第五章DNA重組

1、第五章 DNA重組同源重組同源重組Homologous recombination 位點專一性重組位點專一性重組Site-specific recombination 轉(zhuǎn)座重組轉(zhuǎn)座重組Transpositionn生物進化需要可遺傳的變異不斷產(chǎn)生生物進化需要可遺傳的變異不斷產(chǎn)生,變變化的根本原因是突變化的根本原因是突變,但就每個個體而言但就每個個體而言發(fā)生突變的幾率畢竟很低。涉及到的基發(fā)生突變的幾率畢竟很低。涉及到的基因數(shù)目非常有限，如果只有突變而沒有因數(shù)目非常有限，如果只有突變而沒有不同個體間的基因交流，則生物體難以不同個體間的基因交流，則生物體難以迅速組裝產(chǎn)生最能適應(yīng)環(huán)境條件的基因迅速組裝產(chǎn)

2、生最能適應(yīng)環(huán)境條件的基因組合。組合。n而且，通過不同個體間的基因交換，可而且，通過不同個體間的基因交換，可以保證遺傳的多樣性，從而為選擇奠定以保證遺傳的多樣性，從而為選擇奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。物質(zhì)基礎(chǔ)。第一節(jié)第一節(jié) 同源重組同源重組Homologous recombination n同源重組指由兩條同源區(qū)的同源重組指由兩條同源區(qū)的DNA分子，通過配分子，通過配對、鏈斷裂和再連接，而產(chǎn)生的片段間交換的對、鏈斷裂和再連接，而產(chǎn)生的片段間交換的過程。過程。n真核生物非姐妹染色單體之間的交換，姐妹染真核生物非姐妹染色單體之間的交換，姐妹染色單體的交換，細菌及某些低等真核生物的轉(zhuǎn)色單體的交換，細菌及某些低等真核

3、生物的轉(zhuǎn)化，細菌的轉(zhuǎn)導、接合、噬菌體的重組都屬于化，細菌的轉(zhuǎn)導、接合、噬菌體的重組都屬于這一類型。其中，這一類型。其中，E.coli等細菌的同源重組又等細菌的同源重組又稱為依賴稱為依賴RecA的重組。的重組。n真核生物同源重組也稱交換（真核生物同源重組也稱交換（crossing over），是指減數(shù)分裂（），是指減數(shù)分裂（meiosis）過）過程中染色體間遺傳物質(zhì)的交換。程中染色體間遺傳物質(zhì)的交換。n其特征是發(fā)生在同源其特征是發(fā)生在同源DNA序列之間。重序列之間。重組酶能以兩個組酶能以兩個DNA分子中任何一對同源分子中任何一對同源序列作底物進行交換。序列作底物進行交換。特征特征涉及同源序列間的

4、聯(lián)會配對，且交換的片段較大涉及同源序列間的聯(lián)會配對，且交換的片段較大涉及涉及DNA分子在特定的交換位點發(fā)生分子在特定的交換位點發(fā)生斷裂和錯接斷裂和錯接的生化過程的生化過程異源雙鏈區(qū)的生成異源雙鏈區(qū)的生成存在重組熱點存在重組熱點需要重組酶需要重組酶單鏈單鏈DNA分子或單鏈分子或單鏈DNA末端是交換發(fā)生的重末端是交換發(fā)生的重要信號要信號一、同源重組一、同源重組的分子模型的分子模型n1、斷裂、斷裂-復(fù)合復(fù)合nBreakage and reunion2、異源雙鏈、異源雙鏈在重組位點上，每在重組位點上，每個雙鏈都有一個由個雙鏈都有一個由兩個親本兩個親本DNA分分子中的一股單鏈共子中的一股單鏈共同組成的雙

5、鏈區(qū)域，同組成的雙鏈區(qū)域，這段區(qū)域稱為異源這段區(qū)域稱為異源雙鏈雙鏈DNA（heteroduplex DNA）3、分支遷移、分支遷移兩個雙螺旋形成的交叉連接很容易以拉鏈式效應(yīng)擴散，也就是鏈交換可沿著雙鏈滑動，這個過程稱為分支遷移（branch migration）4、Holliday結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)n重組中連接兩個重組中連接兩個DNA雙鏈的交換雙鏈的交換中間物含有中間物含有4股股DNA鏈，在其連鏈，在其連接處為了轉(zhuǎn)換配接處為了轉(zhuǎn)換配對所形成交叉鏈對所形成交叉鏈的連接點稱為的連接點稱為Holliday結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。5、連接分子的拆分、連接分子的拆分n鏈交換形成的連接分子必須拆分鏈交換形成的連接分子必須拆分（

6、resolution），），彼此分離為雙鏈彼此分離為雙鏈DNA分子。由于交聯(lián)在一起的兩條雙鏈分子。由于交聯(lián)在一起的兩條雙鏈DNA分子實際上處在不斷地異構(gòu)化中，切口分子實際上處在不斷地異構(gòu)化中，切口可能在兩對同源鏈中任意一對上發(fā)生?？赡茉趦蓪ν存溨腥我庖粚ι习l(fā)生。n根據(jù)鏈裂斷切開的方式不同，得到的重組產(chǎn)物也不根據(jù)鏈裂斷切開的方式不同，得到的重組產(chǎn)物也不同。如果切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源同。如果切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA，則稱為拼接重組，則稱為拼接重組體（體（splice recombinant），此種重組又叫做），此種重

