實(shí)驗(yàn)四植物葉綠素的定量與分光光度計(jì)的使用

1、植物葉綠素的定量測(cè)定及吸收光譜 分光光度計(jì)的使用2010.04.07一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?l學(xué)習(xí)基本的物質(zhì)定量測(cè)定方法與學(xué)習(xí)基本的物質(zhì)定量測(cè)定方法與分光光度計(jì)的使用。分光光度計(jì)的使用。l學(xué)習(xí)測(cè)定葉綠素總量及吸收光譜學(xué)習(xí)測(cè)定葉綠素總量及吸收光譜的技術(shù)的技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理l葉綠素的含量測(cè)定方法有多種，其中主要有：葉綠素的含量測(cè)定方法有多種，其中主要有： 1、原子吸收光譜法：、原子吸收光譜法： 2、分光光度法：、分光光度法：l 葉綠素葉綠素a 和葉綠素和葉綠素b 在在649nm 和和665nm 處處有最大吸收，且兩吸收曲線相交于有最大吸收，且兩吸收曲線相交于652nm 處。處。因此測(cè)定

2、提取液在因此測(cè)定提取液在649nm、665nm，并根據(jù)，并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式可分別計(jì)算出葉綠素經(jīng)驗(yàn)公式可分別計(jì)算出葉綠素a、葉綠素、葉綠素b和和總?cè)~綠素的含量。總?cè)~綠素的含量。 三、儀器、原料和試劑三、儀器、原料和試劑 l分光光度計(jì)、天平、研缽、棕色容量瓶、分光光度計(jì)、天平、研缽、棕色容量瓶、小漏斗、定量濾紙、新鮮的植物葉片、小漏斗、定量濾紙、新鮮的植物葉片、95乙醇乙醇(或或80丙酮丙酮)、石英砂、碳酸、石英砂、碳酸鈣粉鈣粉四、操作步驟四、操作步驟 1.葉綠素濾液的提取制備：葉綠素濾液的提取制備：2.比色與結(jié)果計(jì)算：比色與結(jié)果計(jì)算：3.吸收光譜曲線測(cè)定與繪制吸收光譜曲線測(cè)定與繪制1.葉綠素濾液的提

3、取制備：葉綠素濾液的提取制備：l葉片葉片0.5g、石英砂和碳酸鈣粉、石英砂和碳酸鈣粉、3mL95乙醇，研磨之糊狀；再加乙醇乙醇，研磨之糊狀；再加乙醇10mL ，研，研磨至組織變白磨至組織變白 。l靜置靜置35min 。l用濾紙過濾至棕色容量瓶中，少量乙醇沖用濾紙過濾至棕色容量瓶中，少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次 。l定容至定容至25mL。2.比色與結(jié)果計(jì)算：比色與結(jié)果計(jì)算：l以以95乙醇為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)乙醇為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)665nm、649nm 和和652nm 下測(cè)定濾液的吸光度。下測(cè)定濾液的吸光度。l95 乙醇提取液中色素濃度計(jì)算公式乙醇提取液中色素濃度計(jì)算公式（

4、mg/L）：）： Ca=13.95A665-6.88A649 Cb=24.96A649-7.32A665 葉片色素的含量葉片色素的含量 五、在五、在96乙醇中葉綠素的吸收光譜乙醇中葉綠素的吸收光譜 l95乙醇作空白對(duì)照，在乙醇作空白對(duì)照，在400-700nm范圍內(nèi)以范圍內(nèi)以20nm間隔測(cè)定并記錄提取間隔測(cè)定并記錄提取液的光密度讀數(shù)，在最大吸收部位，液的光密度讀數(shù)，在最大吸收部位，以以5毫微米為間隔增加讀數(shù)。毫微米為間隔增加讀數(shù)。l以光密度讀數(shù)為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)為橫坐以光密度讀數(shù)為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，繪葉綠素吸收光譜圖。標(biāo)，繪葉綠素吸收光譜圖。 葉綠素吸收光譜曲線 721型分光光度計(jì)的工作原理型分

