碩士生物儀器分析之紫外-可見(jiàn)光譜

1、碩士生物儀器分析之紫外-可見(jiàn)光譜光是一種電磁輻射，從波長(zhǎng)極短的宇宙射線光是一種電磁輻射，從波長(zhǎng)極短的宇宙射線至波長(zhǎng)很長(zhǎng)的無(wú)線電構(gòu)成一個(gè)連續(xù)光譜。至波長(zhǎng)很長(zhǎng)的無(wú)線電構(gòu)成一個(gè)連續(xù)光譜。部分電磁輻射范圍遠(yuǎn)紫外遠(yuǎn)紫外 100200 nm近紫外近紫外 200400 nm可見(jiàn)光可見(jiàn)光 400800 nm近紅外近紅外 8002500 nm遠(yuǎn)紅外遠(yuǎn)紅外 25003500 nm譜圖范圍的選擇，決定了儀器采用的光學(xué)組件譜圖范圍的選擇，決定了儀器采用的光學(xué)組件UV-Vis Spectrophotometer(UV-Vis) 紫外線是位于日光高能區(qū)的紫外線是位于日光高能區(qū)的不可見(jiàn)光線（不可見(jiàn)光線（100-400 nm

2、） 近紫外線近紫外線UVC （200-280 nm）: 在經(jīng)過(guò)地球表面同在經(jīng)過(guò)地球表面同溫層時(shí)被臭氧層吸收，不能達(dá)到地球表面。溫層時(shí)被臭氧層吸收，不能達(dá)到地球表面。 遠(yuǎn)紫外線遠(yuǎn)紫外線UVB（280-320nm）: 極大部分被皮膚表皮極大部分被皮膚表皮所吸收，不能再滲入皮膚內(nèi)部。但由于其階能較高，所吸收，不能再滲入皮膚內(nèi)部。但由于其階能較高，對(duì)皮膚可產(chǎn)生強(qiáng)烈的光損傷。對(duì)皮膚可產(chǎn)生強(qiáng)烈的光損傷。 超短紫外線超短紫外線UVA（320-400nm）：穿透性遠(yuǎn)比中波）：穿透性遠(yuǎn)比中波紫外線要強(qiáng)，可達(dá)到真皮深處，引起皮膚黑色素沉紫外線要強(qiáng)，可達(dá)到真皮深處，引起皮膚黑色素沉著著, 可防御紫外線，保護(hù)皮膚?？?/p>

3、防御紫外線，保護(hù)皮膚。 紫外線根據(jù)波長(zhǎng)分為：紫外線根據(jù)波長(zhǎng)分為：根據(jù)生物效應(yīng)的不同，將紫外根據(jù)生物效應(yīng)的不同，將紫外線按照波長(zhǎng)劃分為四個(gè)波段線按照波長(zhǎng)劃分為四個(gè)波段 ：l UVC波段（波段（200275 nm） 短波滅菌紫外線； 穿透能力最弱，無(wú)法穿透大部分的透明玻璃及塑料； 對(duì)人體傷害很大，短時(shí)間照射即可灼傷皮膚； 長(zhǎng)期或高強(qiáng)度照射還會(huì)造成皮膚癌； 紫外線殺菌燈紫外線殺菌燈。 lUVD波段（波段（100200 nm）真空紫外線；穿透能力極弱；臭氧發(fā)生線臭氧發(fā)生線。 lUVA波段（波段（320400nm） 長(zhǎng)波黑斑效應(yīng)紫外線； 有很強(qiáng)的穿透力，可以穿透大部分透明的玻璃以及塑料； 可直達(dá)真皮層，

4、破壞彈性纖維和膠原蛋白纖維，曬黑； 360 nm波長(zhǎng)制作誘蟲燈誘蟲燈； 365 nm可用于礦石鑒定、舞臺(tái)裝飾、驗(yàn)鈔等場(chǎng)所礦石鑒定、舞臺(tái)裝飾、驗(yàn)鈔等場(chǎng)所； 蝦青素能有效消除UVA對(duì)皮膚細(xì)胞的傷害 。l UVB波段（波段（275320 nm） 中波紅斑效應(yīng)紫外線； 中等穿透力，波長(zhǎng)較短的部分會(huì)被透明玻璃吸收； 能促進(jìn)體內(nèi)礦物質(zhì)代謝和維生素D的形成； 長(zhǎng)期或過(guò)量照射會(huì)令皮膚曬黑； 紫外線保健燈、植物生長(zhǎng)燈紫外線保健燈、植物生長(zhǎng)燈。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 消毒殺菌；消毒殺菌； 促進(jìn)骨骼發(fā)育；促進(jìn)骨骼發(fā)育； 對(duì)血色有益；對(duì)血色有益； 偶爾可以治療某些皮膚病偶爾可以治療某些皮膚病; 紫外線照射直接影響人體維生紫外