7、組又叫做交交互重組互重組（reciprocal recombination）。）。n但如果切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體但如果切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA，則稱為則稱為片段重組體片段重組體（patch recombinant）。）。 n連接分子可以以兩種交替方式進行拆分，兩連接分子可以以兩種交替方式進行拆分，兩側(cè)基因或是發(fā)生交互重組，或是無重組發(fā)生。側(cè)基因或是發(fā)生交互重組，或是無重組發(fā)生。n但無論哪種拆分方式都說明一個原則，即鏈但無論哪種拆分方式都說明一個原則，即鏈交換后總會在兩條交換后總會在兩

8、條DNA分子上留下一段異源分子上留下一段異源雙鏈區(qū)，但側(cè)翼序列的重組未必與之同時發(fā)雙鏈區(qū)，但側(cè)翼序列的重組未必與之同時發(fā)生。生。n不同生物體同源重組的具體過程雖有不同，不同生物體同源重組的具體過程雖有不同，但基本步驟大致相同。兩但基本步驟大致相同。兩DNA分子只要含有分子只要含有一段堿基序列大體類似的同源區(qū)，就可以發(fā)一段堿基序列大體類似的同源區(qū)，就可以發(fā)生重組。生重組。 二、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組二、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組n細菌可以通過多種途徑進行細胞間基因細菌可以通過多種途徑進行細胞間基因轉(zhuǎn)移，并通過基因重組以適應(yīng)隨時改變轉(zhuǎn)移，并通過基因重組以適應(yīng)隨時改變的環(huán)境。細菌的基因轉(zhuǎn)移主要有的環(huán)境。細菌

9、的基因轉(zhuǎn)移主要有4種機制：種機制：接合（接合（conjugation）、）、n轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformation）、）、n轉(zhuǎn)導（轉(zhuǎn)導（transduction）、）、n細胞融合（細胞融合（cell fusion）。）。 1、細菌的接合作用細菌的接合作用 細菌的細胞相互接觸時遺傳信息可由一個細胞轉(zhuǎn)移到另一細胞，稱為接合作細菌的細胞相互接觸時遺傳信息可由一個細胞轉(zhuǎn)移到另一細胞，稱為接合作用。供體細胞為雄性，受體為雌性。通過接合而轉(zhuǎn)移用。供體細胞為雄性，受體為雌性。通過接合而轉(zhuǎn)移DNA的能力由接合質(zhì)粒的能力由接合質(zhì)粒提供，與接合功能有關(guān)的蛋白質(zhì)均由接合質(zhì)粒所編碼。能夠促使染色體基因提供，與接合

10、功能有關(guān)的蛋白質(zhì)均由接合質(zhì)粒所編碼。能夠促使染色體基因轉(zhuǎn)移的接合質(zhì)粒稱為轉(zhuǎn)移的接合質(zhì)粒稱為致育因子致育因子（fertility factor），簡稱性因子或），簡稱性因子或F因子。因子。 致育因子（致育因子（F因子）通過結(jié)合作用由因子）通過結(jié)合作用由F+細胞向細胞向F-細胞轉(zhuǎn)移，細胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)質(zhì)粒約質(zhì)粒約1/3的基因的基因與轉(zhuǎn)移有關(guān)，與轉(zhuǎn)移有關(guān)，traS和和traT基因編碼表面排斥蛋白，阻止基因編碼表面排斥蛋白，阻止F+細胞之間的轉(zhuǎn)移，細胞之間的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)+細胞的性菌毛與細胞的性菌毛與F-細胞結(jié)合后收縮，使二者靠近，細胞結(jié)合后收縮，使二者靠近，TraD蛋白構(gòu)成轉(zhuǎn)移的通道，蛋白構(gòu)成轉(zhuǎn)移的通道，在在T

11、raI在在TraY的幫助下結(jié)合到轉(zhuǎn)移起點的幫助下結(jié)合到轉(zhuǎn)移起點oriT上，切開一條鏈，使其上，切開一條鏈，使其5端進入受端進入受體細胞，并合成其互補鏈，使體細胞，并合成其互補鏈，使F-細胞轉(zhuǎn)化為細胞轉(zhuǎn)化為F+細胞，給體細胞中的單鏈也可以細胞，給體細胞中的單鏈也可以合成互補鏈。合成互補鏈。 在細菌基因轉(zhuǎn)移在細菌基因轉(zhuǎn)移的不同時間將配對細的不同時間將配對細胞分開，可以確定基胞分開，可以確定基因在染色體上的位置。因在染色體上的位置。F F質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA可以通過重可以通過重組整合到受體的染色組整合到受體的染色體中，使受體菌成為體中，使受體菌成為高頻重組（高頻重組（HrfHrf) )菌株，菌株，若

