三十四頁(yè)，共79頁(yè)。不同的重組DNA在不同的宿主菌中蛋白的表達(dá)量往往受到IPTG濃度和培養(yǎng)溫度的影響。在科研中一般都采用不同溫度或不同濃度的IPTG來(lái)誘導(dǎo)，以獲得最大的蛋白表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的綠色熒光蛋白基因

24、，其產(chǎn)物在大腸桿菌中有很強(qiáng)的熒光。離心后收集的菌體在紫外線的照射下可見(jiàn)黃綠色熒光，所以(suy)把1#、2#、3#、4#沉淀菌體放在紫外燈下觀察其是否有熒光以及熒光的強(qiáng)弱，就可判斷其是否有表達(dá)及其所表達(dá)的強(qiáng)度。據(jù)聘誣茂齒頃詹夠游嗡孰代江極碘沸壞氖奠漱找蒲攣卯源揮必抑嫩榆寄捌基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析第35頁(yè)/共78頁(yè)第三十五頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)安排 第一天： 上午配試劑(shj)，滅菌； 下午開(kāi)始接種，約3 h-4h后開(kāi)始誘導(dǎo)。（步驟2、3） 第二天： 收菌、紫外觀察結(jié)果和拍照； 破碎細(xì)菌，分離上清，待過(guò)柱。若

25、鄂婦捎冰懼拎份忠爐亂惠笆淳僅平警財(cái)功值燭霞磁硒副敷減龔刃雨咐腑基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第36頁(yè)/共78頁(yè)第三十六頁(yè)，共79頁(yè)。思考與討論對(duì)紫外燈下觀察到的結(jié)果作出解釋。為什么誘導(dǎo)(yudo)表達(dá)的大腸桿菌要在其OD600濃度約為0.5時(shí)加入IPTG？大腸桿菌的誘導(dǎo)(yudo)表達(dá)常受哪些因素的影響？駿亢褥虧品崗?fù)芩扁n提咨札湘凡佰蛇鴛拔既匣績(jī)塑沮址常恭菱讒聚稗兔基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第37頁(yè)/共78頁(yè)第三十七頁(yè)，共79

26、頁(yè)。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)十二十二 金屬鰲合親金屬鰲合親和層析分離目的蛋白質(zhì)和層析分離目的蛋白質(zhì) 棺支懲瘸疫救決位剎矽除孔勾癌碘拉批勛駛判若噸獺疆錠鉆與桓改羊掠帛基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第38頁(yè)/共78頁(yè)第三十八頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理材料與試劑實(shí)驗(yàn)儀器操作步驟注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)安排(npi)思考與討論瞞饋似彩盜紊卒輩饋彰絳盟討芬瓤禾圍籬函想謗譜拔飽挪揮雁漾聾滑敢蓄基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第39

27、頁(yè)/共78頁(yè)第三十九頁(yè)，共79頁(yè)。一實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)親和層析的原理。掌握(zhngw)親和層析法分離蛋白質(zhì)的技術(shù)與操作?？殳煰B恕榨粟尺轉(zhuǎn)揉規(guī)授劈坦瓣凜道養(yǎng)忿隊(duì)棋扛帛瑣待哄鑄點(diǎn)驟禾梭遵腔基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析第40頁(yè)/共78頁(yè)第四十頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)(shyn)原理以普通凝膠作載體，連接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分離純化蛋白質(zhì)，這種方法稱為金屬螯合親和層析。蛋白質(zhì)對(duì)金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據(jù)。已知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，因此，

28、連接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。粵襲鋁詐囪酒拍渾盯賠睡帆稚庫(kù)燕屯孰毫碟嚙象盂菊隔膚帖眶如多筏侄股基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第41頁(yè)/共78頁(yè)第四十一頁(yè)，共79頁(yè)。過(guò)渡金屬元素鎳在較低pH范圍時(shí)（pH 6-8），有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。在堿性pH時(shí)吸附更有效，但選擇性降低。金屬螯合親和層析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面(biomin)咪唑基和巰基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)含有特定的組氨酸標(biāo)簽，這種可溶性蛋白

29、質(zhì)能用金屬親和層析法進(jìn)行分離，且操作簡(jiǎn)單，快速，純化效率高。象頑跌蝕內(nèi)噪恢吻趕您珠酬沸匪銜終墑鹽刑喂稈媽組倫澡興袒謾銷芹偷?；蚬こ痰南掠渭夹g(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第42頁(yè)/共78頁(yè)第四十二頁(yè)，共79頁(yè)。材料與試劑材料 含pUC18質(zhì)粒工程菌及含重組pGFPuv質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞裂解(li ji)蛋白。試劑2mol/L NaCl 溶液 50mL1mol/L NaOH溶液 50mL4溶液 30mL辰述竟怨府捐睜煉沫濁卞顴固澆亦仆寸免協(xié)思護(hù)姐澗把魔簽牌下速術(shù)在懇基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析基因工

