醬油中霉菌酵母菌計數(shù)檢測(二)

1、醬油中霉菌和酵母菌醬油中霉菌和酵母菌計數(shù)檢測計數(shù)檢測(二二) 回憶：回憶：1、什么是霉菌？霉菌易在什么環(huán)境下生長？、什么是霉菌？霉菌易在什么環(huán)境下生長？2、酵母菌的菌落有哪些特點？、酵母菌的菌落有哪些特點？霉菌：霉菌： 霉菌霉菌是在培養(yǎng)基上長成絨毛狀、棉絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀的真菌真菌。 霉菌喜好在相對溫度較低，濕度較高的環(huán)境中生長。酵母菌：酵母菌： 酵母菌屬于真菌，單細胞個體較大，菌落成圓形，邊緣光滑，菌落個體與細菌菌落形狀類似但個頭較大。工作任務第一大組任務一：第一大組任務一：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的制備第二大組任務二：第二大組任務二：無菌間梯度稀釋和接種操作無菌間梯度

2、稀釋和接種操作交換任務分兩小組完成任務，每組制備分兩小組完成任務，每組制備500mL馬鈴薯馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，分裝包扎后放入框內(nèi)，滅菌。分裝包扎后放入框內(nèi)，滅菌。分兩小組完成任務，輪流進入無菌間，分兩小組完成任務，輪流進入無菌間，進行樣品的梯度稀釋和接種工作。進行樣品的梯度稀釋和接種工作。無菌間外等候的小組進行培養(yǎng)基無菌間外等候的小組進行培養(yǎng)基預熱和儀器設備準備。預熱和儀器設備準備。實訓目的1、掌握霉菌酵母菌梯度稀釋和接種操作手法2、能夠區(qū)分霉菌酵母菌與細菌總數(shù)梯度稀釋 和接種方法差異3、掌握霉菌酵母菌計數(shù)檢測中梯度稀釋和傾 注法接種中的無菌操作要點儀器和設備 吸量管吸

3、量管1mL 4支，支，25mL1支，帶有支，帶有225mL無無菌水的三角瓶菌水的三角瓶1只，帶有只，帶有9mL無菌水的試管無菌水的試管3只，吸耳球，酒精燈，記號筆，樣品原液。只，吸耳球，酒精燈，記號筆，樣品原液。 預熱到預熱到45度左右的馬鈴薯度左右的馬鈴薯-葡萄糖葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿基，培養(yǎng)皿4個，電爐或電熱套。個，電爐或電熱套。 培養(yǎng)箱。培養(yǎng)箱。 任務一：培養(yǎng)基制備 馬鈴薯馬鈴薯-葡萄糖葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基制備瓊脂培養(yǎng)基制備配方：配方：馬鈴薯（去皮切塊）馬鈴薯（去皮切塊） 150g葡萄糖葡萄糖 10.0g瓊脂瓊脂 10.0g氯霉素氯霉素 0.05g蒸餾水蒸餾水 500mL制法：

4、制法：將馬鈴薯去皮切塊，加將馬鈴薯去皮切塊，加500mL蒸餾水煮沸蒸餾水煮沸10-20min。用紗布過。用紗布過濾，補加蒸餾水至濾，補加蒸餾水至500mL。加入葡萄糖和瓊脂，加熱熔化，分裝后，加入葡萄糖和瓊脂，加熱熔化，分裝后，121度滅菌度滅菌20分鐘。分鐘。傾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培養(yǎng)基中。傾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培養(yǎng)基中。任務二：梯度稀釋和接種梯度稀釋和傾注法接種：梯度稀釋和傾注法接種：1、吸取吸取25mL液體樣品或稱取液體樣品或稱取25g固體樣品，無菌操作固體樣品，無菌操作法加入法加入225mL無菌水中，搖勻制備成無菌水中，搖勻制備成1：10樣品溶液。樣品溶液。

5、 用用1mL無菌吸量管吸取無菌吸量管吸取1：10樣品溶液，用無菌方樣品溶液，用無菌方法各取法各取1mL，分別加入到，分別加入到2個無菌培養(yǎng)皿中。個無菌培養(yǎng)皿中。2、換一只無菌吸量管換一只無菌吸量管吸取吸取1mL1：10樣品溶液，加入樣品溶液，加入到裝有到裝有9mL無菌試管中無菌試管中反復吹吸，反復吹吸，制備成制備成1：100樣樣品溶液。品溶液。用這支吸量管各取用這支吸量管各取1mL1：100溶液，加入溶液，加入到到2個培養(yǎng)皿中。個培養(yǎng)皿中。3、再、再換一只無菌吸量管換一只無菌吸量管吸取吸取1mL1：100樣品溶液，樣品溶液，加入到裝有加入到裝有9mL無菌試管中無菌試管中反復吹吸，反復吹吸，制備