5、線照射直接影響人體維生素素D的合成的合成缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 使皮膚老化產(chǎn)生皺紋使皮膚老化產(chǎn)生皺紋 產(chǎn)生斑點(diǎn)產(chǎn)生斑點(diǎn) 造成皮膚炎造成皮膚炎 造成皮膚癌造成皮膚癌 造成皮膚粗糙造成皮膚粗糙 滅菌：細(xì)菌中的滅菌：細(xì)菌中的DNA、RNA和核蛋白的吸收紫外線的和核蛋白的吸收紫外線的最強(qiáng)峰在最強(qiáng)峰在254257 nm。 細(xì)菌吸收紫外線后，引起細(xì)菌吸收紫外線后，引起DNA鏈斷裂，造成核鏈斷裂，造成核酸和蛋白的交聯(lián)破裂，殺滅核酸的生物活性，酸和蛋白的交聯(lián)破裂，殺滅核酸的生物活性，致細(xì)菌死亡。致細(xì)菌死亡。 化學(xué)：涂料固化，顏料固化，光刻，油煙氧化，光觸酶化學(xué)：涂料固化，顏料固化，光刻，油煙氧化，光觸酶 儀器分析：礦石

6、，藥物，食品分析儀器分析：礦石，藥物，食品分析 生物學(xué)：滅菌，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，誘殺蚊蟲，人體保健照射生物學(xué)：滅菌，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，誘殺蚊蟲，人體保健照射UV-vis spectroscopy is the measurement of the wavelength and intensity of absorption of near-ultraviolet and visible light by a sample. Ultraviolet and visible light are energetic enough to promote outer electrons to higher en

7、ergy levels. The ultraviolet region falls in the range between 190-380 nm. The visible region fall between 380-750 nm.UV-vis spectroscopy is usually applied to molecules and inorganic ions or complexes in solution. The uv-vis spectra have broad features that are of limited use for sample identificat

8、ion but are very useful for quantitative measurements. 分子從電子基態(tài)（分子從電子基態(tài)（S0）躍遷到電子激發(fā)態(tài)（）躍遷到電子激發(fā)態(tài)（SE）的的E遠(yuǎn)大于振動(dòng)能級(jí)及轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的遠(yuǎn)大于振動(dòng)能級(jí)及轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的E。 電子躍遷所吸收的電磁波是吸收光譜中頻率最高電子躍遷所吸收的電磁波是吸收光譜中頻率最高的，即紫外可見(jiàn)光。的，即紫外可見(jiàn)光。分子的總能量是其鍵能分子的總能量是其鍵能(電子能電子能)、振動(dòng)能和轉(zhuǎn)、振動(dòng)能和轉(zhuǎn)動(dòng)能的總和動(dòng)能的總和，當(dāng)分子從輻射的電磁波吸收能量之后，分子會(huì)從低能級(jí)躍遷到較高的能級(jí)。多原子分子電子能級(jí)和躍遷類型n *有機(jī)化合物外層電子為：

9、有機(jī)化合物外層電子為：鍵的鍵的電子；電子；鍵的鍵的電子；電子；未成鍵的孤電子對(duì)未成鍵的孤電子對(duì)n電子；電子； 電子躍遷產(chǎn)生紫外可見(jiàn)吸收光譜電子躍遷產(chǎn)生紫外可見(jiàn)吸收光譜吸收頻率決定于分子的能級(jí)差，其計(jì)算式為： E = h 或或 E = hC / 式中 E為分于躍遷前后能級(jí)差； 、分別為所吸收的電磁波的頻率及波長(zhǎng)； C為光速； h為普朗克常數(shù)。紫外吸收譜帶的形狀：較寬較寬分子吸收電磁波能量后,電子從基態(tài) s0躍遷到激發(fā)態(tài),其同時(shí)伴隨有振動(dòng)能級(jí)的躍遷振動(dòng)能級(jí)的躍遷+轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷稀薄氣態(tài)稀薄氣態(tài)濃度增大濃度增大低極性溶劑低極性溶劑高極性溶劑高極性溶劑The concentration