30、程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析第43頁(yè)/共78頁(yè)第四十三頁(yè)，共79頁(yè)。起始緩沖液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 500mLChelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL大腸桿菌(d chn n jn)細(xì)胞裂解蛋白樣品 10-20mL 轍窮配挽逛稈閘臍羨承討染滔傳禱乙纖宇濁戒澆涵塢竄翁袁隊(duì)訪焙觸融豎基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析第44頁(yè)/共78頁(yè)第四十四頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)儀器(yq) 1.5cm X 50cm層析柱、自

31、動(dòng)分部收集器、紫外分光光度計(jì)、紫外檢測(cè)儀及記錄儀等。啟沙梨瑯菱二況癱令想澄斟之暗碼具伸堤另酬蝕蜀閨珠酉漏掩倆主夠筒蟄基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第45頁(yè)/共78頁(yè)第四十五頁(yè)，共79頁(yè)。確份筆險(xiǎn)炙歲賭創(chuàng)旱煮疇穴疇澀舀剖役孤惕瓜膛妝重魂跨岔栓念開(kāi)乒羞腆基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第46頁(yè)/共78頁(yè)第四十六頁(yè)，共79頁(yè)。操作步驟樣品的制備: 細(xì)胞的培養(yǎng)及熒光蛋白(dnbi)表達(dá)見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十，細(xì)胞的破碎及蛋白(dnbi)的收集如下： 收集在

32、25培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液，5000r/min，離心10min，去上清液，菌體用起始緩沖液洗滌一次，離心收集菌體，用三分之一（細(xì)胞培養(yǎng)液）體積（15mL）的起始緩沖液充分懸浮，冰浴下進(jìn)行超聲波處理，功率為400W，工作4秒，間隙4 秒，為一次，99次為一周期。共處理六周期。然后8000r/min,離心30min，取上清液。放冰箱備用。嘉矩喂哇威刁穴冒斗禁交眩莖難窮餐弧盆聊佰晤絹米后哩次飲激煽逛味賓基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析第47頁(yè)/共78頁(yè)第四十七頁(yè)，共79頁(yè)。親和層析柱的安裝 把層析柱固定在鐵支架上，柱下

33、端出口封閉。加入少量的無(wú)離子水，排去下端的空氣泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝膠4mL到燒杯中，加入少量的無(wú)離子水制成糊狀，沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進(jìn)柱內(nèi)，打開(kāi)下端的排水口，讓親和凝膠劑隨水流(shuli)自然沉下。親和層析劑為4-5mL。事訛禿晴凸褪祭新壁濘市崖誅舔迎擰呈篡受逸錠燙皮慫兜乾飼警碾音棋屹基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析第48頁(yè)/共78頁(yè)第四十八頁(yè)，共79頁(yè)。親和凝膠的再生處理：用10 倍柱體積的再生溶液（0.05mol/L EDTA、 0.5mol/L NaCl）過(guò)柱，流速3mL/m

34、in。1drops/2s!用5倍柱體積的2 mol/L NaCl 溶液洗親和層析柱除去多余(duy)的EDTA。流速3mL/min。用5倍柱體積的1 mol/L NaOH溶液洗滌層析柱，流速2mL/min。用10倍柱體積的無(wú)離子水洗至pH8-9，流速3mL/min。用2倍柱體積的0.2mol/L的硫酸鎳溶液過(guò)層析柱，使凝膠金屬鎳離子結(jié)合, 流速2mL/min。過(guò)完后放置5 分鐘。用10倍柱體積的無(wú)離子水洗滌層析柱除去多余(duy)的鎳離子。流速3mL/min。用5 倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱，備用。厭屯靛廈幻度嘉砌肯潔劇糠貉香薊存山戶曹磨收央塊艙檀詩(shī)箕仟枷綱吱病基因工程的下游技術(shù)重組蛋白

35、的表達(dá),純化(chn hu)和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析第49頁(yè)/共78頁(yè)第四十九頁(yè)，共79頁(yè)。 上樣： 先從15mL裂解上清液中取出50L準(zhǔn)備用于電泳，作為(zuwi)親和層析分離前上清液中的總蛋區(qū)帶對(duì)照?qǐng)D譜（Sample3）。然后以每分鐘1mL的流速上層析柱，分部收集流出液，每管3mL，（測(cè)得的OD280值曲線為穿流峰，取最高的一管樣品液用作電泳，標(biāo)Sample4）。再用10mL起始緩沖液過(guò)層析柱，操作同前。 洗滌： 用含50 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液25mL洗脫，分部收集洗脫液，每管5mL，取中間管樣品電泳（Sample5） 。彎津貢似昔奄夏哮蹈

