第四章核酸序列分析1

1、1第四章第四章 DNA序列分析序列分析21 如何查詢下列文獻(xiàn)：如何查詢下列文獻(xiàn)：Wan, Y. and Lemaux, P.G. Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol. 1994 ,104: 3748.回顧回顧2 2上次上機(jī)操作內(nèi)容簡(jiǎn)要說明。上次上機(jī)操作內(nèi)容簡(jiǎn)要說明。3序列分析序列分析其實(shí)就是從已知蛋白質(zhì)、其實(shí)就是從已知蛋白質(zhì)、RNA、DNA序列作出序列作出生物學(xué)推論生物學(xué)推論的過程。的過程。4主要內(nèi)容主要內(nèi)容4.1 引言引言4.2 序列的一般分

2、析序列的一般分析4.3 基因預(yù)測(cè)與鑒定基因預(yù)測(cè)與鑒定4.4 非編碼區(qū)分析與調(diào)控元件識(shí)別非編碼區(qū)分析與調(diào)控元件識(shí)別54.1 引引 言言6一、一、DNA序列分析的意義序列分析的意義uDNA序列分析是生物信息學(xué)中的重要內(nèi)容之一序列分析是生物信息學(xué)中的重要內(nèi)容之一u DNA是生物遺傳信息的最終決定者是生物遺傳信息的最終決定者u DNA序列攜帶的遺傳信息具有極高的復(fù)雜性序列攜帶的遺傳信息具有極高的復(fù)雜性u(píng) DNA序列分析是揭示遺傳語(yǔ)言復(fù)雜性的基本過程序列分析是揭示遺傳語(yǔ)言復(fù)雜性的基本過程7二、基因結(jié)構(gòu)與功能簡(jiǎn)介二、基因結(jié)構(gòu)與功能簡(jiǎn)介原核生物基因結(jié)構(gòu)原核生物基因結(jié)構(gòu)1 1 長(zhǎng)開放閱讀框長(zhǎng)開放閱讀框2 2

3、高基因密度高基因密度3 3 簡(jiǎn)單的基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的基因結(jié)構(gòu)4 4 基因組中基因組中GCGC含量變化非常大含量變化非常大特點(diǎn)：特點(diǎn)：8真核生物基因結(jié)構(gòu)真核生物基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：特點(diǎn)：1 1 基因組規(guī)模大基因組規(guī)模大2 2 非編碼區(qū)序列占絕大部分（人類，非編碼區(qū)序列占絕大部分（人類，9797）3 3 基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜4 4 具有復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式具有復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式5 5 具有豐富的可變剪接具有豐富的可變剪接6 6 有明顯的有明顯的CpGCpG島、密碼子使用具有偏好性島、密碼子使用具有偏好性9v 序列一般性分析序列一般性分析v 基因識(shí)別與鑒定基因識(shí)別與鑒定v 非編碼區(qū)分析及調(diào)控元件識(shí)別

4、非編碼區(qū)分析及調(diào)控元件識(shí)別四、四、DNA序列分析基本內(nèi)容序列分析基本內(nèi)容104.2 DNA序列的一般分析序列的一般分析11華北制藥集團(tuán)的談杰創(chuàng)建的一個(gè)非常有用的生華北制藥集團(tuán)的談杰創(chuàng)建的一個(gè)非常有用的生物信息學(xué)資源網(wǎng)站。物信息學(xué)資源網(wǎng)站。http:/www.bio- CalculatorOligo Calculator、BioEditBioEdit、DNAMANDNAMAN等進(jìn)行綜合計(jì)算。等進(jìn)行綜合計(jì)算。Oligo Calculator ,/JaMBW/ 一、序列統(tǒng)計(jì)一、序列統(tǒng)計(jì)17JaMBW是一個(gè)分子生物學(xué)軟件包，功能包括：序列格式是一

