卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)制與臨床應(yīng)用

1、卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)制與臨床應(yīng)用主講人：鄭月慧南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院2017年7月8日一、卵母細(xì)胞體外成熟的定義、應(yīng)用及其發(fā)展現(xiàn)狀二、卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)理及其調(diào)控三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評估我將從以下三個方面陳訴：一、卵母細(xì)胞體外成熟的定義、應(yīng)用及其發(fā)展現(xiàn)狀 卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)(IVM)是一項(xiàng)輔助生殖技術(shù)，簡單地講就是，將卵巢小卵泡中的未成熟卵子取出，放在模擬體內(nèi)卵泡微環(huán)境的培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)到成熟階段，排出第一極體，再進(jìn)行體外授精技術(shù)幫助受精，體外受精過程與體內(nèi)成熟的卵子大同小異。1、什么是卵母細(xì)胞的什么是卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)？體外成熟技術(shù)？IVM Treatment一

2、、卵母細(xì)胞體外成熟的定義、應(yīng)用及其發(fā)展現(xiàn)狀2、未成熟卵體外成熟技術(shù)未成熟卵體外成熟技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展的應(yīng)用及其發(fā)展 上世紀(jì)九十年代，試管嬰兒之父愛德華茲先生就把卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)（IVM），作為輔助生殖技術(shù)未來發(fā)展的三大前景技術(shù)之一三大前景技術(shù)之一，其它兩個技術(shù)是微刺激和自然周期試管嬰兒技術(shù)。 近十余年來，IVM技術(shù)遍布全世界，對于一種不用或減少卵巢刺激，提高患者舒適度的治療理念，人們一直在努力嘗試更好的體外培養(yǎng)條件，以獲得更高的成功率目目前前應(yīng)應(yīng)用用卵巢多囊綜合征卵巢多囊綜合征（PCOS）患者）患者卵巢高度反應(yīng)有卵巢過度卵巢高度反應(yīng)有卵巢過度刺激綜合征（刺激綜合征（OHSS）病史）病史卵巢

3、不適于藥物刺激而本卵巢不適于藥物刺激而本身又沒有成熟卵泡生長身又沒有成熟卵泡生長對自然周期對自然周期IVF治療同時取治療同時取出其余小卵泡（出其余小卵泡（IVF/IVM）一、卵母細(xì)胞體外成熟的定義、應(yīng)用及其發(fā)展現(xiàn)狀3、體外成熟技術(shù)安全嗎？、體外成熟技術(shù)安全嗎？ 這同樣也是我們醫(yī)護(hù)人員們最為關(guān)心的問題。 IVM出生的孩子遍布世界各地，目前全世界大概有500010000名體外成熟卵試管嬰兒健康成長。其妊娠率可達(dá)到與體內(nèi)成熟卵相當(dāng)（3550%）。結(jié)果表明，較其他輔助生殖技術(shù)，IVM技術(shù)并沒有增加子代異常的風(fēng)險 但是，畢竟卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)，將使卵子暴露于體外條件更長時間，理論上增加了卵子受培養(yǎng)環(huán)境

4、影響的風(fēng)險，在基因編程、表觀遺傳學(xué)、倫理學(xué)等方面，還需要更加深入的研究和探索。因此目前該技術(shù)只是適用于特殊人群，還沒有普及到每一例試管嬰兒二、卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)理及其調(diào)控 與自然狀態(tài)下和傳統(tǒng)的IVF等輔助生殖技術(shù)中卵母細(xì)胞成熟方式不同，IVM未成熟卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂在體外完成，該過程受如下多種因素影響： 1、取卵方式與時間取卵方式與時間 2、體外培養(yǎng)方法體外培養(yǎng)方法 3、IVMIVM實(shí)施方案實(shí)施方案卵母細(xì)卵母細(xì)胞體外胞體外成熟成熟 取取卵方式卵方式與時間與時間 體體外培養(yǎng)外培養(yǎng)方法方法 培培養(yǎng)液添養(yǎng)液添加成分加成分1、取卵方式與時間取卵方式與時間IVMIVM取卵方式：取卵方式：直接從陰道采集