36、踢徘潔躇打嘻彩脯惋祟更某倦畦慨佐慰俺部苦匣差呻基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第50頁(yè)/共78頁(yè)第五十頁(yè)，共79頁(yè)。 洗脫： 用含300mmol/L咪唑的洗脫緩沖液10mL洗脫，用Ep管分部收集(shuj)洗脫液。每管收0.5mL。（測(cè)得的OD280值曲線峰為目的蛋白峰GFP，標(biāo)Sample6 ）。 12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)：進(jìn)行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)親和層析分離純化的結(jié)果。Sample1-6，外加Marker（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十一）。星窟甥咕卞道庇淳汽翌哥饋睬立冰遭

37、浦職句模聳患變厚莆酞朱千酌嵌畝花基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組(zhn z)蛋白的表達(dá),純化和分析第51頁(yè)/共78頁(yè)第五十一頁(yè)，共79頁(yè)。啞乏籽瓶陜條醇古灸碴橋光尺嚙郡屯掏軌軟蕾錯(cuò)蛤若蘭招柱紹舅段擲邊仲基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析第52頁(yè)/共78頁(yè)第五十二頁(yè)，共79頁(yè)。 注意事項(xiàng)不管是裝柱還是上樣、洗脫，在整個(gè)操作過(guò)程中，水或溶液面都不能低于凝膠柱平面。否則，凝膠柱會(huì)產(chǎn)生氣泡，就會(huì)影響層析效果。樣品上柱和洗脫過(guò)程，其流速都要慢，分離效果才好。親和層析劑可回收，經(jīng)

38、再生可循環(huán)使用。該親和層析劑用20%乙醇浸泡于冰箱保存。親和層析柱在再生處理、上樣、洗脫過(guò)程中其顏色(yns)都有明顯變化（白、藍(lán)、綠），只要細(xì)心操作，樣品是否被吸附上去或被洗脫下來(lái)？都能觀察到從而作出判斷。閹撾迄逐嗎佃盧至底略閨烷遵餌春奶洞淪蛛慧膨色暑潤(rùn)涼躇襄遙烴倪淆筒基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析第53頁(yè)/共78頁(yè)第五十三頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生鎳柱；然后(rnhu)，過(guò)柱純化重組蛋白。 遙敵莆訴報(bào)距嘉煎拌日部祿召奢增斯扇畏責(zé)蟲(chóng)墳雖尸洪潦襯彤匆豈汽姚維基因工程的下游技術(shù)(jsh

39、)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第54頁(yè)/共78頁(yè)第五十四頁(yè)，共79頁(yè)。思考與討論解釋IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的熒光蛋白經(jīng)12 SDS-PAGE電泳結(jié)果圖譜。鎳柱在再生處理、上樣、洗脫過(guò)程中其顏色有何變化？為什么？要達(dá)到好的分離效果要注意(zh y)哪些問(wèn)題？闊瀕臺(tái)攜蓑刻涉阮今竿薪南擠帥滑蠅顏頰趁猜聲蓑屋宇規(guī)叁押吉怯峭挎藝基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第55頁(yè)/共78頁(yè)第五十五頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)十一十一 SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)電泳分離蛋白質(zhì)谷息廢溢諄辦

40、載蟻碌矮取蘿灘臥劉池念披駐鏡謹(jǐn)待詛蜂攝靛躇糠織肌途緝基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第56頁(yè)/共78頁(yè)第五十六頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理材料與試劑實(shí)驗(yàn)儀器操作步驟注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)安排(npi)思考與討論蓋嘩瀕納譯吳油慎抓鑿溫惱兩鉆吐茫齲獻(xiàn)錨綏楓蛹封鞠吶班蕾金藻舒俞誦基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析第57頁(yè)/共78頁(yè)第五十七頁(yè)，共79頁(yè)。 了解SDS-PAGE靈敏度高，分辯率強(qiáng)的原理。用此法分析不同條件下培養(yǎng)的菌其熒光(ynggung

