谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定

1、實驗十七實驗十七 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定定Exp.17 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase 一、實驗原理一、實驗原理 氨基移換酶也稱轉(zhuǎn)氨酶氨基移換酶也稱轉(zhuǎn)氨酶, ,為廣泛存在于生物機體內(nèi)的酶，為廣泛存在于生物機體內(nèi)的酶，其作用為催化其作用為催化-氨基酸的氨基酸的- - 氨基與氨基與- - 酮酸的酮酸的- - 酮基互酮基互換。因此在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中間代換。因此在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中間代謝過程中有重要作用。轉(zhuǎn)氨酶的種類甚多。謝過程中有重要作用。轉(zhuǎn)氨酶的種類甚多。 任何

2、一種氨基酸進任何一種氨基酸進行轉(zhuǎn)氨作用時，都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，它們的最適行轉(zhuǎn)氨作用時，都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，它們的最適pHpH接近接近7.47.4。 在各種轉(zhuǎn)氨酶中，谷氨酸在各種轉(zhuǎn)氨酶中，谷氨酸- -草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱谷草轉(zhuǎn)草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱谷草轉(zhuǎn)氨酶）及谷氨酸氨酶）及谷氨酸- -丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶）活力最強。丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶）活力最強。 上述兩種轉(zhuǎn)氨酶均廣泛存在于機體組織內(nèi)，在正常人血清上述兩種轉(zhuǎn)氨酶均廣泛存在于機體組織內(nèi)，在正常人血清中也有少量，機體發(fā)生肝炎。心肌梗塞等病變時，血清中轉(zhuǎn)氨中也有少量，機體發(fā)生肝炎。心肌梗塞等病變時，血清中轉(zhuǎn)氨酶活力顯著增加，所

3、以在臨床診斷上轉(zhuǎn)氨酶活力的測定有重要酶活力顯著增加，所以在臨床診斷上轉(zhuǎn)氨酶活力的測定有重要意義。它們的催化反應如下：意義。它們的催化反應如下：COOH COOH COOH COOH CHNH2+ C=O C=O + CHNH2CH3 (CH2)2 CH3 (CH2)2COOH COOH轉(zhuǎn)氨酶 丙氨酸 -酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸 測定轉(zhuǎn)氨酶活力的方法很多，如分光光度法，紙測定轉(zhuǎn)氨酶活力的方法很多，如分光光度法，紙上層析法等。在本方法中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用于丙氨上層析法等。在本方法中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用于丙氨酸和酸和酮戊二酸后，生成的丙酮酸與酮戊二酸后，生成的丙酮酸與2,42,4 二硝二硝基苯肼作用生成丙

4、酮酸基苯肼作用生成丙酮酸2,42,4 二硝基苯腙。二硝基苯腙。 本方法中用分光光度法，根據(jù)硝基苯腙的生成本方法中用分光光度法，根據(jù)硝基苯腙的生成量可以計算酶的活力。量可以計算酶的活力。二、實驗用品二、實驗用品 1、材料、材料新鮮動物肝勻漿。新鮮動物肝勻漿。2、試劑、試劑（1）0.1M磷酸緩沖液（磷酸緩沖液（pH=7.4） 取取0.1M KH2PO4液液50ml，0.1N NaOH液液39.3ml，再加蒸餾水再加蒸餾水10.7ml，混勻即得。混勻即得。（2）丙酮酸鈉標準液（）丙酮酸鈉標準液（2.0微克分子微克分子/ml）：）： 取取AR丙酮酸鈉丙酮酸鈉11mg溶解于溶解于50ml 0.1M磷酸緩

5、沖液磷酸緩沖液內(nèi)（宜當日新配）。內(nèi)（宜當日新配）。（3）谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物：）谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物： 取分析純?nèi)》治黾兺於嵬於?9.2mg，DL丙氨酸丙氨酸1.79g置置于小燒杯內(nèi)，加于小燒杯內(nèi)，加1N NaOH約約10ml至完全溶解。用至完全溶解。用1N NaOH或或1N HCl校正其校正其pH=7.4，加加0.1M磷酸緩沖液稀釋磷酸緩沖液稀釋至至100ml，然后加氯仿數(shù)滴防腐，在冰箱內(nèi)可保存一周。此然后加氯仿數(shù)滴防腐，在冰箱內(nèi)可保存一周。此溶液每溶液每1.0ml含含 酮戊二酸酮戊二酸2.0微克分子，丙氨酸微克分子，丙氨酸200微克微克分子。分子。（4）2，4二硝基苯肼溶液：二硝基苯肼溶液：

6、將將AR純純2，4二硝基苯肼二硝基苯肼19.8mg加入加入200ml錐形錐形瓶內(nèi)，加瓶內(nèi)，加100ml 1N HCl液。液。2，4二硝基苯肼溶解較慢，二硝基苯肼溶解較慢，把錐形瓶放在暗處不時搖動，全部溶解后，濾入褐色玻璃把錐形瓶放在暗處不時搖動，全部溶解后，濾入褐色玻璃瓶。并置于冰箱中保存。瓶。并置于冰箱中保存。（5）0.4N氫氧化鈉液。氫氧化鈉液。3、儀器設備、儀器設備 試管、吸量管、恒溫水浴鍋、分光光度計試管、吸量管、恒溫水浴鍋、分光光度計三、方法和步驟三、方法和步驟1 1、肝勻漿制備：、肝勻漿制備： 取新鮮動物肝臟，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取肝臟取新鮮動物肝臟，用生理鹽水沖洗，濾紙吸