12、若F F質(zhì)粒的質(zhì)粒的DNADNA未能完未能完整地進入受體菌，則整地進入受體菌，則受體菌不能轉(zhuǎn)化為受體菌不能轉(zhuǎn)化為F F+ +, , F F質(zhì)粒的質(zhì)粒的DNADNA可以被切可以被切割出來，有時可攜帶割出來，有時可攜帶宿主菌的染色體宿主菌的染色體DNADNA，稱作稱作F F因子，因子， F F因因子攜帶的基因可在受子攜帶的基因可在受體菌表達。體菌表達。2、遺傳轉(zhuǎn)化、遺傳轉(zhuǎn)化 n遺傳轉(zhuǎn)化遺傳轉(zhuǎn)化（genetic transformation）是指）是指細菌品系由于吸收了外源細菌品系由于吸收了外源DNA（轉(zhuǎn)化因子）（轉(zhuǎn)化因子）而發(fā)生遺傳性狀的改變現(xiàn)象。而發(fā)生遺傳性狀的改變現(xiàn)象。n具有攝取周圍環(huán)境中游離

13、具有攝取周圍環(huán)境中游離DNA分子能力的細分子能力的細菌細胞稱為菌細胞稱為感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞（competent cell）。）。n自然條件下感受態(tài)的形成需要自然條件下感受態(tài)的形成需要10多種蛋白質(zhì)多種蛋白質(zhì)參與，實驗室常用高濃度的參與，實驗室常用高濃度的Ca2+處理使細菌處理使細菌形成感受態(tài)。形成感受態(tài)。3、細菌的轉(zhuǎn)導、細菌的轉(zhuǎn)導n轉(zhuǎn)導（轉(zhuǎn)導（transduction）是通）是通過噬菌體將細菌基因從供體過噬菌體將細菌基因從供體轉(zhuǎn)移到受體細胞的過程。轉(zhuǎn)移到受體細胞的過程。4、細菌的細胞融合、細菌的細胞融合在有些細菌的種屬中可發(fā)生由在有些細菌的種屬中可發(fā)生由細胞質(zhì)膜融合導致的基因轉(zhuǎn)細胞質(zhì)膜融合導

14、致的基因轉(zhuǎn)移和重組。移和重組。 三、大腸桿菌重組的分子基礎(chǔ)大腸桿菌重組的分子基礎(chǔ)n在細菌重組反應(yīng)中活性最為明顯的是由在細菌重組反應(yīng)中活性最為明顯的是由大腸桿菌染色體上大腸桿菌染色體上rec 基因和基因和ruv 基因基因編碼的一些酶。編碼的一些酶。n其中，主要有其中，主要有Rec A 蛋白，蛋白，Rec BCD酶，酶，Ruv ABC酶等到。酶等到。1、Rec A 蛋白nRec A蛋白是催化重組基本反應(yīng)的酶。蛋白是催化重組基本反應(yīng)的酶。RecA有有兩個主要的功能：誘發(fā)兩個主要的功能：誘發(fā)SOS反應(yīng)和促進反應(yīng)和促進DNA單單鏈的同化（鏈的同化（assimilation）。）。單鏈同化單鏈同化是一個分

15、是一個分子的單鏈侵入到另一個分子的雙螺旋上，通過取子的單鏈侵入到另一個分子的雙螺旋上，通過取代雙螺旋上的原始鏈而形成異源雙鏈。代雙螺旋上的原始鏈而形成異源雙鏈。n當當RecA與與DNA單鏈結(jié)合時，數(shù)千單鏈結(jié)合時，數(shù)千RecA單體協(xié)單體協(xié)同聚集在單鏈上形成螺旋狀纖絲（同聚集在單鏈上形成螺旋狀纖絲（helical filament）。）。Rec F、Rec O和和Rec R蛋白調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)Rec A纖絲的裝配和拆卸。纖絲的裝配和拆卸。 Rec A催化的單鏈同化nRecA蛋白分子質(zhì)量為蛋白分子質(zhì)量為38 000da，它與單鏈它與單鏈DNA結(jié)合形成的螺旋纖絲結(jié)合形成的螺旋纖絲每圈含每圈含6個單體，螺旋

16、直徑個單體，螺旋直徑10nm，堿基間距堿基間距0.5nm。此復(fù)合物可以與。此復(fù)合物可以與雙鏈雙鏈DNA作用，部分解旋以便閱讀作用，部分解旋以便閱讀堿基序列，迅速掃掠尋找與單鏈互堿基序列，迅速掃掠尋找與單鏈互補的序列。互補序列一旦被找到，補的序列?；パa序列一旦被找到，雙鏈進一步被解旋以允許轉(zhuǎn)換堿基雙鏈進一步被解旋以允許轉(zhuǎn)換堿基配對，使單鏈與雙鏈中的互補鏈配配對，使單鏈與雙鏈中的互補鏈配對，同源鏈被置換出來對，同源鏈被置換出來 RecA蛋白引起蛋白引起DNA同源重組同源重組的模型的模型2、Rec BCD酶n亦稱核酸外切酶亦稱核酸外切酶V，它通過，它通過chi序列識別序列識別靶位點，這種酶的各個亞基