5、光光度計(jì)的工作原理 l分光光度計(jì)的基本工作原理分光光度計(jì)的基本工作原理 l721型分光光度計(jì)的構(gòu)造型分光光度計(jì)的構(gòu)造 l721型分光光度計(jì)的使用方法型分光光度計(jì)的使用方法l721型分光光度計(jì)使用和維護(hù)中應(yīng)型分光光度計(jì)使用和維護(hù)中應(yīng)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)基本工作原理基本工作原理l物質(zhì)對(duì)光物質(zhì)對(duì)光(對(duì)光的波長(zhǎng)對(duì)光的波長(zhǎng))的吸收具有選擇性，不同的的吸收具有選擇性，不同的物質(zhì)都有各自的吸收光帶。當(dāng)光色散后的光譜通過物質(zhì)都有各自的吸收光帶。當(dāng)光色散后的光譜通過某一溶液時(shí)，其中某些光線就會(huì)被溶液吸收。某一溶液時(shí)，其中某些光線就會(huì)被溶液吸收。 l吸光度吸光度:是指光線通過溶液或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)是指光線通過溶液

6、或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)度度 與該光線通過溶液或物質(zhì)后的透射光強(qiáng)度比值的與該光線通過溶液或物質(zhì)后的透射光強(qiáng)度比值的對(duì)數(shù)。對(duì)數(shù)。 l吸光系數(shù)與入射光的波長(zhǎng)以及被光通過的物質(zhì)有關(guān)。吸光系數(shù)與入射光的波長(zhǎng)以及被光通過的物質(zhì)有關(guān)。只要光的波長(zhǎng)被固定下來，同一種物質(zhì)，吸光系數(shù)只要光的波長(zhǎng)被固定下來，同一種物質(zhì)，吸光系數(shù)就不變。就不變。 l比爾定律比爾定律 ：在一定的波長(zhǎng)下，溶液中物質(zhì)的濃度與：在一定的波長(zhǎng)下，溶液中物質(zhì)的濃度與光能量減弱的程度有一定的比例關(guān)系光能量減弱的程度有一定的比例關(guān)系 。A=lg(1/T)=Kbc。 721型分光光度計(jì)的構(gòu)造型分光光度計(jì)的構(gòu)造 l721型分光光度計(jì)允許的測(cè)定波長(zhǎng)范圍在

7、型分光光度計(jì)允許的測(cè)定波長(zhǎng)范圍在360800nm。 721型分光光度計(jì)的使用方法型分光光度計(jì)的使用方法l預(yù)熱預(yù)熱 靈敏度選靈敏度選 擇波長(zhǎng)選擇擇波長(zhǎng)選擇 T調(diào)調(diào)“0” T調(diào)調(diào)“100%” 測(cè)定、讀數(shù)測(cè)定、讀數(shù) 完畢完畢l預(yù)熱：打電源開關(guān)，掀開暗箱蓋，預(yù)預(yù)熱：打電源開關(guān)，掀開暗箱蓋，預(yù)熱熱10-20min。 l靈敏度選擇：將靈敏度開關(guān)調(diào)至靈敏度選擇：將靈敏度開關(guān)調(diào)至“1”檔（若零點(diǎn)調(diào)節(jié)器調(diào)不到檔（若零點(diǎn)調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0”時(shí)，需時(shí)，需選用較高檔。）選用較高檔。） l波長(zhǎng)選擇：根據(jù)所需波長(zhǎng)轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選波長(zhǎng)選擇：根據(jù)所需波長(zhǎng)轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕。擇鈕。 lT調(diào)調(diào)“0”：在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)：在暗箱蓋開啟狀態(tài)

8、下調(diào)節(jié)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤指針指向零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤指針指向T=0處。處。l將空白液及測(cè)定液分別倒入比色杯將空白液及測(cè)定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，使空白管對(duì)準(zhǔn)光路。內(nèi)，使空白管對(duì)準(zhǔn)光路。 lT調(diào)調(diào)“100%”：蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)：蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)“100”調(diào)節(jié)器，使空白管的調(diào)節(jié)器，使空白管的T=100。l測(cè)定：指針穩(wěn)定后，逐步拉出樣品滑測(cè)定：指針穩(wěn)定后，逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測(cè)定管的光密度值，并竿，分別讀出測(cè)定管的光密度值，并記錄。記錄。 l比色完畢：關(guān)上電源，取出比色皿洗比色完畢：關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。使用和維護(hù)中應(yīng)注意事項(xiàng)使用和維護(hù)中應(yīng)注意事項(xiàng) l連續(xù)使用不應(yīng)超過連續(xù)使用不應(yīng)超過2小時(shí)，最好是間歇小時(shí)，最好是間歇0.5小時(shí)后，再繼續(xù)使用。小時(shí)后，再繼