5、個(gè)分子生物學(xué)軟件包，功能包括：序列格式轉(zhuǎn)換、求序列的補(bǔ)體序列與逆序列、將轉(zhuǎn)換、求序列的補(bǔ)體序列與逆序列、將DNA序列翻譯成序列翻譯成蛋白序列、序列分析、蛋白序列、序列分析、 多序列比較、特征位點(diǎn)查找、多序列比較、特征位點(diǎn)查找、3維維分子結(jié)構(gòu)查看、分子結(jié)構(gòu)查看、PCR引物設(shè)計(jì)、緩沖液設(shè)計(jì)等功能，包引物設(shè)計(jì)、緩沖液設(shè)計(jì)等功能，包含了分子生物學(xué)研究常用的一些操作。含了分子生物學(xué)研究常用的一些操作。JaMBW是一個(gè)非是一個(gè)非常出色的工具軟件。常出色的工具軟件。以以JaMBW 的的Oligo CalculatorOligo Calculator為例演示為例演示181920計(jì)算結(jié)果：計(jì)算結(jié)果：21序列轉(zhuǎn)換

6、主要包括兩方面的工作：序列轉(zhuǎn)換主要包括兩方面的工作： 1 1）序列格式轉(zhuǎn)換）序列格式轉(zhuǎn)換 2 2）互補(bǔ)與反向序列格式轉(zhuǎn)換）互補(bǔ)與反向序列格式轉(zhuǎn)換序列轉(zhuǎn)換序列轉(zhuǎn)換是分子生物學(xué)和生物信息學(xué)研究中最常遇到的工是分子生物學(xué)和生物信息學(xué)研究中最常遇到的工作之一，因此，掌握序列轉(zhuǎn)換的常用方法是分子生物學(xué)家作之一，因此，掌握序列轉(zhuǎn)換的常用方法是分子生物學(xué)家和生物信息學(xué)家的基本要求。和生物信息學(xué)家的基本要求。二、序列轉(zhuǎn)換二、序列轉(zhuǎn)換22ReadSeq是目前最流行的格式處理軟件之一。是美國(guó)印是目前最流行的格式處理軟件之一。是美國(guó)印第安那大學(xué)的第安那大學(xué)的Don Gilbert開發(fā)編制的。開發(fā)編制的。支持支持23

7、種序列格式的轉(zhuǎn)換，幾乎囊括了目前所有的一種序列格式的轉(zhuǎn)換，幾乎囊括了目前所有的一級(jí)序列格式。級(jí)序列格式。/molbio/readseq/1 1 序列格式轉(zhuǎn)換序列格式轉(zhuǎn)換23選擇輸出選擇輸出格式格式24EMBLEMBL格式格式）序列標(biāo)準(zhǔn)格式）序列標(biāo)準(zhǔn)格式 XX(XX(不能少）不能少）YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY2 2）序列長(zhǎng)度少于）序列長(zhǎng)度少于1818bpbp時(shí)一時(shí)一定要用標(biāo)準(zhǔn)格式定要用標(biāo)準(zhǔn)格式3 3）序列長(zhǎng)度大于）序列長(zhǎng)度大于1818bpbp時(shí)，時(shí)，“XX”XX”可省去。可省去。序列格式說明：序列格式說明：2

8、52 互補(bǔ)與反向序列格式轉(zhuǎn)換互補(bǔ)與反向序列格式轉(zhuǎn)換RevSeqRevSeq程序是一款專門將序列進(jìn)行反向和互程序是一款專門將序列進(jìn)行反向和互補(bǔ)轉(zhuǎn)換的小工具。補(bǔ)轉(zhuǎn)換的小工具。個(gè)頭雖小，但很實(shí)用。它是著名的生物信息個(gè)頭雖小，但很實(shí)用。它是著名的生物信息學(xué)軟件包學(xué)軟件包EMBOSSEMBOSS的一個(gè)成員。的一個(gè)成員。http:/mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?form=revseq26粘貼序列粘貼序列上傳序列文件上傳序列文件1）反向鏈）反向鏈2）互補(bǔ)鏈）互補(bǔ)鏈3）反向互補(bǔ)鏈）反向互補(bǔ)鏈改變文件名改變文件名27要求填寫要求填寫E-mailE-mail地址地址28填