17、是由靶位點，這種酶的各個亞基是由rec B，rec C，rec D基因編碼的產(chǎn)物。它是一基因編碼的產(chǎn)物。它是一種有效降解種有效降解DNA的核酸酶，可以在單鏈的核酸酶，可以在單鏈結(jié)合蛋白的存在下松開結(jié)合蛋白的存在下松開DNA雙鏈，同時雙鏈，同時還具有還具有ATP酶活性，它在重組中的作用酶活性，它在重組中的作用是提供具有是提供具有3-末端的單鏈區(qū)域。末端的單鏈區(qū)域。Chi 位點位點GCTGGTGGCGACCACCsites3、Ruv A B CnRuv A 識別識別Holliday結(jié)構(gòu)連接點。結(jié)構(gòu)連接點。nRuv B 是一種是一種ATP酶，為分支遷移提供酶，為分支遷移提供動力。動力。nRuv C

18、是專一識別是專一識別Holliday結(jié)構(gòu)連接點結(jié)構(gòu)連接點的核酸內(nèi)切酶，它在體外切斷連接點以的核酸內(nèi)切酶，它在體外切斷連接點以拆分重組中間體。拆分重組中間體。 在大腸桿菌中由在大腸桿菌中由RuvA,RuvBRuvA,RuvB和和RuvCRuvC蛋白參與蛋白參與的同源重組。的同源重組。 （a a） RuvARuvA四聚體的圖解。四個亞基形成的結(jié)構(gòu)四聚體的圖解。四個亞基形成的結(jié)構(gòu)像四個花瓣的花。像四個花瓣的花。 （b b） RuvA/RuvBRuvA/RuvB的作用：的作用： （左）（左）RuvARuvA四聚體結(jié)合到四聚體結(jié)合到HollidayHolliday位點；位點； （中）（中）RuvBRuv

19、B六聚體結(jié)合到雜合雙螺旋的兩對面，六聚體結(jié)合到雜合雙螺旋的兩對面，DNADNA穿過其中心，穿過其中心， RuvBRuvB六聚體的作用像馬達，促進超六聚體的作用像馬達，促進超螺旋分叉點通過復(fù)合體移動。螺旋分叉點通過復(fù)合體移動。 （右）（右）RuvCRuvC結(jié)合到結(jié)合到HollidayHolliday位點，由其核酸酶活位點，由其核酸酶活性切斷核酸鏈，切割位點由剪切體辨認。性切斷核酸鏈，切割位點由剪切體辨認。 （c c） RuvARuvA四聚體的電荷分布，藍色表示正電荷，四聚體的電荷分布，藍色表示正電荷，紅色表示負電荷，注意正電荷位于四聚體的表面，有紅色表示負電荷，注意正電荷位于四聚體的表面，有四個

20、負電荷區(qū)域位于其中心。四個負電荷區(qū)域位于其中心。 （d d） 假設(shè)的假設(shè)的RuvARuvA四聚體與四聚體與HollidayHolliday位點結(jié)合的位點結(jié)合的結(jié)構(gòu)模型。結(jié)構(gòu)模型。RecBCD 和和RecA 的共同作用的共同作用n單鏈侵入單鏈侵入Single-strand uptaken鏈交換鏈交換Single-strand assimilation重組修復(fù)重組修復(fù)在復(fù)制叉處在復(fù)制叉處重組水平的重組水平的修復(fù)修復(fù)第二節(jié)位點特異性重組第二節(jié)位點特異性重組n位點特異性重組位點特異性重組（Site-specific recombination）需要在特定的位點上發(fā)生斷裂和重接，從而產(chǎn)生精確需要在特定的

21、位點上發(fā)生斷裂和重接，從而產(chǎn)生精確的重排。的重排。n 位點特異性重組廣泛存在于各類細胞中，起著十分位點特異性重組廣泛存在于各類細胞中，起著十分特殊的作用，彼此有很大的不同。它們的作用包括某特殊的作用，彼此有很大的不同。它們的作用包括某些基因表達的調(diào)節(jié)、發(fā)育過程中程序性些基因表達的調(diào)節(jié)、發(fā)育過程中程序性DNA重排，重排，以及有些病毒和質(zhì)粒以及有些病毒和質(zhì)粒DNA復(fù)制循環(huán)過程中發(fā)生的整復(fù)制循環(huán)過程中發(fā)生的整合與切除等。此過程往往發(fā)生在一個特定的短合與切除等。此過程往往發(fā)生在一個特定的短（20200bp）DNA序列內(nèi)（重組位點），并且有序列內(nèi)（重組位點），并且有特異的酶（重組酶）和輔助因子對其識別和

22、作用。特異的酶（重組酶）和輔助因子對其識別和作用。 位點特異性重組的結(jié)果決定于重組位點的位置和方向。如果重組位點特異性重組的結(jié)果決定于重組位點的位置和方向。如果重組位點以相反方向存在于同一位點以相反方向存在于同一DNA分子上，重組結(jié)果發(fā)生倒位。重分子上，重組結(jié)果發(fā)生倒位。重組位點以相同方向存在于同一組位點以相同方向存在于同一DNA分子上，重組發(fā)生切除；在不分子上，重組發(fā)生切除；在不同分子上，重組發(fā)生整合同分子上，重組發(fā)生整合 一、噬菌體噬菌體DNA的整合與切除的整合與切除n噬菌體噬菌體DNA進入宿主大腸桿菌細胞后存在溶原和裂進入宿主大腸桿菌細胞后存在溶原和裂解兩條途徑，二者的最初過程是相同的，