5、 從手術(shù)切除的體外卵巢組織上采集 IVM的卵母細(xì)胞恢復(fù)能力受陰道采集時抽吸壓力和針頭型號的影響：較高吸取壓力較高吸取壓力（大約為56 mm Hg）和較粗針頭較粗針頭有利于卵母細(xì)胞恢復(fù)。有文獻(xiàn)報(bào)道，將卵母細(xì)胞采集針反復(fù)在卵巢基質(zhì)上抽吸的過程中逐漸增加抽吸壓逐漸增加抽吸壓力力，可采集到更多卵泡。IVMIVM取卵時間：取卵時間：由于未成熟卵母細(xì)胞主要來源于小卵泡，所以取卵技術(shù)略不同于含有成熟卵子的大卵泡。取卵難度相對大一些，因?yàn)槁殉灿蝿佣容^大，患者容易產(chǎn)生不適，所以一般都在麻醉下麻醉下完成取卵。一般每個患者大約可以取到730余個不成熟卵子。卵泡越小，卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂進(jìn)而發(fā)育成熟的能力越弱，但體積

6、較大的優(yōu)勢卵泡可分泌大量雌激素而引起周圍卵泡閉鎖。因此，過早或過晚結(jié)束培養(yǎng)都會對卵母細(xì)胞的質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。目前，一般在卵泡直徑達(dá)到達(dá)到1012 mm時結(jié)束培養(yǎng)時結(jié)束培養(yǎng)100um 2、體外培養(yǎng)方法體外培養(yǎng)方法 體外培養(yǎng)方法可分為如下幾類：微滴（一維）培養(yǎng)將卵泡直接放在培養(yǎng)皿中進(jìn)行一維法培養(yǎng)時，不利于卵母細(xì)胞與其周圍顆粒細(xì)胞之間的相互作用，且卵泡因重力作用而失去三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞生長二維培養(yǎng)利用顆粒細(xì)胞或STO細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部鋪飼養(yǎng)層可構(gòu)建二維培養(yǎng)環(huán)境三維培養(yǎng)在海藻酸鈉水凝膠等特殊材料包裹后，包埋培養(yǎng)可構(gòu)造三維立體結(jié)構(gòu)的卵泡培養(yǎng)環(huán)境“兩步法”在三維培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)竇前卵泡至竇狀卵泡階段，

7、隨后去除部分卵泡，使細(xì)胞密度降低，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞生長，并最終獲取成熟卵母細(xì)胞。3、IVM實(shí)施方案實(shí)施方案 根據(jù)Gn使用情況，將IVM實(shí)施方案大致分為以下幾種： 經(jīng)典IVM方式最早的IVM技術(shù)方案中不加入任何Gn。當(dāng)卵泡直徑達(dá)到1012 mm而未形成優(yōu)勢卵泡時結(jié)束培養(yǎng)。該方案不僅適用于PCOS患者，還適用于排卵正常的個體 添加卵泡刺激素（FSH）培養(yǎng)FSH對卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟十分重要，F(xiàn)SH水平不足或缺乏會影響排卵。在培養(yǎng)時加入小劑量FSH可增加獲卵數(shù)、體外培養(yǎng)成熟率以及妊娠率。一般在體外培養(yǎng)的第3天加入100150 U的FSH，連續(xù)3d至卵泡達(dá)到1012 mm 添加人絨毛膜促性腺激素（h

8、CG）培養(yǎng)在培養(yǎng)時，加入hCG（一般為10000 U）有助于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，并能夠增加妊娠率。 聯(lián)合使用FSH和hCG當(dāng)體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞時，聯(lián)合使用FSH和hCG可進(jìn)一步提高獲卵數(shù)、卵母細(xì)胞成熟率、種植率和臨床妊娠率一般來講，未成熟卵子需要在體外培養(yǎng)在體外培養(yǎng)2448小時小時，國際報(bào)道的成熟率可以達(dá)到6075%。這些體外成熟卵子可以體外受精發(fā)育成胚胎，進(jìn)行宮腔移植。三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評估（圖：胚胎發(fā)育的不同階段）1、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化培養(yǎng)液的優(yōu)化：培養(yǎng)液的優(yōu)化：將未成熟的小竇狀卵泡從人體內(nèi)取出后，卵母細(xì)胞所處環(huán)境即發(fā)生變化，與其直接接觸的培養(yǎng)液成分培養(yǎng)液成