10、of an analyte in solution can be determined by measuring the absorbance at some wavelength and applying the Beer-Lambert Law. 朗伯朗伯比爾定律比爾定律cl0IIlogAA=吸光度 I0=入射光強(qiáng)度I=入射光通過(guò)樣品后的透射強(qiáng)度摩爾吸光度（cm-1.m-1）C=摩爾濃度(mol) l=光程(cm)Molar absorptivities may be very large for strongly absorbing compounds ( 10,000) and ver

11、y small if absorption is weak ( = 10 to 100).朗伯朗伯比爾定律比爾定律UV/VIS spectroscopy in microplates (or 96 well) 水乙腈n-Hexane 正己烷Isooctane 異辛烷Cyclohexane 環(huán)己烷95%乙醇Methanol 甲醇Ethyl ether 乙醚Dioxane 1,4-二氧六環(huán)三甲基磷酸酯Chloroform 氯仿190190200200205205205215215215245常用溶劑的透明界限常用溶劑的透明界限SolventLower limit (nm)透明界限溶劑的選擇：溶劑的

12、選擇：(1) 端吸收(2) 樣品濃度(3) 溶質(zhì)和溶劑分子之間的作用力(4) 溶劑的揮發(fā)性、穩(wěn)定性、精制的再現(xiàn)性等。生色團(tuán)生色團(tuán) (chromophore)：產(chǎn)生紫外(或可見(jiàn))吸收的不飽和基團(tuán)，如CC、CO、NO2等。助色團(tuán)助色團(tuán) (auxochrome)：其本身是飽和基團(tuán)(常含雜原子)，它連到生色團(tuán)時(shí)，能使后者吸收波長(zhǎng)變長(zhǎng)或吸收強(qiáng)度增加(或同時(shí)兩者兼有)，如：OH、 NH2、Cl等。深色位移深色位移 (bathochromic shift)：由于基團(tuán)取代或溶劑效應(yīng)，最大吸收波長(zhǎng)變長(zhǎng)。深色位移亦稱為紅移(red shift)。淺色位移淺色位移 (hypsochromic shift)：由于基團(tuán)

13、取代或溶劑效應(yīng)，最大吸收波長(zhǎng)變短。淺色位移亦稱為藍(lán)移(blue shift)。增色效應(yīng)增色效應(yīng) (hyperchromic effect)：使吸收強(qiáng)度增加的效應(yīng)。減色效應(yīng)減色效應(yīng) (hypochromic effect)：使吸收強(qiáng)度減小的效應(yīng)。基本術(shù)語(yǔ)基本術(shù)語(yǔ)1. 簡(jiǎn)單分子簡(jiǎn)單分子A. 飽和的有機(jī)化合物飽和的有機(jī)化合物 a. 飽和的碳?xì)浠衔镲柡偷奶細(xì)浠衔?*躍遷，紫外吸收的波長(zhǎng)很短。 b. 含雜原子的飽和化合物含雜原子的飽和化合物 雜原子一般為助色團(tuán)，有n *躍遷。近紫外區(qū)仍無(wú)明顯吸收。 硫醚、二硫化物、硫醇、胺、溴化物、碘化物在近紫外有弱吸收，但其大多數(shù)均不明顯。B. 含非共軛烯、炔基團(tuán)

14、的化合物含非共軛烯、炔基團(tuán)的化合物 都含電子，可以發(fā)生*躍遷，其紫外吸收波長(zhǎng)較 *為長(zhǎng)，但乙烯吸收在165nm、乙炔吸收在173nm。因此，它們雖名為生色團(tuán)，但若無(wú)助色團(tuán)的作用，在近紫外區(qū)仍無(wú)吸收。 C. 含不飽和雜原子的化合物含不飽和雜原子的化合物 *、 *屬遠(yuǎn)紫外吸收， n *亦屬遠(yuǎn)紫外吸收，不便檢測(cè)， 但 n *躍遷在紫外區(qū)，可檢測(cè)。吸收強(qiáng)度低，但吸收位置較佳，易于檢測(cè)。因此，在紫外鑒定中是不應(yīng)忽視的。 2. 含有共軛體系的分子含有共軛體系的分子A. 共軛體系的形成使吸收移向長(zhǎng)波方向共軛體系的形成使吸收移向長(zhǎng)波方向 一般把共軛體系的吸收帶稱為K帶 (源于德文konjugierte)。K帶