23、都要求早期解兩條途徑，二者的最初過程是相同的，都要求早期基因的表達，為溶原和裂解途徑的歧化做好準備。兩基因的表達，為溶原和裂解途徑的歧化做好準備。兩種生活周期的選擇取決于種生活周期的選擇取決于CI和和Cro蛋白相互拮抗的結(jié)蛋白相互拮抗的結(jié)果。果。CI蛋白抑制除自身外所有噬菌體基因的轉(zhuǎn)錄，如蛋白抑制除自身外所有噬菌體基因的轉(zhuǎn)錄，如果果CI蛋白占優(yōu)勢，溶原狀態(tài)就得到建立和維持。蛋白占優(yōu)勢，溶原狀態(tài)就得到建立和維持。Cro蛋白抑制蛋白抑制CI基因的轉(zhuǎn)錄，它占優(yōu)勢噬菌體即進入繁殖基因的轉(zhuǎn)錄，它占優(yōu)勢噬菌體即進入繁殖周期，并導致宿主細胞裂解。周期，并導致宿主細胞裂解。噬菌體的整合發(fā)生在噬噬菌體的整合發(fā)生

24、在噬菌體和宿主染色體的特定位點，因此是一種特異位點菌體和宿主染色體的特定位點，因此是一種特異位點重組。整合的原噬菌體隨宿主染色體一起復(fù)制并傳遞重組。整合的原噬菌體隨宿主染色體一起復(fù)制并傳遞給后代。但在紫外線照射或升溫等因素誘導下，原噬給后代。但在紫外線照射或升溫等因素誘導下，原噬菌體可被切除下來，進入裂解途徑，釋放出噬菌體顆菌體可被切除下來，進入裂解途徑，釋放出噬菌體顆粒。粒。 整合和切除過程是在細菌DNA和噬菌體DNA專一性的附著位點(attachment site ,att)上進行的n細菌的附著點稱att B,由序列BOB組成,噬菌體的附著位點稱att P,由序列POP組成。n其中O序列是

25、att B和att P所共有的，所以稱為核心序列（core sequence)n重組后形成兩個新att位點，att L (BOP) 和att R (POB)n位點專一性重組反應(yīng)的定向特征取決于重組位點的識別。盡管整合和切除過程是可逆的，但反應(yīng)導向則由不同條件決定的。n整合過程要求在att B和 att P之間進行識別,而切除過程則在att L 和 att R之間識別1、整合反應(yīng)n噬菌體編碼一種酶噬菌體編碼一種酶整合酶整合酶（ integrase, INT)，它能切斷，并它能切斷，并能使它重新連接從而直接將噬菌體能使它重新連接從而直接將噬菌體插入大腸桿菌染色體中，通過兩條插入大腸桿菌染色體中，通

26、過兩條的專一位點上的重組合并成一個的專一位點上的重組合并成一個環(huán)狀分子整合作用需要由大腸桿菌編環(huán)狀分子整合作用需要由大腸桿菌編碼的整合宿主因子碼的整合宿主因子（integration host factor）的共同作用的共同作用模型說明模型說明att P和和 att B部位進行了交叉斷裂，部位進行了交叉斷裂，互補單鏈末端進行交叉雜交?；パa單鏈末端進行交叉雜交。 DNA交換點交換點之間的距離為之間的距離為7bp，n在位點專一性重組中，有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合在位點專一性重組中，有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合在在att部位的特定位點上。部位的特定位點上。n當當INT和和IHF蛋白結(jié)合在蛋白結(jié)合在att P位點時形位點時形成

27、的復(fù)合物稱為整合體（成的復(fù)合物稱為整合體（intasome）。）。整合體就是捕獲整合體就是捕獲att B的中間體。的中間體。nINT蛋白分子可能作為整合體的一部分蛋白分子可能作為整合體的一部分結(jié)合到結(jié)合到att B 的核心位點上，說明的核心位點上，說明att P和和att B的最初識別不是直接取決于的最初識別不是直接取決于DNA的同源性，而是由的同源性，而是由INT蛋白識別兩個蛋白識別兩個att序列的能力來決定的，當需要鏈交換反序列的能力來決定的，當需要鏈交換反應(yīng)時，同源序列在此階段才顯得重要。應(yīng)時，同源序列在此階段才顯得重要。2、切除反應(yīng)（excision）n當誘發(fā)原噬菌體生長時，整合作用發(fā)

