病原真菌的分離與培養(yǎng)

1、園藝作物病蟲害防治園藝作物病蟲害防治學(xué)習(xí)情境1 蔬菜病蟲害防治蔬菜病蟲害防治子學(xué)習(xí)情境子學(xué)習(xí)情境2:2:侵染性病害防治侵染性病害防治 病原真菌的分離與培養(yǎng)病原真菌的分離與培養(yǎng)一、目的要求 掌握病原真菌分離培養(yǎng)的基本原理、學(xué)會(huì)消毒、滅菌、倒平板、病原真菌的組織分離和稀釋分離的基本方法。二、材料、用具和藥品 新鮮的真菌病害分離材料、PDA的斜面與平板培養(yǎng)基、無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)或無(wú)菌操作箱（接種箱）、恒溫箱、紫外線滅菌燈、酒精燈、火柴、吸管、剪刀、鑷子、接種環(huán)、接種針、福爾馬林、70%乙醇、0.1%升汞、無(wú)菌水和記號(hào)筆等。三、內(nèi)容與方法 分離是將病原物從發(fā)病組織上與其他微生物分開；培養(yǎng)是將分離的病原

2、物移到可以讓這種病原物正常生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)（培養(yǎng)基）上，從而獲得其純培養(yǎng)。（一）分離前的準(zhǔn)備工作 1.工作環(huán)境和分離用具的清潔和消毒（1）常用的消毒方法： 常用消毒方法及其使用范圍方法方法操作操作使用范圍使用范圍濕熱法濕熱法常壓蒸汽常壓蒸汽不宜用高壓蒸汽滅菌的不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)基煮沸煮沸玻璃器皿玻璃器皿輻射法輻射法用用30W、253.7nm波長(zhǎng)的紫外燈照波長(zhǎng)的紫外燈照射射20-30min.無(wú)菌室、無(wú)菌箱、衣物無(wú)菌室、無(wú)菌箱、衣物等空氣及物體表面等空氣及物體表面化學(xué)藥品法化學(xué)藥品法70%乙醇、乙醇、2%煤酚皂（來(lái)蘇水）、煤酚皂（來(lái)蘇水）、5%石碳酸液等噴霧石碳酸液等噴霧無(wú)菌室、無(wú)菌箱無(wú)

3、菌室、無(wú)菌箱0.25%新潔爾滅、新潔爾滅、0.5%次氯酸鈣次氯酸鈣（漂白粉）擦拭（漂白粉）擦拭玻璃器皿、金屬和木質(zhì)玻璃器皿、金屬和木質(zhì)器皿等器皿等70%乙醇、乙醇、0.1%新潔爾滅、新潔爾滅、0.1%升升汞浸泡、擦拭汞浸泡、擦拭手（不可用升汞），分手（不可用升汞），分離材料離材料（2）清潔和消毒工作環(huán)境 為了避免污染，分離工作要求在無(wú)菌條件下進(jìn)行，無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)或無(wú)菌操作箱（接種箱）是分離工作不可缺少的設(shè)施。在分離前，無(wú)菌室內(nèi)用紫外燈照射20-30min，以殺死室內(nèi)空氣中的大多數(shù)細(xì)菌。無(wú)菌操作箱可在分離前用化學(xué)消毒劑清除箱內(nèi)微生物。 若分離工作只能在普通房間進(jìn)行時(shí)，必須對(duì)房間進(jìn)行徹底清潔，

4、關(guān)閉門窗，避免空氣流動(dòng)，經(jīng)過(guò)噴霧或在地上多灑些水，以除去空氣及地面灰塵后進(jìn)行操作，也可獲得較好的結(jié)果。工作前擦凈桌面，最好鋪上濕毛巾自認(rèn)清潔或紗布上，盡量避免工作過(guò)程中臨時(shí)取物帶來(lái)污染。工作人員要注意清潔，工作前用肥皂洗手，分離前還要用70%乙醇擦拭雙手。（3）消毒分離用具 凡是和分離材料接觸的器皿和材料都要保持無(wú)菌。將分離用具浸于70%乙醇中，使用時(shí)在燈焰上燒去乙醇滅菌，如此3次（刀、剪、鑷等不宜燒時(shí)過(guò)長(zhǎng)，以防退火），再次使用時(shí)必須重復(fù)滅菌。2、選擇分離材料 分離材料應(yīng)盡量新鮮，減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。從受病組織分離材料應(yīng)盡量新鮮，減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。從受病組織邊緣靠近健全組織的部分分離，可