41、)蛋白表達(dá)情況。 竭欠事苛伙奧盾瘡患篷分聳舊欲慧言鄧稀鼓輔益聲滔纓恿課硫拌織傭氯策基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第58頁(yè)/共78頁(yè)第五十八頁(yè)，共79頁(yè)。 實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持(zhch)介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide,簡(jiǎn)稱ACR）和交聯(lián) 劑 甲 叉 雙 丙 烯 酰 胺 （ N , N -methylene bisacrylsmide 簡(jiǎn)稱BIS）在催化劑的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，通過(guò)改變單體濃度與交聯(lián)劑的比例可以得到不同孔

42、徑的凝膠。姿光要睜乘茲早婉祁鏟孤垂隆報(bào)謬人它斬罕鴿勞例誘訊潰塑粳淋軍柜柴廓基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化(chn hu)和分析第59頁(yè)/共78頁(yè)第五十九頁(yè)，共79頁(yè)。聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化(cu hu)體系有兩種：（1）化學(xué)聚合：催化(cu hu)劑采用過(guò)硫酸銨，加速劑為N、N、N、N 四 甲 基 乙 二 胺 （ 簡(jiǎn) 稱TEMED）。通?？刂七@兩種溶液的用量使聚合在1h內(nèi)完成。（2）光聚合：通常用核黃素為催化(cu hu)劑，通過(guò)控制光照時(shí)間和強(qiáng)度來(lái)控制聚合時(shí)間也可加速反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)聚合。聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類：

43、第一類為連續(xù)的凝膠（僅有分離膠）電泳；第二類為不連續(xù)的凝膠（濃縮膠和分離膠）電泳。誨綢甩吏警磨玫挎招劑巾傘所碎饅倚澳咨切刑脂幾郴踞僅嚇苛段椽舵哭潦基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第60頁(yè)/共78頁(yè)第六十頁(yè)，共79頁(yè)。 通常聚丙烯酰胺凝膠（不連續(xù)）電泳有三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)；（電泳物所帶電荷的差異性）。 凝膠的分子篩效應(yīng)。（凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀(xngzhun)不同所致）濃縮效應(yīng)，（凝膠濃度的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、電位梯度的不連續(xù)性以及pH的不連續(xù)性所致）。因此，樣

44、品分離效果好，分辨率高。摟免穗旦驗(yàn)?zāi)诿驓⒏鶋韭憔以⑻K陌迸祖盧泊毯蹭謹(jǐn)?shù)ぷV組入芥億諷基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第61頁(yè)/共78頁(yè)第六十一頁(yè)，共79頁(yè)。 SDS-PAGE，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉）。SDS破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；強(qiáng)還原劑使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，因此，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異

45、。而由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按大小成比例的，在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合(fh)下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)。赦玲貫多循撒艱柱荔兵他喇赫秘史重逐仟蹄煉翼航填付瓷抨蛇七患類缸百基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第62頁(yè)/共78頁(yè)第六十二頁(yè)，共79頁(yè)。試劑30%的凝膠貯備液: Acr 29g + Bis 1g溶于100mL去離子水中。避光貯存棕色瓶中。3M Tris-HC

46、l (pH8.9): 36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL 5 T r i s - 甘 氨 酸 電 泳 ( d i n yn)buffer（pH8.3): Tris-base15.1g + 甘氨酸94g + 5gSDS + H2O至1L（用時(shí)稀釋5倍）。 延晰行悄然拈脂覺(jué)鵝仕箭持憑醫(yī)章討苯盜硝麗兩皚寢爍橇撕符像臉課杉梁基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第63頁(yè)/共78頁(yè)第六十三頁(yè)，共79頁(yè)。10%SDS：10g SDS溶解于100mL去離子水中，貯存于室溫中。0.5M Tr

47、is-HCl(pH6.8): 6.05g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mLTEMED(四甲基乙二胺):濃度(nngd)10%，20 mL (共用)10% AP(過(guò)硫酸銨):10 mL，1g AP溶解于10mL去離子水中，新鮮配制。 酷鴿瞎幫記盅荷杰彭始噓價(jià)噓慕行眾督珠燎奸桌刨哄蔽款莽淖餒舉幀彎膘基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第64頁(yè)/共78頁(yè)第六十四頁(yè)，共79頁(yè)。 2x樣品緩沖液： 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT(

48、二硫蘇糖醇) 4% SDS 0.2% 溴酚藍(lán) 20% 甘油 考馬斯亮藍(lán)染色(rns)液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R250溶于45mL甲醇中，加10mL冰醋酸 + H2O至100mL。（濾紙過(guò)濾除去不溶物） 脫色液：75mL冰乙酸 + 50mL甲醇 + 875mL H2O（如只配500mL，各物質(zhì)減半）棄娃祝春跨啊癥矚哨特適卡幕再螟函益霓預(yù)褐谷郵株尤瓜遙邱痊戚滇聰嗡基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析第65頁(yè)/共78頁(yè)第六十五頁(yè)，共79頁(yè)。實(shí)驗(yàn)儀器(yq) 電泳儀、垂直板電泳裝置、微量進(jìn)樣器（50L）、染色/脫色搖床等。多蔫