28、生當誘發(fā)原噬菌體生長時，整合作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，這個過程稱為切除逆轉(zhuǎn)，這個過程稱為切除（excise）。n切除需要切除需要Xis蛋白，它抑制整合作用。蛋白，它抑制整合作用。nINT，XIS，IHF連在一起覆蓋了全部連在一起覆蓋了全部att P，從而不利于進行整合反應(yīng)。，從而不利于進行整合反應(yīng)。n當噬菌體進入溶源狀態(tài)時優(yōu)先發(fā)生整合當噬菌體進入溶源狀態(tài)時優(yōu)先發(fā)生整合反應(yīng)。而當噬菌體進入裂解周期時則切反應(yīng)。而當噬菌體進入裂解周期時則切除反應(yīng)占優(yōu)勢，通過控制除反應(yīng)占優(yōu)勢，通過控制INT和和XIS的存的存量發(fā)生適當?shù)姆磻?yīng)。量發(fā)生適當?shù)姆磻?yīng)。二、細菌的特異位點重組二、細菌的特異位點重組n鼠傷寒沙門氏桿菌（鼠傷寒

29、沙門氏桿菌（Salmonella typhimurium）由）由鞭毛蛋白決定的鞭毛蛋白決定的H抗原有兩種，分別為抗原有兩種，分別為H1鞭毛蛋白和鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白。鞭毛蛋白。n遺傳分析表明，這種抗原相位的改變是由一段遺傳分析表明，這種抗原相位的改變是由一段995bp的的DNA，稱為，稱為H片段（片段（H segment）發(fā)生倒位所決定。）發(fā)生倒位所決定。hix基因編碼特異的重組酶，基因編碼特異的重組酶，即倒位酶（即倒位酶（invertase）Hin。該酶為相對分子質(zhì)量。該酶為相對分子質(zhì)量22 000亞基的二聚體，分亞基的二聚體，分別結(jié)合在兩個別結(jié)合在兩個hix位點上，位點上，并由反向刺激因

30、子并由反向刺激因子Fis（factor for inversion stimulation）促使）促使DNA彎彎曲而將兩個曲而將兩個hix位點聯(lián)結(jié)在位點聯(lián)結(jié)在一起，一起，DNA片段經(jīng)斷裂和再片段經(jīng)斷裂和再連接而發(fā)生倒位。連接而發(fā)生倒位。rH 1表達表達產(chǎn)物為產(chǎn)物為H1阻遏蛋白，當阻遏蛋白，當H2基因表達時，基因表達時，Hl基因被阻遏；基因被阻遏；反之，反之，H2基因不表達時，基因不表達時，H1基因才得以表達基因才得以表達 免疫球蛋白基因的重組第三節(jié)第三節(jié) Transposition ( 轉(zhuǎn)座作用）轉(zhuǎn)座作用）n基因組可通過獲得新序列而進化，也可基因組可通過獲得新序列而進化，也可通過現(xiàn)存序列的重排

31、實現(xiàn)這一目的。無通過現(xiàn)存序列的重排實現(xiàn)這一目的。無論是原核生物還是真核生物，轉(zhuǎn)座子或論是原核生物還是真核生物，轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)座元件（transposon or transposable element)的移動提供了的移動提供了基因組變化的潛在可能?；蚪M變化的潛在可能。一、轉(zhuǎn)座子（一、轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）n基因組上不必借助同源序列就可移動的基因組上不必借助同源序列就可移動的DNA片段，它們可以直接從基因組內(nèi)的片段，它們可以直接從基因組內(nèi)的一個位點移到另一個位點。一個位點移到另一個位點。n在原核生物和真核生物中都發(fā)現(xiàn)了經(jīng)由在原核生物和真核生物中都發(fā)現(xiàn)了經(jīng)由DNA移動的轉(zhuǎn)座子。

32、移動的轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座過程有以下特征：轉(zhuǎn)座過程有以下特征： n能從基因組的一個位點轉(zhuǎn)移到另一個位點，從一個復(fù)能從基因組的一個位點轉(zhuǎn)移到另一個位點，從一個復(fù)制子轉(zhuǎn)移到另一個復(fù)制子；制子轉(zhuǎn)移到另一個復(fù)制子；n不以獨立的形式存在（如噬菌體或質(zhì)粒不以獨立的形式存在（如噬菌體或質(zhì)粒DNA），而），而是在基因組內(nèi)由一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一部位；是在基因組內(nèi)由一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一部位；n轉(zhuǎn)座子編碼其自身的轉(zhuǎn)座酶，每次移動時攜帶轉(zhuǎn)座必轉(zhuǎn)座子編碼其自身的轉(zhuǎn)座酶，每次移動時攜帶轉(zhuǎn)座必需的基因一起在基因組內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基需的基因一起在基因組內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基因；因；n轉(zhuǎn)座的頻率很低，且插入是隨機的

33、，不依賴于轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的頻率很低，且插入是隨機的，不依賴于轉(zhuǎn)座子（供體）和靶位點（受體）之間的任何序列同源性；（供體）和靶位點（受體）之間的任何序列同源性；n轉(zhuǎn)座子可插入到一個結(jié)構(gòu)基因或基因調(diào)節(jié)序列內(nèi)，引轉(zhuǎn)座子可插入到一個結(jié)構(gòu)基因或基因調(diào)節(jié)序列內(nèi)，引起基因表達內(nèi)容的改變，如使該基因失活，如果是重要起基因表達內(nèi)容的改變，如使該基因失活，如果是重要的基因則可能導致細胞死亡。的基因則可能導致細胞死亡。二、轉(zhuǎn)座子的類型和結(jié)構(gòu)特征n所有的轉(zhuǎn)座子都有兩個結(jié)構(gòu)特征：所有的轉(zhuǎn)座子都有兩個結(jié)構(gòu)特征：n（1）兩端有）兩端有20-40bp的反向重復(fù)序列的反向重復(fù)序列（inverted repetitive seque