9、分將對卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟、受精能力等產(chǎn)生重要的影響。適當(dāng)添加促性腺激素Gn有助于獲取高質(zhì)量的IVM的卵母細(xì)胞添加促性腺激素釋放激素GnRHa可促進(jìn)人IVM的卵母細(xì)胞的成熟和排卵添加表皮生長因子EGF可增加人IVM的成功率添加減數(shù)分裂抑制劑可延遲IVM的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)添加cAMP因子可促進(jìn)減數(shù)分裂的發(fā)生，有利于IVM的卵母細(xì)胞的發(fā)育三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評估三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評估1、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化體外成熟卵子的體外授精：既可采用常規(guī)體外授精技術(shù)完成受精，或用單精子卵胞漿內(nèi)注射（ICSI）技術(shù)授精。為了提高受精率，卵子體外成熟后一般建議

10、選擇一般建議選擇ICSI授精方式授精方式。授精方式的優(yōu)化：授精方式的優(yōu)化：單精子顯微注射流程圖三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評估1、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化 胚胎移植前的優(yōu)化：胚胎移植前的優(yōu)化：移植前胚胎的輔助孵出（AH）：就是采用激光在胚胎的透明帶在胚胎的透明帶上產(chǎn)生一個薄弱點(diǎn)上產(chǎn)生一個薄弱點(diǎn)，輔助囊胚易于孵出著床。因?yàn)槁炎芋w外成熟的培養(yǎng)時間較長，理論上卵子的透明帶結(jié)構(gòu)可能比較厚硬，為了提高著床率，移植前往往建議進(jìn)行胚胎的輔助孵出。三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評估2、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的臨床應(yīng)用評估由于卵泡未成熟體積小，取卵需要特定裝備與高超技術(shù)，培養(yǎng)技術(shù)也非同一般

11、，體外受精則必需顯微操作術(shù)前不需要應(yīng)用昂貴藥物刺激，可以避免藥物治療副作用，大大減少費(fèi)用且降低本病常見的促排卵引起的卵巢過度刺激綜合征風(fēng)險優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)一、Ghrelin對卵母細(xì)胞成熟的影響1 Ghrelin的結(jié)構(gòu)及其分布2 Ghrelin受體的信號通路及其分布3 Ghrelin對卵母細(xì)胞成熟的影響 Ghrelin的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)哺乳動物中，Ghrelin被發(fā)現(xiàn)是一種協(xié)調(diào)能量和生殖活動平衡的促進(jìn)食欲的胃腸激素，是生長激素促分泌物受體（Growth hormone secretagogue receptor，GHS-R ）的內(nèi)源性配體Ghrelin是28個氨基酸組成的肽，其第三個絲氨酸是N端酰化的，這是g

12、hrelin活性所必需的。大鼠和人類的Ghrelin只有兩個氨基酸殘基的差異 圖1 調(diào)節(jié)垂體生長激素釋放（引自Kojima M and Kangawa K,2005) 圖2 人和大鼠Ghrelin的結(jié)構(gòu)（引自Kojima M and Kangawa K,2005) 1 Ghrelin的結(jié)構(gòu)及其分布的結(jié)構(gòu)及其分布影響食物攝入、睡眠和行為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化影響心臟功能與血管阻力影響能量代謝和糖代謝影響胃酸分泌與胃運(yùn)動影響胰腺外分泌和內(nèi)分泌功能刺激GH、ATCH、PRL的分泌2 Ghrelin的結(jié)構(gòu)及其分布的結(jié)構(gòu)及其分布影響生殖功能2 Ghrelin受體的信號通路及其分布受體的信號通路及其分布Ghre