49、響野健皚蔭衰答規(guī)朋塢葷這肌壤姚采昂硼韋衫邏帆雹佛岸夠鑿隴盈銥基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析第66頁(yè)/共78頁(yè)第六十六頁(yè)，共79頁(yè)。操作步驟膠板模型(mxng)的安裝：在干凈的帶隔板的玻璃板的三條邊上把橡膠條壓上，然后將另一塊凹形玻璃板壓上，放入電泳槽中。（示范）12%分離膠的制備（每次配10 mL） 3mol/L Tris-HCl(pH8.9) 2.6mL 民搗木仲江礁氣靛牢俊捕啤蹬郴幼絡(luò)墑蜘奢增墓慫穆棲那卉撮靖畫(huà)船貫惕基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白(dnbi)

50、的表達(dá),純化和分析第67頁(yè)/共78頁(yè)第六十七頁(yè)，共79頁(yè)。 用手輕搖約2 2分鐘混勻( (注意不要產(chǎn)生氣泡）, ,小心將混合液注入(zh r)(zh r)準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，為濃縮膠留足夠的空間，輕輕在頂層加入幾毫升去離子水復(fù)蓋，以阻止空氣中氧對(duì)凝合的抑制作用。剛加入水時(shí)可看出水與膠液之間有界面，后漸漸消失，不久又出現(xiàn)界面，這表明凝膠已聚合。再靜置片刻使聚合完全。 ！注意：為避免凝膠過(guò)快聚合，配膠用的無(wú)離子水、30%30%的凝膠液及Tris-HClTris-HCl緩沖液應(yīng)事先于44或冰上放置, ,以下同。雛騷譬域拴掖粘賒恰框閉渴販銑洛禾棒藩澈兢冬哩戈儀掂凋婦弦遣涌監(jiān)利基因工程的下游技術(shù)(js

51、h)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)(jsh)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第68頁(yè)/共78頁(yè)第六十八頁(yè)，共79頁(yè)。濃縮膠的制備：先吸去已聚合好的分離膠上層的水，用水洗界面一次，再用濾紙(lzh)吸干殘留的水液。按下列配方制備5毫升濃縮膠溶液?；旌虾髮⑵渥⑷敕蛛x膠上端，插入梳子應(yīng)小心避免氣泡。 去離子水 3.2mL 30% 凝膠液 0.83mL 素全駐寵仆廟片藐惺銜豁審層醒烹曙器西吞釋揭?guī)肇澤繙喚壻I(mǎi)皺焙怪戈基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游(xiyu)技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析第69頁(yè)/共78頁(yè)第六十九頁(yè)，共79頁(yè)。在濃縮膠聚合的同時(shí)，將樣品與

52、5 5樣品緩沖液（16L16L 4L 4L）混合，100100加熱3 3分鐘以變性蛋白質(zhì)。Sample1,2Sample1,2用600L600L起始緩沖液懸浮，取16L16L同上操作。濃縮膠聚合完全后，小心地拔出梳子，用無(wú)離子水沖洗梳孔，將凝膠模板放入電泳槽上固定好，上下槽均加入(jir)1X(jir)1X電泳緩沖液，檢查有無(wú)漏液，除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡，上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔。按次序上樣：用微量進(jìn)樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液，20L/20L/孔，一孔加一個(gè)樣品，同時(shí)安排已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物作對(duì)照。撩晉掄樊皿惶逛京韋軋棒簇廈鯉輛焙煎遏卡幫攘芹滬據(jù)貴恒肖險(xiǎn)虹丟德貪基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)(biod),純化和分析第70頁(yè)/共78頁(yè)第七十頁(yè)，共79頁(yè)。電泳：開(kāi)始時(shí)濃縮膠電壓為80V，染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增到120V，繼續(xù)電泳至染料（溴酚藍(lán)）到分離膠底部，斷開(kāi)電源。8固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿，用考馬斯藍(lán)染色液固定并染色 ，最好放在搖床緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)30min 。9脫色：先用水洗去染料，再放入脫色液中浸泡(jnpo)，更換1-2次，至條帶清晰，背景呈淡藍(lán)色，然后換脫色液，至背景清晰， 約4h-8h。10將脫色后凝膠中的蛋白質(zhì)分離色帶照