7、干，稱取肝臟0.50.5g g，剪成小塊，置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入剪成小塊，置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入4.54.5mlml預冷的預冷的pH pH 7.4 0.1 mol/L7.4 0.1 mol/L磷酸緩沖液，制成磷酸緩沖液，制成10%10%肝勻漿，冰凍保存。肝勻漿，冰凍保存。 2 2、標準曲線的繪制、標準曲線的繪制 取取6 6支試管分別用支試管分別用0 0、1 1、2 2、3 3、5 5標號，按標號，按下表所列次序添加各試劑。下表所列次序添加各試劑。 將試管于將試管于3737水浴中保溫，平衡管內(nèi)外溫水浴中保溫，平衡管內(nèi)外溫度度, , 向各管內(nèi)加向各管內(nèi)加0.50.5ml 2ml 2，4 4二硝基苯

8、肼后再二硝基苯肼后再保溫保溫2020分鐘，分鐘， 最后分別向各管內(nèi)加入最后分別向各管內(nèi)加入0.40.4N NaOH 5N NaOH 5毫升，毫升， 在室溫下靜置在室溫下靜置3030分鐘后，分鐘后， 以以0 0號管做號管做“空白空白”用用520520nmnm進行比色，讀進行比色，讀出光吸收值，以丙酮酸的微摩數(shù)為橫坐標，光出光吸收值，以丙酮酸的微摩數(shù)為橫坐標，光吸收值為縱坐標，畫出標準曲線。吸收值為縱坐標，畫出標準曲線。管號管號試試 劑劑 012345丙酮酸鈉標準液丙酮酸鈉標準液/ml0.000.050.100.150.200.25谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物/ml0.500.450.400.35

9、0.300.25磷酸緩沖溶液磷酸緩沖溶液(0.1M pH7.4) /ml0.100.100.100.100.100.1037水浴中保溫，水浴中保溫， 平衡管平衡管內(nèi)外溫內(nèi)外溫度度2，4-二硝基苯肼二硝基苯肼/ ml0.500.500.50 0.50 0.50 0.50 保溫保溫20分鐘分鐘NaOH (0.4N)/ml555555靜置靜置30分鐘分鐘A520nm表表1.1.丙酮酸鈉標準曲線的繪制丙酮酸鈉標準曲線的繪制1 測定管測定管2 “空白空白”對照管對照管谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物/ml0.500.5037水浴保溫水浴保溫10min，使管內(nèi)外溫度平衡，使管內(nèi)外溫度平衡稀釋肝勻漿稀釋肝勻漿/

10、ml0.1037水浴保溫水浴保溫30分鐘分鐘2,4二硝基苯肼試劑二硝基苯肼試劑/ml0.500.50稀釋肝勻漿稀釋肝勻漿/ml0.10保溫保溫20分鐘，冷卻分鐘，冷卻NaOH (0.4N) /ml5.05.0室溫下靜置室溫下靜置30分鐘分鐘A520nm表表2.2.谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活力的測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活力的測定2 2、谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活力的測定、谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活力的測定四、實驗結果四、實驗結果用光吸收值讀數(shù)在操作曲線上查出轉(zhuǎn)氨酶活力單位數(shù)，計算用光吸收值讀數(shù)在操作曲線上查出轉(zhuǎn)氨酶活力單位數(shù)，計算每每100100毫升稀釋肝勻漿中轉(zhuǎn)氨酶的活力單位數(shù)毫升稀釋肝勻漿中轉(zhuǎn)氨酶的活力單位數(shù) 五、思考題五、思考題1.

11、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的原理是什么谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的原理是什么?2.在在“空白空白”對照管中為什么也要加入肝勻漿對照管中為什么也要加入肝勻漿?一、實驗原理一、實驗原理 氨基移換酶也稱轉(zhuǎn)氨酶氨基移換酶也稱轉(zhuǎn)氨酶, ,為廣泛存在于生物機體內(nèi)的酶，為廣泛存在于生物機體內(nèi)的酶，其作用為催化其作用為催化-氨基酸的氨基酸的- - 氨基與氨基與- - 酮酸的酮酸的- - 酮基互酮基互換。因此在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中間代換。因此在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中間代謝過程中有重要作用。轉(zhuǎn)氨酶的種類甚多。謝過程中有重要作用。轉(zhuǎn)氨酶的種類甚多。 任何一種氨基酸進任何一種氨基酸進行轉(zhuǎn)氨作用時，都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，它們的最適行轉(zhuǎn)氨作用時，都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，它們的最適pHpH接近接近7.47.4。三、方法和步驟三、方法和步驟1 1、肝勻漿制備：、肝勻漿制備： 取新鮮動物肝臟，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取肝臟取新鮮動物肝臟，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取肝臟0.50.5g g，剪成小塊，置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入剪成小塊，置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入4.54.5mlml預冷