9、寫驗(yàn)證碼填寫驗(yàn)證碼29互補(bǔ)反向鏈互補(bǔ)反向鏈輸出轉(zhuǎn)換結(jié)果輸出轉(zhuǎn)換結(jié)果30同時(shí)轉(zhuǎn)換多條序列同時(shí)轉(zhuǎn)換多條序列31三、序列翻譯三、序列翻譯所謂序列翻譯，是指用計(jì)算機(jī)程序把核酸序列按三所謂序列翻譯，是指用計(jì)算機(jī)程序把核酸序列按三聯(lián)體密碼規(guī)則翻譯成蛋白質(zhì)序列。聯(lián)體密碼規(guī)則翻譯成蛋白質(zhì)序列。6 6框架翻譯，即從正向框架翻譯，即從正向1 1，2 2，3 3位堿基開始按三聯(lián)體密位堿基開始按三聯(lián)體密碼規(guī)則翻譯成碼規(guī)則翻譯成3 3條蛋白質(zhì)序列以及從反向條蛋白質(zhì)序列以及從反向1 1，2 2，3 3位堿位堿基開始翻譯得到基開始翻譯得到3 3條蛋白質(zhì)序列，共條蛋白質(zhì)序列，共6 6條蛋白質(zhì)序列。條蛋白質(zhì)序列。問題：?jiǎn)栴}：

10、究競(jìng)蛋白質(zhì)序列是不是真正表達(dá)的蛋白產(chǎn)物？究競(jìng)蛋白質(zhì)序列是不是真正表達(dá)的蛋白產(chǎn)物？方法：方法： 1 1）對(duì)于已知蛋白，可進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索判斷序列的可靠性。）對(duì)于已知蛋白，可進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索判斷序列的可靠性。 2 2）對(duì)于未知新基因，則需要參考序列的其他特定信息。）對(duì)于未知新基因，則需要參考序列的其他特定信息。3233許多程序?qū)υS多程序?qū)NADNA序列一次進(jìn)行全部序列一次進(jìn)行全部6 6個(gè)閱讀框的翻譯。個(gè)閱讀框的翻譯。程序之一程序之一：EBIEBI著名軟件包著名軟件包EMBOSSEMBOSS中的中的TranseqTranseqhttp:/www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/特點(diǎn)：

11、特點(diǎn)： 1 1）輸入序列可以是原始序列，也可以是）輸入序列可以是原始序列，也可以是GCGGCG，F(xiàn)astaFasta，EMBLEMBL，GenBankGenBank，PIRPIR等格式。等格式。 2 2）可一次翻譯成）可一次翻譯成1 1條，同向條，同向3 3條，雙向條，雙向6 6條蛋白質(zhì)序列。條蛋白質(zhì)序列。 3 3）翻譯時(shí)可選擇標(biāo)準(zhǔn)密碼子或其他類型的密碼子）翻譯時(shí)可選擇標(biāo)準(zhǔn)密碼子或其他類型的密碼子34Transeq主頁(yè)主頁(yè)35翻譯結(jié)果（翻譯結(jié)果（6框架）框架）36程序之二程序之二： ExPASyExPASy的的Translate ToolTranslate Toolhttp:/us.expas

12、/tools/dna.html特點(diǎn)：特點(diǎn)： 1 1）程序簡(jiǎn)單，沒有太多的可選項(xiàng)，運(yùn)行速度快。）程序簡(jiǎn)單，沒有太多的可選項(xiàng)，運(yùn)行速度快。 2 2）一次翻譯雙向）一次翻譯雙向6 6條蛋白質(zhì)序列。條蛋白質(zhì)序列。 3 3）輸出結(jié)果較）輸出結(jié)果較TranseqTranseq清楚，不僅將終止密碼子用清楚，不僅將終止密碼子用StopStop英文單詞表示，還將起始密碼子以英文單詞表示，還將起始密碼子以METMET標(biāo)記出來(lái)標(biāo)記出來(lái)37Translate ToolTranslate Tool主頁(yè)主頁(yè)38Translate ToolTranslate Tool翻譯結(jié)果翻譯結(jié)果39程序之三程序之三： NCB

13、INCBI的的ORF finderORF finder/gorf/gorf.html特點(diǎn)：特點(diǎn)： 1 1）輸入序列只能是）輸入序列只能是FastaFasta格式。格式。 2 2）輸出結(jié)果以圖形化表示，并將核酸序列與氨基酸序）輸出結(jié)果以圖形化表示，并將核酸序列與氨基酸序列同時(shí)排列出來(lái)。列同時(shí)排列出來(lái)。 3 3）可將結(jié)果直接用）可將結(jié)果直接用BlastBlast進(jìn)行序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)。進(jìn)行序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)。40ORF Finder主頁(yè)主頁(yè)41ORF Finder ORF Finder 翻譯結(jié)果翻譯結(jié)果No responseNo response