34、nce, IR)n（）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（transposase) 的基因的基因,這種酶催化轉(zhuǎn)座子插入新的位置。這種酶催化轉(zhuǎn)座子插入新的位置。n在原核生物中已發(fā)現(xiàn)兩種類型的轉(zhuǎn)座子：在原核生物中已發(fā)現(xiàn)兩種類型的轉(zhuǎn)座子：n（1）簡單轉(zhuǎn)座子）簡單轉(zhuǎn)座子（simple transposon）又稱又稱為插入序列（為插入序列（insertion sequence，IS）。）。n（2）復(fù)合轉(zhuǎn)座子）復(fù)合轉(zhuǎn)座子（composite transposon）（1）插入序列（IS）n插入序列是最簡單的轉(zhuǎn)座子，插入序列是最簡單的轉(zhuǎn)座子，IS因子是一種較小的轉(zhuǎn)因子是一種較小的轉(zhuǎn)座因子，長度為座因子，長度為7

35、501550bp，只含有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的，只含有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的酶基因，不含抗藥性等其他基因，其兩端都具有酶基因，不含抗藥性等其他基因，其兩端都具有1525bp的反向重復(fù)序列（的反向重復(fù)序列（inverted repeat，IR）。可）?？梢栽诓煌膹?fù)制子間轉(zhuǎn)移位置，以非正常重組的方式從以在不同的復(fù)制子間轉(zhuǎn)移位置，以非正常重組的方式從一個位點插入到另一個位點，從而對該位點的基因的結(jié)一個位點插入到另一個位點，從而對該位點的基因的結(jié)構(gòu)與表達產(chǎn)生多種遺傳效應(yīng)。每一類型都以構(gòu)與表達產(chǎn)生多種遺傳效應(yīng)。每一類型都以IS加鑒定加鑒定類型的編號來表示。類型的編號來表示。但后來的類型編號只反映它們的但后來的類型編號只反

36、映它們的分離歷史，并不表示至今所分離的插入序列的總數(shù)分離歷史，并不表示至今所分離的插入序列的總數(shù)nIS因子本身不具有表型效應(yīng)，只有當它轉(zhuǎn)座到因子本身不具有表型效應(yīng)，只有當它轉(zhuǎn)座到某一基因附近或插入某一基因內(nèi)部后，引起該某一基因附近或插入某一基因內(nèi)部后，引起該基因失活或產(chǎn)生極性效應(yīng)時，才能判斷其存在。基因失活或產(chǎn)生極性效應(yīng)時，才能判斷其存在。所引起的效應(yīng)與其插入的位置和方向有關(guān)。轉(zhuǎn)所引起的效應(yīng)與其插入的位置和方向有關(guān)。轉(zhuǎn)座時，宿主靶部位雙鏈被交錯切開，經(jīng)修復(fù)后座時，宿主靶部位雙鏈被交錯切開，經(jīng)修復(fù)后插入序列兩側(cè)形成短的正向重復(fù)。靶序列通常插入序列兩側(cè)形成短的正向重復(fù)。靶序列通常是任意的，但交錯切

37、開的長度是固定的，一般是任意的，但交錯切開的長度是固定的，一般為為59bp。 （2）復(fù)合轉(zhuǎn)座子（）復(fù)合轉(zhuǎn)座子（Tn）n一些轉(zhuǎn)座子除了除了有轉(zhuǎn)座酶基因外，還攜帶一些轉(zhuǎn)座子除了除了有轉(zhuǎn)座酶基因外，還攜帶藥物抗性藥物抗性(或其他或其他)標記。這些轉(zhuǎn)座子以標記。這些轉(zhuǎn)座子以Tn和數(shù)和數(shù)碼來命名。其中一類是由攜帶藥物標記的中央碼來命名。其中一類是由攜帶藥物標記的中央?yún)^(qū)域和兩側(cè)的臂區(qū)域和兩側(cè)的臂(arms)組成的復(fù)合因子組成的復(fù)合因子(composite elements)。n有的轉(zhuǎn)座子的重復(fù)順序就是有的轉(zhuǎn)座子的重復(fù)順序就是IS，復(fù)合轉(zhuǎn)座子也，復(fù)合轉(zhuǎn)座子也和和IS一樣，能從一個位點轉(zhuǎn)座到另一個位點。一樣，

