常見的生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、一動(dòng)物組織蛋白質(zhì)的提取【目的要求】1掌握動(dòng)物組織蛋白質(zhì)的提取方法。2了解動(dòng)物組織蛋白質(zhì)提取的原理?！緦?shí)驗(yàn)原理】由于蛋白質(zhì)種類很多，性質(zhì)上的差異很大，即或是同類蛋白質(zhì)因選用材料不同使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個(gè)固定的程序適用各類蛋白質(zhì)的分離。但多數(shù)分離工作中的關(guān)鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在不同溶劑中溶解度的差異主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團(tuán)與極性親水基團(tuán)的比例，其次取決于這些基團(tuán)的排列和偶極矩。故分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)是不同

2、蛋白質(zhì)溶解差異的內(nèi)因。溫度、pH、離子強(qiáng)度等是影響蛋白質(zhì)溶解度的外界條件。提取蛋白質(zhì)時(shí)常根據(jù)這些內(nèi)外因素綜合加以利用將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取出來(lái)，并與其它不需要的物質(zhì)分開。但動(dòng)物材料中的蛋白質(zhì)有些以可溶性的形式存在于體液如血漿、消化液等中可以不必經(jīng)過(guò)提取直接進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質(zhì)，只需要適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘陌殡S物，如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質(zhì)，最后剩下的就是不溶性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)經(jīng)細(xì)胞破碎后用水、稀鹽酸及緩沖液等適當(dāng)溶劑將蛋白質(zhì)溶解出來(lái)，再用離心法除去不溶物即得粗提取液?！驹噭┢鞑摹?實(shí)驗(yàn)小鼠20.9NaC13動(dòng)物組織蛋白裂解緩沖液Tris50mM,NaC1150

3、mM，EDTA0.5mM，DTT1mM，TritonX-1001，去氧膽酸鈉0.5，SDS0.14,PMSF/異丙醇儲(chǔ)備液100mM,174mg/10m1于-20儲(chǔ)存5-20儲(chǔ)存的冰塊。【操作步驟】1.頸椎脫白處死小鼠75酒精擦拭皮膚剪開腹部剪切肝臟組織稱取0.6g置于含預(yù)冷0.9NaC16mL的平皿中。2.在平皿中剪碎肝臟組織并轉(zhuǎn)移到勻漿器中。3在預(yù)冷的裂解緩沖液中添加PMSF/異丙醇儲(chǔ)備液20?L/2mL。4迅速將2mL預(yù)冷的裂解緩沖液加入勻漿器中冰浴條件下充分研磨。5將組織研磨液轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中于4離心14000rpml0min。26離心完畢吸取上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心

4、管中即為組織蛋白粗提取液。7所獲蛋白提取液可保存于-20用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或用考馬斯亮藍(lán)等方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定后保存?zhèn)溆谩！咀⒁馐马?xiàng)】在整個(gè)制備過(guò)程中使組織始終處于冰浴狀態(tài)以防蛋白質(zhì)的降解。實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的定量Bradford法【目的要求】掌握考馬斯亮藍(lán)CoomassieBrilliantBlue法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度是利用蛋白質(zhì)與染料結(jié)合的原理定量測(cè)定微量蛋白質(zhì)濃度具有快速、靈敏的特點(diǎn)?？捡R斯亮藍(lán)G-250存在兩種不同的顏色形式紅色和藍(lán)色。當(dāng)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后由紅色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色形式。蛋白質(zhì)與G250的結(jié)合是通過(guò)范德華力實(shí)現(xiàn)的，并且在一定濃度范圍內(nèi)二者的結(jié)