5、減少污染，同時(shí)這部分病原生邊緣靠近健全組織的部分分離，可減少污染，同時(shí)這部分病原生物處于較為活躍的狀態(tài)，生長(zhǎng)快，易分離成功。物處于較為活躍的狀態(tài)，生長(zhǎng)快，易分離成功。四、病原真菌的分離方法：四、病原真菌的分離方法：（一）組織分離法：（一）組織分離法： 1.培養(yǎng)皿準(zhǔn)備：培養(yǎng)皿準(zhǔn)備：取滅菌培養(yǎng)皿一個(gè)，置于濕紗布上，在皿蓋上注取滅菌培養(yǎng)皿一個(gè)，置于濕紗布上，在皿蓋上注 明分離日期、材料和分離人姓名。明分離日期、材料和分離人姓名。 2.培養(yǎng)皿平板制作：培養(yǎng)皿平板制作：無(wú)菌操作法向培養(yǎng)皿中加入無(wú)菌操作法向培養(yǎng)皿中加入25%乳酸乳酸1-2滴滴 （減少細(xì)菌污染），然后將熔化而冷至（減少細(xì)菌污染），然后將熔化

6、而冷至45左右的左右的馬鈴薯瓊脂馬鈴薯瓊脂 培養(yǎng)基培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，輕輕搖成平面（分離細(xì)菌時(shí)則不能加乳倒入培養(yǎng)皿中，輕輕搖成平面（分離細(xì)菌時(shí)則不能加乳 酸）。酸）。馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）的制作：培養(yǎng)基）的制作：配方：土豆配方：土豆200g200g，葡萄糖，葡萄糖20g20g，瓊脂，瓊脂151520g20g，水，水1000mL1000mL，pHpH值自然。值自然。（1 1）稱量和熬煮稱量和熬煮：藥品實(shí)際用量計(jì)算后，按培養(yǎng)基配方逐一稱取去：藥品實(shí)際用量計(jì)算后，按培養(yǎng)基配方逐一稱取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000ml1000

7、ml，在加熱器上加熱至，在加熱器上加熱至沸騰，維持沸騰，維持202030min30min，用可用，用可用2 2層紗布趁熱在量杯上過(guò)濾，濾渣棄層紗布趁熱在量杯上過(guò)濾，濾渣棄取。濾液補(bǔ)充水分到取。濾液補(bǔ)充水分到1000ml1000ml。（2 2）加熱溶解加熱溶解：把濾液放入鍋中，加入葡萄糖：把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g20g，瓊脂，瓊脂151520g20g（提前搞碎），然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，（提前搞碎），然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補(bǔ)充水分至所需量。以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補(bǔ)充水分至所需量。（3

8、3）分裝分裝：按實(shí)驗(yàn)要求，將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或：按實(shí)驗(yàn)要求，將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或500ml500ml三角瓶三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上造成污染。內(nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上造成污染。滅菌與消毒滅菌與消毒： 任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般般培養(yǎng)基的滅菌采用培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。高壓蒸汽滅菌。 常用的滅菌的方法有：干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌、常壓蒸汽滅菌、常用的滅菌的方法有：干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌、常壓蒸汽滅菌、常壓間歇式滅菌、超高溫滅菌、過(guò)濾除菌、

9、輻射滅菌、化學(xué)藥品滅菌常壓間歇式滅菌、超高溫滅菌、過(guò)濾除菌、輻射滅菌、化學(xué)藥品滅菌等方等方法。法。 本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的滅菌常使用的是本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的滅菌常使用的是高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌，它是利用高溫濕，它是利用高溫濕熱空氣熱空氣使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的。使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的。高壓滅菌鍋操作過(guò)程高壓滅菌鍋操作過(guò)程 加水加水裝鍋裝鍋蓋蓋蓋蓋加熱加熱當(dāng)壓力升為當(dāng)壓力升為0.5kg/cm0.5kg/cm2 2時(shí)排放冷空氣時(shí)排放冷空氣正式升壓正式升壓保壓（保壓（1.1kg/cm1.1kg/cm2 2，121121，保持保持20-30min20-30min）停止加熱停止加熱自然降壓至零自然