38、能從一個位點轉(zhuǎn)座到另一個位點。二、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機制轉(zhuǎn)座的機制n轉(zhuǎn)座作用的機制仍可分為三種不同類型：轉(zhuǎn)座作用的機制仍可分為三種不同類型：即即n復(fù)制型，非復(fù)制型，保守型復(fù)制型，非復(fù)制型，保守型n其中復(fù)制型轉(zhuǎn)座需要兩種酶，其中復(fù)制型轉(zhuǎn)座需要兩種酶，轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座酶 和和解離酶解離酶復(fù)制轉(zhuǎn)座作用引起了轉(zhuǎn)座子的一個復(fù)制，它插入到一個復(fù)制轉(zhuǎn)座作用引起了轉(zhuǎn)座子的一個復(fù)制，它插入到一個接受位點。捐贈位點保持不變，以致捐贈者和接受者都接受位點。捐贈位點保持不變，以致捐贈者和接受者都有轉(zhuǎn)座子的一個復(fù)制有轉(zhuǎn)座子的一個復(fù)制非復(fù)制轉(zhuǎn)座作用允許一個轉(zhuǎn)座子像物體一樣從捐非復(fù)制轉(zhuǎn)座作用允許一個轉(zhuǎn)座子像物體一樣從捐贈們點移動到接受

39、位點，這樣就在捐贈位點留下贈們點移動到接受位點，這樣就在捐贈位點留下了一個斷裂。了一個斷裂。保守的轉(zhuǎn)座作用描述了另一種非復(fù)制結(jié)果，因子保守的轉(zhuǎn)座作用描述了另一種非復(fù)制結(jié)果，因子在捐贈位點被切除，然后通過一連串的反應(yīng)插入在捐贈位點被切除，然后通過一連串的反應(yīng)插入到一個靶位，這樣每一個核苷粘合都被保留。到一個靶位，這樣每一個核苷粘合都被保留。復(fù)制轉(zhuǎn)座作用通過一個共合體進行復(fù)制轉(zhuǎn)座作用通過一個共合體進行非復(fù)制轉(zhuǎn)座作用借助斷裂和重聚進行非復(fù)制轉(zhuǎn)座作用借助斷裂和重聚進行TnATnA轉(zhuǎn)座作用：轉(zhuǎn)座作用：復(fù)制型轉(zhuǎn)座需要轉(zhuǎn)座酶和分解酶復(fù)制型轉(zhuǎn)座需要轉(zhuǎn)座酶和分解酶ntnpAtnpA基因產(chǎn)物是一個轉(zhuǎn)座酶基因產(chǎn)物是

40、一個轉(zhuǎn)座酶nTnpRTnpR基因的產(chǎn)物具有二重功能，蛋白擔任著基因的產(chǎn)物具有二重功能，蛋白擔任著基因抑制子表達和供應(yīng)分解酶的功能?；蛞种谱颖磉_和供應(yīng)分解酶的功能。nTnpRTnpR抑制了所有抑制了所有tnpAtnpA和自己的基因的轉(zhuǎn)錄。和自己的基因的轉(zhuǎn)錄。共合體結(jié)構(gòu)的解離共合體結(jié)構(gòu)的解離部位稱為部位稱為resres，即是，即是解離酶的結(jié)合部位。解離酶的結(jié)合部位。位點位點I I是遺傳上作為是遺傳上作為resres部位的區(qū)域，它部位的區(qū)域，它的缺失將使解離反的缺失將使解離反應(yīng)完全不能進行。應(yīng)完全不能進行。然而解離反應(yīng)也與然而解離反應(yīng)也與部位部位II II和和IIIIII有關(guān)。有關(guān)。因為其中任何一

41、個因為其中任何一個部位缺失，解離反部位缺失，解離反應(yīng)都變得很弱。應(yīng)都變得很弱。三、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征n（1）轉(zhuǎn)座不依賴于靶序列的同源性）轉(zhuǎn)座不依賴于靶序列的同源性n（2）轉(zhuǎn)座后靶序列重復(fù)）轉(zhuǎn)座后靶序列重復(fù)n（3）轉(zhuǎn)座子的插入具有專一性）轉(zhuǎn)座子的插入具有專一性n（4）轉(zhuǎn)座具有排他性）轉(zhuǎn)座具有排他性n（5）轉(zhuǎn)座具有極性效應(yīng)）轉(zhuǎn)座具有極性效應(yīng)n（6）活化臨近的沉默基因）活化臨近的沉默基因n（7）區(qū)域性優(yōu)先）區(qū)域性優(yōu)先轉(zhuǎn)座頻率的調(diào)控轉(zhuǎn)座頻率的調(diào)控n對于細胞來說，控制轉(zhuǎn)座子調(diào)換的頻率對于細胞來說，控制轉(zhuǎn)座子調(diào)換的頻率是很重要的，轉(zhuǎn)座子必須能維持某一最是很重要的，轉(zhuǎn)座子必須能維持某一最小的移動頻率，因為太大的頻率會破壞小的移動頻率，因為太大的頻率會破壞宿主細胞，研究表明每一個轉(zhuǎn)座子都有宿主細胞，研究表明每一個轉(zhuǎn)座子都有控制它自身調(diào)換頻率的機制。控制它自身調(diào)換頻率的機制。通過反義通過反義RNA的翻譯水平控制的翻譯水平控制IS10R外側(cè)邊緣兩個啟動子外側(cè)邊緣兩個啟動子PIN弱啟動子弱啟動子控制控制IS10R的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄POUT強啟動子強啟動子右向轉(zhuǎn)錄宿主右向轉(zhuǎn)錄宿主DNAINRNA和和OUTRNA有