14、4243四、序列的限制性酶切分析四、序列的限制性酶切分析 酶切條件的分析是根據(jù)酶切條件的分析是根據(jù)限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶能識(shí)別能識(shí)別DNADNA分分子中的特定序列并在某一堿基處切開序列。而用幾子中的特定序列并在某一堿基處切開序列。而用幾種不同的內(nèi)切酶可切割某特定基因，以便于進(jìn)一步種不同的內(nèi)切酶可切割某特定基因，以便于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)（如基因的克隆，表達(dá)重組體的構(gòu)建等）。實(shí)驗(yàn)（如基因的克隆，表達(dá)重組體的構(gòu)建等）。 與與PCRPCR一樣，酶切實(shí)驗(yàn)是目前分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室最一樣，酶切實(shí)驗(yàn)是目前分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一，因此，酶切圖譜分析程序也常用的實(shí)驗(yàn)方法之一，因此，酶切圖譜分析程序也成為了最

15、常用的分子生物學(xué)軟件之一。成為了最常用的分子生物學(xué)軟件之一。限制性內(nèi)切酶數(shù)據(jù)庫(kù)：限制性內(nèi)切酶數(shù)據(jù)庫(kù)： REBASEREBASE（Restriction Enzyme DatabaseRestriction Enzyme Database），），由新由新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室管理維護(hù)。英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室管理維護(hù)。http:/ NEBcutterNEBcutter 該程序是與該程序是與REBASEREBASE整合在一起的免費(fèi)限制性內(nèi)切整合在一起的免費(fèi)限制性內(nèi)切酶分析軟件酶分析軟件特點(diǎn)特點(diǎn)1 1）既可對(duì)我們自已的序列進(jìn)行分析，也可對(duì)）既可對(duì)我們自已的序列進(jìn)行分析，也可對(duì)GenBankGenBank中中的序列

16、進(jìn)行分析。的序列進(jìn)行分析。2 2）分析長(zhǎng)度不能超過）分析長(zhǎng)度不能超過300300kbasekbase。3)3)限制性內(nèi)切酶種類最齊全，提供限制性內(nèi)切酶種類最齊全，提供NEBNEB數(shù)據(jù)庫(kù)中的內(nèi)切數(shù)據(jù)庫(kù)中的內(nèi)切酶和商業(yè)內(nèi)切酶的酶切結(jié)果。酶和商業(yè)內(nèi)切酶的酶切結(jié)果。4 4）結(jié)果圖形化顯示，具有非常友好的交互性。）結(jié)果圖形化顯示，具有非常友好的交互性。48REBASE 主頁(yè)主頁(yè)REBASEREBASE工工具選項(xiàng)具選項(xiàng)49NEBcutterNEBcutter工具工具50NEBcutterNEBcutter工具主頁(yè)工具主頁(yè)結(jié)果可保存結(jié)果可保存2 2天天51線性表示的酶切結(jié)果線性表示的酶切結(jié)果52環(huán)形表示的酶

17、切結(jié)果環(huán)形表示的酶切結(jié)果53五、載體繪制五、載體繪制不論是在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)還是撰寫論文中，不論是在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)還是撰寫論文中，載體繪載體繪制制是一項(xiàng)經(jīng)常遇到的工作。是一項(xiàng)經(jīng)常遇到的工作。載體（載體（vectorvector）是指運(yùn)載外源是指運(yùn)載外源DNADNA有效進(jìn)入受體細(xì)有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。胞內(nèi)的工具。54作為載體應(yīng)滿足以下幾方面的要求：作為載體應(yīng)滿足以下幾方面的要求：(1)(1)有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn)，最好是有許多種限制酶有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn)，最好是有許多種限制酶的切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)只有一個(gè)；的切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)只有一個(gè)；(2)(2)外源外源DNADNA插入后不影響載體在