10、降壓至零排放余排放余汽汽開蓋開蓋取出滅菌物品取出滅菌物品趁熱擺斜面趁熱擺斜面檢驗(yàn)滅菌效果。檢驗(yàn)滅菌效果。 約約5050倒平板倒平板灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染3.3.切取病組織小塊（葉斑病類）切取病組織小塊（葉斑病類）：取真菌葉斑病的新鮮病葉取真菌葉斑病的新鮮病葉( (或其他或其他分離材料分離材料) )，選擇典型的單個(gè)病斑，用解剖刀從病斑邊緣，選擇典型的單個(gè)病斑，用解剖刀從病斑邊緣( (病健交病健交界處界處) )切取小塊切取小塊( (邊長(zhǎng)邊長(zhǎng)3-4mm)3-4mm)病組織數(shù)塊。病

11、組織數(shù)塊。提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋混入的機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點(diǎn)病害應(yīng)在臨近健全組織的部分分離。生，因此，一般斑點(diǎn)病害應(yīng)在臨近健全組織的部分分離。4.4.表面消毒：表面消毒：將病組織放人將病組織放人7070酒精中浸酒精中浸35s35s后，按無(wú)菌操作法將后，按無(wú)菌操作法將病組織移人病組織移人0 01 1升汞液中分別表面消毒升汞液中分別表面消毒0 05 5、1 1、2 2、3 3、5 5minmin( (也可使用其他表面

12、消毒劑也可使用其他表面消毒劑, ,如漂白粉精片如漂白粉精片1-21-2片，研磨后加滅片，研磨后加滅菌水菌水20mL20mL，消毒，消毒5-10min5-10min。) )，如植物組織柔嫩，則表面消毒時(shí)間，如植物組織柔嫩，則表面消毒時(shí)間宜短；反之則可長(zhǎng)些。然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘宜短；反之則可長(zhǎng)些。然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。留的消毒劑。 果實(shí)、塊莖和枝桿等組織內(nèi)部的病原菌可用脫脂棉蘸果實(shí)、塊莖和枝桿等組織內(nèi)部的病原菌可用脫脂棉蘸70%70%酒精涂拭酒精涂拭病病部表面，通過(guò)火焰燒去表面酒精，重復(fù)進(jìn)行部表面，通過(guò)火焰燒去表面酒精，重復(fù)進(jìn)行2-32-3次，達(dá)到表面消毒

13、。次，達(dá)到表面消毒。 提示：先用提示：先用7070的酒精浸的酒精浸2 2、3s3s是為了消除寄主表面的氣泡，減少是為了消除寄主表面的氣泡，減少表表面張面張 力，力，7070的酒精亦用于表面消毒，處理的時(shí)間較短的酒精亦用于表面消毒，處理的時(shí)間較短( (一般數(shù)秒一般數(shù)秒lmin)lmin)。升汞溶液消毒的時(shí)間因材料而異，可自升汞溶液消毒的時(shí)間因材料而異，可自30s30s至至30min30min不等，一般情況下，不等，一般情況下，需時(shí)間需時(shí)間3 3，5min5min。 5. 5.接種：接種：用無(wú)菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放用無(wú)菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放4-4-6-6塊。

14、塊。提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無(wú)菌吸水提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無(wú)菌吸水紙上紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染。吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染。(6) (6) 培養(yǎng)：培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿倒置放人將培養(yǎng)皿倒置放人26-2826-28左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般334d4d后后 觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果。觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果。（7 7）制片觀察：制片觀察：用無(wú)菌操作法自培養(yǎng)皿中選擇菌落，挑取少許菌絲用無(wú)菌操作法自培養(yǎng)皿中選擇菌落，挑取少許菌絲及孢及孢 子，在顯微鏡下觀察。若病組織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，子，在顯微

15、鏡下觀察。若病組織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，則則 多半為要分離的病原菌。在無(wú)菌條件下，用接種針多半為要分離的病原菌。在無(wú)菌條件下，用接種針( (鏟鏟) )自菌落自菌落邊緣邊緣 挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在2525左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后，后， 觀察菌落生長(zhǎng)情況，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即得該分離病菌純菌種，觀察菌落生長(zhǎng)情況，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即得該分離病菌純菌種，便可便可 置于冰箱中保存。置于冰箱中保存。（二）稀釋分離法（二）稀釋分離法 稀釋分離法主要用于在病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原菌物。先將待稀釋分離法主要用于在病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原菌物。先將待分分