5、合顯色符合朗伯-比爾定律。結(jié)合后的產(chǎn)物在595nm處具有最大吸收峰，通過(guò)對(duì)溶液的光吸收測(cè)定，可獲得與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量?！驹噭┢鞑摹?考馬斯亮藍(lán)試劑考馬斯亮藍(lán)G-250100mg溶于25mL甲醇中加入800mL蒸餾水再加入100mL85磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL濾紙過(guò)濾。2標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液lmg/mL牛血清白蛋白lOOmg加0.9NaCl至100mL。3試管及試管架吸管。4.比色計(jì)。【操作步驟】一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取5支試管編號(hào)按下表操作編號(hào)1號(hào)液、2號(hào)液、3號(hào)液、4號(hào)液、5號(hào)液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液、OmL、0.20、40.60.81.01mg/mL、0.9NaClmL、0.80.60.40.2蛋

6、白質(zhì)濃度200、400、600、800、1000ug/mL。另取6支試管編號(hào)為05按下表操作編號(hào)012345，1號(hào)液2號(hào)液3號(hào)液4號(hào)液5號(hào)液不同濃度蛋白質(zhì)溶液mL0.10.10.10.10.10.9NaCImL0.1考馬斯亮藍(lán)試劑mL555555蛋白質(zhì)含量ug0204060801003混勻各管室溫下靜置10分鐘，于595nm處進(jìn)行比色。二、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。三、測(cè)定未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法同上取適量未知樣品使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的A595nm值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的量從而計(jì)算出未知樣品的蛋白

7、質(zhì)濃度?！咀⒁馐马?xiàng)】1在考馬斯亮藍(lán)試劑加入后的520分鐘內(nèi)測(cè)定光吸收因?yàn)樵诖硕螘r(shí)間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。2測(cè)定中蛋白一染料復(fù)合物會(huì)有少量吸附于比色杯壁上實(shí)驗(yàn)證明此復(fù)合物的吸附量是可以忽略的測(cè)定后可用乙醇將比色杯洗干凈。實(shí)驗(yàn)三SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳【目的要求】1.了解并掌握SDS-PAGE電泳原理及方法。2掌握垂直板電泳的操作方法。【實(shí)驗(yàn)原理】十二烷基硫酸鈉SDS-聚丙烯酰胺凝膠PAGE電泳，可根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別分離蛋白質(zhì)，并可測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量，其原理主要與電泳過(guò)程中存在的特殊物理效應(yīng)有關(guān)1 凝膠的分子篩效應(yīng)，聚丙烯酰胺凝膠是在催化劑的作用下聚合而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的微孔凝膠蛋白質(zhì)顆粒

8、，在電場(chǎng)中通過(guò)此凝膠時(shí)會(huì)受到阻礙。大分子蛋白質(zhì)受到的阻力大，電泳速度小，而小分子蛋白質(zhì)受到的阻力小，移動(dòng)快。因而最終在凝膠中得以分離。2電荷效應(yīng)，SDS是一種表面活性劑，在蛋白樣品和PAGE凝膠中加入SDS則能與蛋白質(zhì)分子上的疏水基團(tuán)結(jié)合，使蛋白質(zhì)表面覆蓋一層SDS分子。由于十二烷基硫酸根帶有大量負(fù)電荷，且電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的帶電量，因而掩蓋了蛋白質(zhì)分子本身的電荷差別，使各種SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有均等密度的負(fù)電荷，分子之間的電荷差異消失。3變性效應(yīng)，SDS同時(shí)還破壞了蛋白質(zhì)中的非共價(jià)鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在溶液中呈現(xiàn)相似的形狀。因此蛋白質(zhì)在SDSPAGE凝膠中的電

9、泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而主要取決于分子量的大小在進(jìn)行SDSPAGE電泳時(shí)同時(shí)使用蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品，則可以在電泳完畢后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量大小得知樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。4凝膠對(duì)樣品的濃縮效應(yīng)SDSPAGE使用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)即分為低濃度的濃縮膠和較高濃度的分離膠，配制這兩種凝膠所用緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度也不相同。電泳時(shí)樣品中的SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物首先經(jīng)過(guò)濃縮膠，體積得到極大的濃縮，然后再經(jīng)過(guò)分離膠被分離。SDSPAGE凝膠已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室常用的蛋白質(zhì)分離方法，通常被用于蛋白質(zhì)制品純度的鑒定和蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。【試劑器材】1,30凝膠貯備液，稱取30g丙烯酰胺和NNV亞甲雙