18、受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)插入后不影響載體在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，載體對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，能接納盡可能長(zhǎng)的外源制，載體對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，能接納盡可能長(zhǎng)的外源DNADNA片段；片段；(3)(3)具有利于選擇的標(biāo)記基因，可以很方便地知道外源具有利于選擇的標(biāo)記基因，可以很方便地知道外源DNADNA已經(jīng)插入，以及把接受了載體的受體細(xì)胞選出；已經(jīng)插入，以及把接受了載體的受體細(xì)胞選出；(4)(4)具有促進(jìn)外源具有促進(jìn)外源DNADNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)。表達(dá)的調(diào)控區(qū)。55載體分類載體分類按生物屬性分：非病毒類和病毒類按生物屬性分：非病毒類和病毒類按功能分：克隆載體和表達(dá)載體按功能分：克隆載體和表達(dá)載體按進(jìn)入細(xì)胞類型分：原核

19、載體、真核載體和按進(jìn)入細(xì)胞類型分：原核載體、真核載體和 穿梭載體（穿梭載體（shuttle vectorshuttle vector）56各種基于本地機(jī)和各種基于本地機(jī)和WebWeb在線設(shè)計(jì)的載體作圖軟件在線設(shè)計(jì)的載體作圖軟件都比較多。都比較多?；诨赑CPC本地機(jī)的軟件本地機(jī)的軟件：pDRAW32,pDRAW32,WinplasWinplas，Sim VectorSim Vector等。等。 基于基于Web Web 在線設(shè)計(jì)的軟件在線設(shè)計(jì)的軟件：SavvySavvy（Scalable Vector Scalable Vector Graphics Plasmid MapGraphics P

20、lasmid Map）/savvy/57585960本地機(jī)安裝軟件本地機(jī)安裝軟件Winplas2.7Winplas2.7本程序無(wú)須安裝，直接打開使用。本程序無(wú)須安裝，直接打開使用。載體元件分三類：載體元件分三類：ARCARC、 MarkerMarker、 TextText61七、引物設(shè)計(jì)七、引物設(shè)計(jì)在基因克隆、核酸分子雜交、在基因克隆、核酸分子雜交、DNADNA序列測(cè)定和序列測(cè)定和PCRPCR等等實(shí)驗(yàn)中，都需要使用寡核苷酸作為探針或引物。而實(shí)驗(yàn)中，都需要使用寡核苷酸作為探針或引物。而實(shí)驗(yàn)的成敗與探針或引物的設(shè)計(jì)密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)的成敗與探針或

21、引物的設(shè)計(jì)密切相關(guān)。62一個(gè)優(yōu)化的寡核苷酸引物在設(shè)計(jì)過程中應(yīng)考慮的幾個(gè)基一個(gè)優(yōu)化的寡核苷酸引物在設(shè)計(jì)過程中應(yīng)考慮的幾個(gè)基本問題：本問題：1 1）引物的引物的33末端不互補(bǔ)末端不互補(bǔ) 避免形成引物二聚體避免形成引物二聚體2 2）引物分子內(nèi)不互補(bǔ)引物分子內(nèi)不互補(bǔ) 避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)3 3）引物的組分和解鏈溫度引物的組分和解鏈溫度 理想的引物應(yīng)當(dāng)有理想的引物應(yīng)當(dāng)有5050的的GCGC含量含量，40-60% 40-60% 均能滿均能滿足足PCRPCR的擴(kuò)增要求。的擴(kuò)增要求。635 5）引物內(nèi)部穩(wěn)定性引物內(nèi)部穩(wěn)定性 在在DNADNA測(cè)序和測(cè)序和PCRPCR中最好用中最好用55末端穩(wěn)定（末端穩(wěn)定（GCGC含量高一含量高一些些) )，而，而3 3 末端不太穩(wěn)定（末端不太穩(wěn)定（ATAT含量高一些）的引物。含量高一些）的引物。6 6）引物的特異性引物的特異性 為獲得最終單一的為獲得最終單一的PCRPCR產(chǎn)物片段，選用的引物序列就產(chǎn)物片段，選用的引物序列就應(yīng)當(dāng)是唯一和特異的，即在模板中沒有重復(fù)序列。應(yīng)當(dāng)是唯一和特異的，即在模板中沒有重復(fù)序列。4 4）引物長(zhǎng)度引物長(zhǎng)度 產(chǎn)物長(zhǎng)度等于或小于產(chǎn)物長(zhǎng)度等于或小于500500bp,bp,引物長(zhǎng)度可短一些引物長(zhǎng)度可短一些16-1816-18bpbp