16、離的孢子進(jìn)行梯度稀釋后，進(jìn)行分離培養(yǎng)。離的孢子進(jìn)行梯度稀釋后，進(jìn)行分離培養(yǎng)。1.1.涂布平板法涂布平板法（1 1）梯度稀釋菌懸液：將待分離病原菌配制成菌懸液，再用無(wú)菌水作）梯度稀釋菌懸液：將待分離病原菌配制成菌懸液，再用無(wú)菌水作倍比倍比 稀釋。方法：用稀釋。方法：用1mL1mL無(wú)菌吸管吸取無(wú)菌吸管吸取1mL1mL菌懸液注入盛有菌懸液注入盛有9mL9mL無(wú)菌水無(wú)菌水的試管的試管 中，吹吸中，吹吸3 3次，使充分混勻。然后再用一支次，使充分混勻。然后再用一支1mL1mL無(wú)菌吸管從此試管無(wú)菌吸管從此試管中吸取中吸取 1mL 1mL注入另一盛有注入另一盛有9mL9mL無(wú)菌水的試管中，依此類推，制成無(wú)菌

17、水的試管中，依此類推，制成1010-1-1、1010- -2 2、1010-3-3、 10 10-4-4等稀釋度的菌懸液。一般稀釋等稀釋度的菌懸液。一般稀釋3-63-6個(gè)梯度。個(gè)梯度。 （2）涂布：分別用無(wú)菌吸管從最后3種稀釋度的試管中吸取0.1mL菌懸液 對(duì)號(hào)放入平板上，用無(wú)菌涂布棒在培養(yǎng)基表面均勻涂布。 （3）標(biāo)記：在培養(yǎng)皿底面標(biāo)記菌懸液稀釋度、分離日期和分離人姓名。 （4）培養(yǎng)：將培養(yǎng)基平板倒置于28恒溫箱中培養(yǎng)，一般需要恒溫箱中培養(yǎng)，一般需要3-5d3-5d。 （5）純化：觀察菌落生長(zhǎng)情況，將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別移入純化：觀察菌落生長(zhǎng)情況，將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別移入斜面培斜面培

18、 養(yǎng)基上，純化步驟同組織分離法。養(yǎng)基上，純化步驟同組織分離法。2.2.傾注平板法傾注平板法（1 1）取滅菌培養(yǎng)皿）取滅菌培養(yǎng)皿3 3個(gè)，平放在濕紗布上，分別編號(hào)（個(gè)，平放在濕紗布上，分別編號(hào)（1 1、2 2、3 3、），、），并并 注明日期、分離材料及分離者姓名。注明日期、分離材料及分離者姓名。（2 2）用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一培養(yǎng)皿中分別注入）用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一培養(yǎng)皿中分別注入0.5-1.0mL0.5-1.0mL滅滅菌水。菌水。（3 3）用滅菌接種餌從病斑上刮取病菌孢子，放入培養(yǎng)皿內(nèi)的水滴中，）用滅菌接種餌從病斑上刮取病菌孢子，放入培養(yǎng)皿內(nèi)的水滴中，配成配成 孢子懸浮液。孢子懸

19、浮液。（4 4）用接種餌蘸一餌孢子懸浮液，與第一個(gè)培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，）用接種餌蘸一餌孢子懸浮液，與第一個(gè)培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再?gòu)脑購(gòu)?第一個(gè)培養(yǎng)皿移第一個(gè)培養(yǎng)皿移3 3餌孢子懸浮液到第二個(gè)培養(yǎng)皿中，混合后再移餌孢子懸浮液到第二個(gè)培養(yǎng)皿中，混合后再移3 3餌孢餌孢 子懸浮液到第三個(gè)培養(yǎng)皿中。每次移菌前，接種餌均需在酒精子懸浮液到第三個(gè)培養(yǎng)皿中。每次移菌前，接種餌均需在酒精燈火焰燈火焰 上燒過(guò)。上燒過(guò)。（5 5）將熔化并冷卻到）將熔化并冷卻到4545左右的培養(yǎng)基，分別倒在左右的培養(yǎng)基，分別倒在3 3個(gè)培養(yǎng)皿中，搖動(dòng)個(gè)培養(yǎng)皿中，搖動(dòng) 使培養(yǎng)基與稀釋的菌落充分混勻，平置冷卻凝固。使培養(yǎng)基與稀釋的