10、丙烯酰胺0.8g，用去離子水配制成100ml的溶液，過(guò)濾貯存于棕色瓶中，4冰箱保存。2,10凝膠貯備液，稱取10g丙烯酰胺和NN-亞甲雙丙烯酰胺0.5g，用去離子水配制成100ml的溶液，過(guò)濾貯存于棕色瓶中4冰箱保存。3，10SDS用去離子水配制貯存于室溫中。4,ITEMED，NNNN-四甲基乙二胺。5,10過(guò)硫酸銨用去離子水在臨用前配制。6,Tris-甘氨酸電泳緩沖液pH8.3Tris6.0g甘氨酸28.8g10SDS溶液10ml用蒸餾水定容至1000ml。7，1.5mol/LpH8.8Tris-HC1緩沖液稱取Tris1。8, 1.5g加適量蒸餾水溶解用濃HCI調(diào)節(jié)pH值至&8,加蒸餾水至

11、1000ml。0.5mol/L、pH6.8Tris-HC1緩沖液，稱取Tris60.6g加500ml蒸餾水溶解用濃HC1調(diào)節(jié)pH值至6.8加蒸餾水至1000ml。9, 0.05mol/LpH8.0Tris-HCl緩沖液稱取Tris6.1g加500ml蒸餾水溶解用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0加蒸餾水至1000ml。10, 2樣品緩沖液蔗糖4g溴酚藍(lán)2mg10SDS溶液2ml5卩巰基乙醇0.5ml0.05mol/LTris-HClpH8.02ml用蒸餾水定容至10.0ml11, 0.25考馬斯亮藍(lán)R250將2.5g考馬斯亮藍(lán)R250溶解于450ml甲醇中再加入450ml蒸餾水和100ml冰乙酸混勻過(guò)

12、濾除去顆粒物質(zhì)。12, 洗脫液將50ml甲醇和75ml冰乙酸溶解于875ml蒸餾水中混勻。13, 預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：117kD、90kD、49kD、35kD、26kD、19kD共6種蛋白質(zhì)14, 電泳槽、電泳儀、掃描儀、染色缸、搖床、一次性手套、微量加樣器等。操作步驟】1 制備凝膠1準(zhǔn)備玻璃板洗凈、晾干。按電泳槽使用說(shuō)明裝好按下表配制12分離膠溶液5和5濃縮膠溶液表3-1濃縮膠與分離膠的配制溶液成分12分離膠溶液ml5濃縮膠溶液ml30凝膠貯備液4.010凝膠貯備液2.51.5mol/LpH8.8Tris-HC12.5，0.5mo/LpH6.8Tris-HCl1.25，10SDS0.1，0

13、.051TEMED0.8，0.4蒸餾水2.50.7510過(guò)硫酸銨0.10.05總體積10.05.02小心將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻璃間隙中并為濃縮膠留有空間。輕輕在頂層加入幾毫升去離子水以阻止空氣中的氧對(duì)凝膠聚合的抑制作用。3凝膠聚合后倒掉上層水用濾紙吸干凝膠頂端的水。4按表3-1配制濃縮膠注入分離膠上端插入梳子應(yīng)小心避免產(chǎn)生氣泡。2點(diǎn)樣1待測(cè)蛋白樣品的制備若樣品為水溶液且蛋白質(zhì)含量大于10mg/ml可將待測(cè)液與樣品緩沖液等體積混勻100加熱3min。2 濃縮膠聚合后拔去梳子將凝膠放入電泳槽中在上、下槽中加入電泳緩沖液3將樣品混合液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白按次序加入梳孔中。3電泳起始電壓為8V/cm當(dāng)染料進(jìn)入分