6、成制備成1：1000樣品溶液。樣品溶液。用這支吸量管各取用這支吸量管各取1mL1：1000溶液，加入到溶液，加入到2個培養(yǎng)皿中。個培養(yǎng)皿中。4、再換一只無菌吸量管，吸取、再換一只無菌吸量管，吸取1mL空白溶液，加空白溶液，加入到無菌培養(yǎng)皿中。入到無菌培養(yǎng)皿中。5、將預熱到、將預熱到45度左右的馬鈴薯度左右的馬鈴薯-葡萄糖葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加入基加入15-20mL到裝有到裝有1：10、1：100、1：1000和空白的培養(yǎng)皿中，混勻冷卻，倒置培養(yǎng)和空白的培養(yǎng)皿中，混勻冷卻，倒置培養(yǎng)28度，度，5天后觀察。天后觀察。 1、樣品的稀釋 固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225ml滅菌蒸餾水

7、的錐形瓶中，充分振搖，即為 1:10充分稀釋液。 或放入盛有225ml 無菌蒸餾水的均質袋中，用拍擊式均質器拍打2min，制成1:10的樣品勻液。 液體樣品：以無菌吸管吸取25ml樣品至盛有225ml無菌蒸餾水的錐形瓶（可在瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。 取1ml1:10稀釋液注入含有9ml無菌水的試管中， 另換一只1ml無菌吸管反復吹吸，此液為1：100稀釋液。 按上述操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1ml無菌吸管 2、接種 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀

8、釋的同時，每個稀釋度分別吸取1ml樣品勻液于2個無菌平皿內(nèi)。同時分別取1ml樣品稀釋液加入2個無菌平皿作空白對照。 及時將 15ml20ml 冷卻至 46的馬鈴薯葡萄糖瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基（可放置于461恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。國家標準介紹 目前使用標準：目前使用標準：中華人民共和國國家標準 GB4789.152010 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù) 適用范圍：適用范圍：本標準規(guī)定了食品中霉菌和酵母菌 的計數(shù)方法。 本標準適用與各類食品中霉菌和酵母的計數(shù)。 檢測流程 檢樣25g（ml）樣品+ 225ml無菌蒸餾水，均質10倍系列稀釋選擇2個3個適

9、宜稀釋度的樣品勻液，各取 1ml 分別加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)每皿中加入15ml20ml 馬鈴薯葡萄糖瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基菌落計數(shù) 報告操作步驟1、 樣品的稀釋固體和半固體樣品：固體和半固體樣品： 稱取25g樣品至盛有225ml滅菌蒸餾水的錐形瓶中，充分振搖，即為 1:10充分稀釋液?；蚍湃胧⒂?25ml 無菌蒸餾水的均質袋中，用拍擊式均質器拍打2min，制成1:10的樣品勻液。液體樣品：液體樣品： 以無菌吸管吸取25ml樣品至盛有225ml無菌蒸餾水的錐形瓶（可在瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。取1ml1:10稀釋液注入含有9ml無菌水的試管中， 另換一只1ml無

10、菌吸管反復吹吸，此液為1：100稀釋液。按上述操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1ml無菌吸管。2、接種 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋的同時，每個稀釋度分別吸取1ml樣品勻液于2個無菌平皿內(nèi)。同時分別取1ml樣品稀釋液加入2個無菌平皿作空白對照。 及時將 15ml20ml 冷卻至 46的馬鈴薯馬鈴薯葡萄葡萄糖糖瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基（可放置于461恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。3、培養(yǎng) 待瓊脂凝固后，將平板倒置，281培養(yǎng)5d，觀察并記錄。4、 菌落計數(shù)

11、 肉眼觀察必要時可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應的霉菌和酵母數(shù)。霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計。菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。 5、結果與報告結果計數(shù)： 計計算兩個平板菌落數(shù)的平均數(shù)，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)計算。 若所有平板上菌落數(shù)均大于150 CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多 不可計，結果按平均落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。報告： 菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報告。 菌落術大于或等于100時，前3位數(shù)字采用兩位有效數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結果：也可以10的指數(shù)來表示，此時也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字 稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/g為單位報告，報告或分別報告霉菌和/或酵母菌。附表： 孟加拉紅培養(yǎng)基孟加拉紅培養(yǎng)基配方：配方：蛋白胨蛋白胨 5.0g 葡萄糖葡萄糖 10.0g磷酸二氫鉀磷酸二氫鉀 1.0g 硫酸鎂（無水）硫酸鎂（無水） 0.5g瓊脂瓊脂 20.0g 孟加拉紅孟加拉紅 0.033g氯霉素氯霉素 0.1g 蒸餾水蒸餾水 1000mL制法：制法：將上述成分加入蒸餾水中，加熱熔化，補足蒸餾水至將上述成分加入蒸餾水中，加熱熔化，補足蒸餾水至1000mL，