13、lin受體（GHS-R）是典型的七次跨膜G蛋白偶聯(lián)體，受體有7次跨膜的螺旋區(qū)和3個細(xì)胞內(nèi)和外的氨基酸環(huán)GHS-R和GHRH引起GH釋放的信號通路（引自 Teresa Lorenzi et al.）絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI-3激酶是主要參與激活核轉(zhuǎn)錄因子以控制細(xì)胞增殖，分化和凋亡的絲氨酸/蘇氨酸激酶 ghrelin作用ERK1/2和PI-3激酶信號通路（引自 Choi K et al.）3 Ghrelin對卵母細(xì)胞成熟的影響對卵母細(xì)胞成熟的影響 體外成熟過程中卵母胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA相對表達(dá)量隨著成熟進(jìn)程顯著下降 Ghrelin蛋白在牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，而G

14、HS-R蛋白則特異性的定位于卵母細(xì)胞膜表面，在卵丘細(xì)胞中均有Ghrelin和GHS-R蛋白表達(dá)。 FSH抑制卵母細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA表達(dá)，而FSH顯著促進(jìn)卵丘細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA表達(dá)；FSHBI解除FSH對卵母細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA表達(dá)的抑制作用和FSH對卵丘細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA表達(dá)的促進(jìn)作用 二、褪黑素對卵母細(xì)胞成熟的影響二、褪黑素對卵母細(xì)胞成熟的影響1褪黑素的結(jié)構(gòu)及其分布2褪黑素受體及其信號通路3 褪黑素Ghrelin對卵母細(xì)胞成熟的影響1 褪黑素的結(jié)構(gòu)及其分布褪黑素的結(jié)構(gòu)及其分布褪黑素（M

15、elatonin, MT），化學(xué)結(jié)構(gòu)為乙?；籽趸?，分子量為，是首先在松果體中發(fā)現(xiàn)的一種胺類物質(zhì)，褪黑素合成前體是色氣酸主要用途抗擊腫瘤改善睡眠調(diào)節(jié)免疫延緩衰老2褪黑素受體及其信號通路褪黑素受體及其信號通路MT1和MT2褪黑素受體信號通路：A:褪黑素和MT1受體結(jié)合后激活兩條通路，通過Gq偶聯(lián)受體-亞單位抑制cAMP的合成及通過r亞單位增強(qiáng)憐酸肌醇的分解。B：MT2褪黑素和結(jié)合后的信號通路。3 褪黑素對卵母細(xì)胞成熟的影響褪黑素對卵母細(xì)胞成熟的影響褪黑素具有抗氧化活性，褪黑素能通過多條途徑降低氧化應(yīng)激，是一種高效的自由基清除劑。圖為褪黑素在卵泡中的作用示意圖。褪黑素可以調(diào)控卵泡壁細(xì)胞和顆粒細(xì)

16、胞固醇類合成酶的表達(dá)而影響類固醇激素的分泌。褪黑素同時可以調(diào)控LHmRNA的表達(dá)，Bcl2和Casp3的生成，IGF和TGF-的活性和成熟透導(dǎo)激素的活性。褪黑素能調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞SOD、Gpx和CAT的表達(dá)。過多ROS的會引起凋亡和卵泡閉鎖，而卵泡內(nèi)的視黑素可以直接或間接清除ROS而抑制卵泡閉鎖，從而使卵泡繼續(xù)發(fā)育為優(yōu)勢卵泡。三、白藜蘆醇對卵母細(xì)胞成熟的影響1 白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)2 白藜蘆醇作用相關(guān)信號通路及其分布3 白藜蘆醇對卵母細(xì)胞成熟的影響白黎蘆醇（Resveratrol，RES)是一類多齡類化合物，存在于紅色葡萄皮、紅酒或其他的植物提取物中。1 白藜蘆醇白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)分子式相關(guān)保健品2 白藜蘆醇作用相關(guān)信號通路白藜蘆醇作用相關(guān)信號通路在哺乳動物中白黎蘆醇是SIRT 1的激活劑，能夠保護(hù)線粒體的功能，除此之外