14、離膠后將電壓調(diào)至15V/cm繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部關(guān)閉電源。4 染色取下凝膠將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中在搖床上室溫緩慢搖動(dòng)30-60min。5 脫色換洗脫液于搖床上室溫緩慢搖動(dòng)12小時(shí)其間更換12次洗脫液。洗脫后的凝膠可以照像或干燥也可置于含有20甘油的水中密閉保存。【注意事項(xiàng)】1SDS-PAGE電泳要求樣品的離子強(qiáng)度盡量要低如果離子強(qiáng)度過(guò)高應(yīng)經(jīng)透析或離子交換除鹽后再進(jìn)行電泳。2 丙烯酰胺試劑是一種神經(jīng)毒素可通過(guò)皮膚吸收會(huì)因多次積蓄而中毒。操作時(shí)應(yīng)極其小心需要帶一次性手套。3 上樣量以1015ul為宜如果樣品蛋白含量過(guò)少為保證區(qū)帶清晰可增加上樣量6同時(shí)應(yīng)將樣品緩沖液濃度提高二倍或更

15、高。4 溴酚藍(lán)染料是指示劑為電泳時(shí)可見的遷移標(biāo)志物。5 凝膠聚合的時(shí)間與溫度有關(guān)夏天聚合快可置于冰浴中減慢聚合冬天室溫低可放入溫箱中加快聚合。實(shí)驗(yàn)四蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn)半干式【目的要求】1掌握半干式蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印技術(shù)的基本操作。2掌握蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印后的檢測(cè)方法。【實(shí)驗(yàn)原理】蛋白質(zhì)印跡Westernblotting是將蛋白質(zhì)電泳分離技術(shù)與免疫標(biāo)記技術(shù)結(jié)合所形成的一種鑒定特異性抗原的方法。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印應(yīng)先將含某抗原的蛋白混合物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳使各種蛋白成分根據(jù)分子量的不同分離開來(lái)再通過(guò)電轉(zhuǎn)移將各種蛋白成分轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜NC或PVDF膜上通過(guò)特異試劑抗體作為探針與膜上的相應(yīng)抗原發(fā)生

16、結(jié)合再與酶標(biāo)記的抗Ig抗體結(jié)合洗滌后加入底物進(jìn)行顯色。根據(jù)顯色條帶的位置和深淺可以對(duì)抗原及其分子量或相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)。蛋白質(zhì)的Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種優(yōu)點(diǎn)可檢測(cè)到低至1-5ng的靶蛋白。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是采用半干式電轉(zhuǎn)移將SDS-PAGE凝膠電泳分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持材料上。裁剪與凝膠一樣大小的硝酸纖維素膜用去離子水浸濕后再浸入轉(zhuǎn)移緩沖液內(nèi)隨后取出進(jìn)行轉(zhuǎn)移半干式電轉(zhuǎn)移在室溫操作所需時(shí)間較短將凝膠及與之相貼的硝酸纖維素膜夾于事先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過(guò)的濾紙之間平放在電轉(zhuǎn)儀上負(fù)極在上正極在下凝膠在陰極端薄膜在陽(yáng)極端轉(zhuǎn)移方向從陰極到陽(yáng)極根據(jù)

17、凝膠面積設(shè)置電流室溫下進(jìn)行轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移結(jié)束取出薄膜麗春紅染色檢測(cè)轉(zhuǎn)印效果?！驹噭┢鞑摹?半干式電泳轉(zhuǎn)印槽2硝酸纖維素膜3濾紙4轉(zhuǎn)移電泳儀5培養(yǎng)皿6萬(wàn)向旋轉(zhuǎn)搖床7轉(zhuǎn)印緩沖液【操作步驟】1將電泳后的SDSPAGE凝膠浸在轉(zhuǎn)印緩沖液中洗10min。2 去掉濃縮膠測(cè)量剩余膠的尺寸大小。3 剪1張和膠大小一致的硝酸纖維素膜，用鉛筆在膜的右下角做一個(gè)標(biāo)記用于定位。剪6張和膠大小一致的濾紙，尺寸一定不能大于膠的尺寸，否則多出的部分會(huì)在膠的邊緣接觸形成短路導(dǎo)致轉(zhuǎn)移不充分。4 將膜及濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)印緩沖液中浸潤(rùn)10min。5 將3張濕濾紙放到半干電轉(zhuǎn)儀的底部平板電極上負(fù)極，然后依次放置膠、硝酸纖維素膜、濾紙3張注意堆放整