20、菌落充分混勻，平置冷卻凝固。（6 6）將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)后放入恒溫箱）將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)后放入恒溫箱26-2826-28中培養(yǎng)，中培養(yǎng)，3-4d3-4d后觀察菌落生長(zhǎng)后觀察菌落生長(zhǎng)情況。情況。（7 7）獲純培養(yǎng)后，從菌落邊緣挑取菌絲塊移入斜面培養(yǎng)）獲純培養(yǎng)后，從菌落邊緣挑取菌絲塊移入斜面培養(yǎng)3-4d3-4d后，放入冰后，放入冰箱保存。箱保存。（8 8）要獲得純凈培養(yǎng)，一般需經(jīng)）要獲得純凈培養(yǎng)，一般需經(jīng)3 3次稀釋分離（重復(fù)次稀釋分離（重復(fù)3 3次），當(dāng)培養(yǎng)物高次），當(dāng)培養(yǎng)物高度一致度一致 時(shí)才能作為純培養(yǎng)的菌種保存。時(shí)才能作為純培養(yǎng)的菌種保存。（9 9）真菌的培養(yǎng)。病原真菌多為好氣性真菌，在有豐富營(yíng)養(yǎng)的培

21、養(yǎng)基上）真菌的培養(yǎng)。病原真菌多為好氣性真菌，在有豐富營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上能很好能很好 地生長(zhǎng)，但他們對(duì)溫度的要求差異較大。多數(shù)在地生長(zhǎng)，但他們對(duì)溫度的要求差異較大。多數(shù)在25-3025-30正常生長(zhǎng)，正常生長(zhǎng)，少數(shù)少數(shù) 在在15-2015-20才能正常生長(zhǎng)，少數(shù)必須在才能正常生長(zhǎng)，少數(shù)必須在55左右的低溫才能萌發(fā)。左右的低溫才能萌發(fā)。四、病原真菌的分離方法：四、病原真菌的分離方法：（一）組織分離法：（一）組織分離法： 1.培養(yǎng)皿準(zhǔn)備：培養(yǎng)皿準(zhǔn)備：取滅菌培養(yǎng)皿一個(gè)，置于濕紗布上，在皿蓋上注取滅菌培養(yǎng)皿一個(gè)，置于濕紗布上，在皿蓋上注 明分離日期、材料和分離人姓名。明分離日期、材料和分離人姓名。 2.培養(yǎng)

22、皿平板制作：培養(yǎng)皿平板制作：無(wú)菌操作法向培養(yǎng)皿中加入無(wú)菌操作法向培養(yǎng)皿中加入25%乳酸乳酸1-2滴滴 （減少細(xì)菌污染），然后將熔化而冷至（減少細(xì)菌污染），然后將熔化而冷至45左右的左右的馬鈴薯瓊脂馬鈴薯瓊脂 培養(yǎng)基培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，輕輕搖成平面（分離細(xì)菌時(shí)則不能加乳倒入培養(yǎng)皿中，輕輕搖成平面（分離細(xì)菌時(shí)則不能加乳 酸）。酸）。高壓滅菌鍋操作過(guò)程高壓滅菌鍋操作過(guò)程 加水加水裝鍋裝鍋蓋蓋蓋蓋加熱加熱當(dāng)壓力升為當(dāng)壓力升為0.5kg/cm0.5kg/cm2 2時(shí)排放冷空氣時(shí)排放冷空氣正式升壓正式升壓保壓（保壓（1.1kg/cm1.1kg/cm2 2，121121，保持保持20-30min20-30m

23、in）停止加熱停止加熱自然降壓至零自然降壓至零排放余排放余汽汽開蓋開蓋取出滅菌物品取出滅菌物品趁熱擺斜面趁熱擺斜面檢驗(yàn)滅菌效果。檢驗(yàn)滅菌效果。 約約5050倒平板倒平板灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染3.3.切取病組織小塊（葉斑病類）切取病組織小塊（葉斑病類）：取真菌葉斑病的新鮮病葉取真菌葉斑病的新鮮病葉( (或其他或其他分離材料分離材料) )，選擇典型的單個(gè)病斑，用解剖刀從病斑邊緣，選擇典型的單個(gè)病斑，用解剖刀從病斑邊緣( (病健交病健交界處界處) )切取小塊切取小塊( (邊長(zhǎng)邊長(zhǎng)3-4mm)3-4mm)病組織數(shù)塊。病組織數(shù)塊。提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋混入的機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋生，因此