18、齊同時(shí)注意每層之間避免氣泡存在，一般可用試管碾壓趕走氣泡，注意一旦膠和膜接觸位于膠表面的蛋白就會(huì)結(jié)合到膜上，所以膠一定要一次成功，不要試圖調(diào)整膠的位置，否則蛋白質(zhì)色帶可能會(huì)印上去最后產(chǎn)生重迭影像。6 待所有的膜和膠都放好后，蓋上轉(zhuǎn)印儀的上蓋，讓上部的平板電極壓緊由濾紙、膜、膠形成的三明治結(jié)構(gòu)，注意正負(fù)極，轉(zhuǎn)印結(jié)束后才可以打開上蓋。7連接轉(zhuǎn)移電泳儀電流通常設(shè)為lmA/cm2左右。8cmX7cm的膠通常使用100mA恒流轉(zhuǎn)移。大膠必須限制電流在0.8mA/cm2防止電流過(guò)大產(chǎn)生過(guò)多熱量影響轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印時(shí)間如下表所示。8轉(zhuǎn)印結(jié)束取出轉(zhuǎn)印三明治打開后依次取出轉(zhuǎn)印膜及凝膠。9將轉(zhuǎn)印膜浸入麗春紅染色液中觀察

19、是否有紅色蛋白條帶出現(xiàn)轉(zhuǎn)印后的凝膠可以進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色看有無(wú)蛋白質(zhì)殘留若電泳時(shí)加有預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker則可在轉(zhuǎn)印膜上看到相應(yīng)色帶幫助確定轉(zhuǎn)印成功并可評(píng)估轉(zhuǎn)印效率。10若繼續(xù)進(jìn)行免疫雜交實(shí)驗(yàn)則用去離子水漂洗轉(zhuǎn)印膜后可進(jìn)行封閉?！咀⒁馐马?xiàng)】1.不要切去膠的一角以作標(biāo)記因?yàn)檫@樣容易導(dǎo)致短路或轉(zhuǎn)移不充分。盡可能在電泳結(jié)束后就進(jìn)行轉(zhuǎn)印防止樣品在膠內(nèi)彌散開來(lái)。2. 丙烯酰胺濃度越低蛋白越容易轉(zhuǎn)移下來(lái)。所以應(yīng)選擇可以分離蛋白最低濃度的凝膠進(jìn)行電泳。梯度膠適用于轉(zhuǎn)印一系列不同大小的蛋白因?yàn)槟z的孔與不同大小的蛋白匹配良好。3. 蛋白質(zhì)結(jié)合到硝酸纖維素膜上主要是通過(guò)疏水鍵對(duì)于常規(guī)使用效果非常好。但對(duì)于小

20、的多肽建議使用小孔徑0.2um的膜。表4-1轉(zhuǎn)印時(shí)間和蛋白分子量的關(guān)系分子量MW轉(zhuǎn)印時(shí)間1t20kDa30分鐘20kDa80kDa60分鐘gt80kDa90分鐘以8X7cm的迷你膠在100mA恒流的條件為例84. PVDF膜比硝酸纖維素膜更疏水在轉(zhuǎn)印過(guò)程中結(jié)合蛋白更緊密可以耐受更多的SDS。目前PVDF膜一般比硝酸纖維素膜需要更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆忾]條件適用于蛋白測(cè)序。尼龍膜通過(guò)疏水和靜電相互作用結(jié)合其SDS耐受度甚至高于PVDF膜但也需要更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓绱玳]條件主要建議用于Northern和Southern雜交。實(shí)驗(yàn)五質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法【目的要求】1掌握堿裂解法制備質(zhì)粒DNA的原理和方法進(jìn)一步認(rèn)識(shí)質(zhì)粒D

21、NA的性質(zhì)。2初步掌握分子克隆基本操作技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】質(zhì)粒plasmid是能在染色體外自我復(fù)制的穩(wěn)定共生型遺傳單位主要存在于細(xì)菌、放線菌、真菌和某些動(dòng)植物細(xì)胞中。它能在細(xì)菌中垂直遺傳且保持穩(wěn)定的拷貝數(shù)賦予宿主細(xì)胞某些特殊的表型。迄今為止從細(xì)菌中分離得到的質(zhì)粒都是雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子大小為lkb200kb。在基因工程研究中質(zhì)粒是最常用的一種基因克隆載體用于運(yùn)載外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞。因此質(zhì)粒DNA的提取和純化是分子生物學(xué)技術(shù)中的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作。質(zhì)粒DNA提取的關(guān)鍵是要與細(xì)菌染色質(zhì)DNA分開。常用的提取方法有煮沸法、堿裂解法、去污劑法、有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等不同方法各有利弊應(yīng)根據(jù)不同質(zhì)粒的性質(zhì)、不

22、同宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合加以選擇。一般以堿裂解法最為常用因?yàn)樗鼘?duì)細(xì)菌的裂解完全對(duì)染色質(zhì)DNA和蛋白質(zhì)的變性充分因而所提取的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高、純度高。但如果堿變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有可能會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA變性導(dǎo)致隨后的內(nèi)切酶酶切困難。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的主要原理和步驟是1 接種含質(zhì)粒的單個(gè)菌落到培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)質(zhì)粒DNA也隨之自主復(fù)制。必要時(shí)可以在細(xì)菌生長(zhǎng)后期在培養(yǎng)基中適量加入氯霉素以抑制宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和染色質(zhì)DNA的復(fù)制細(xì)菌的數(shù)量不再增加而質(zhì)粒DNA的復(fù)制基本不受影響從而大量擴(kuò)增質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)。2 離心收集細(xì)菌。3 加入強(qiáng)堿溶液裂解菌體必要時(shí)可以適量加入溶

23、菌酶。此時(shí)大分子量線狀的細(xì)菌染色質(zhì)DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生變性而閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA多數(shù)仍不變性處于自然狀態(tài)。4 幾分鐘后加入中和液將pH值調(diào)至中性。在高鹽濃度條件下大部分染色質(zhì)DNA與蛋白質(zhì)不能復(fù)性交連成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在去污劑SDS的作用下形成絮狀沉淀。而質(zhì)粒DNA分子量小且為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)少數(shù)變性的質(zhì)粒DNA也能夠迅速?gòu)?fù)性呈溶解狀態(tài)。95離心去除大部分細(xì)胞碎片、染色質(zhì)DNA、RNA和蛋白質(zhì)。質(zhì)粒DNA保留在上清中。6 最后再用RNA酶消化酚/氯仿抽提、透析和乙醇或異丙醇沉淀等方法進(jìn)一步去除殘余蛋白質(zhì)和核酸純化質(zhì)粒DNA。【試劑器材】1LB培養(yǎng)基蛋白胨10g酵母抽提液5gNaC110g加蒸餾水至lOOOmL用NaOH調(diào)pH至7.5高壓蒸汽消毒20min。21號(hào)液50mmo1/L葡萄糖25mmo1/LTris-ClpH&010mmo1/LEDTA必要時(shí)在使用前加溶菌酶4mg/mL3I號(hào)液0.2mol/LNaOH含1SDSII號(hào)液必須在實(shí)驗(yàn)時(shí)新鮮配制4I號(hào)液