15、對(duì)近紫外吸收是重要的，因其出現(xiàn)在近紫外范圍，且摩爾吸收系數(shù)也高，一般10000。B. 共軛醛、酮紫外吸收共軛醛、酮紫外吸收(K帶帶)的計(jì)算的計(jì)算2. 含有共軛體系的分子含有共軛體系的分子C. a a, b b不飽和酸、酯不飽和酸、酯2. 含有共軛體系的分子含有共軛體系的分子一些共軛羧酸的UV吸收： 化合物 實(shí)測(cè)值（104） 計(jì)算值CH2=CHCO2H 200（1.0）CH3CH=CHCO2H 205（1.4）Ph=CHCO2H 220（1.4） 222（2175）CH3 (CH=CH)2CO2H 254（2.5） 256（3018208）CH3 (CH=CH) 3CO2H 294（3.7） 2

16、86（6018208）CH3 (CH=CH)4CO2H 332（4.9） 316（9018208）3. 芳香族化合物芳香族化合物A. 苯苯 苯環(huán)顯示三個(gè)吸收帶，它們均起源于苯環(huán)*的躍遷，如上表所示。B. 烷基苯烷基苯C. 助色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物助色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物D. 生色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物生色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CNE. 多取代苯環(huán)多取代苯環(huán)F. 雜芳環(huán)化合物雜芳環(huán)化合物苯苯萘萘蒽蒽 苯并蒽苯并蒽 3. 芳香族化合物芳香族化合物A. 苯苯 苯環(huán)顯示三個(gè)吸收帶，它們均起源于苯環(huán)*的躍遷，如上表所示。B. 烷基苯烷基苯C. 助色團(tuán)在苯環(huán)上取

17、代的衍生物助色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物D. 生色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物生色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CNE. 多取代苯環(huán)多取代苯環(huán)F. 雜芳環(huán)化合物雜芳環(huán)化合物苯苯萘萘蒽蒽 苯并蒽苯并蒽 3. 芳香族化合物芳香族化合物A. 苯苯 苯環(huán)顯示三個(gè)吸收帶，它們均起源于苯環(huán)*的躍遷，如上表所示。B. 烷基苯烷基苯C. 助色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物助色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物D. 生色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物生色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CNE. 多取代苯環(huán)多取代苯環(huán)F. 雜芳環(huán)化合物雜芳環(huán)化合物苯苯萘萘蒽蒽 苯并蒽苯并蒽 化合物在2208

18、00nm內(nèi)無(wú)紫外吸收，說(shuō)明該化合物是脂肪烴、脂環(huán)烴或它們的簡(jiǎn)單衍生物(氯化物、醇、醚、羧酸等)，甚至可能是非共軛的烯。 220250nm內(nèi)顯示強(qiáng)的吸收(近10000或更大)，即存在共軛的兩個(gè)不飽和鍵(共軛二烯或a,b 不飽和醛、酮)。 250290nm內(nèi)顯示中等強(qiáng)度吸收，且常顯示不同程度的精細(xì)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明苯環(huán)或某些雜芳環(huán)的存在。 250350nm內(nèi)顯示中、低強(qiáng)度的吸收，說(shuō)明碳基或共軛羰基的存在。 300nm以上的高強(qiáng)度吸收，說(shuō)明該化合物具有較大的共軛體系。若高強(qiáng)度吸收具有明顯的精細(xì)結(jié)構(gòu)。說(shuō)明稠環(huán)芳烴、稠環(huán)雜芳烴或其衍生物的存在。 提供有關(guān)該化合物的共軛體系或某些碳基等提供有關(guān)該化合物的共軛體系或

19、某些碳基等的存在的信息。的存在的信息。 藍(lán)移、紅移、pH值影響主機(jī)由光源（氘燈或鎢主機(jī)由光源（氘燈或鎢燈）、單色器（或雙色器）、燈）、單色器（或雙色器）、樣品室、檢測(cè)系統(tǒng)、電機(jī)驅(qū)動(dòng)、樣品室、檢測(cè)系統(tǒng)、電機(jī)驅(qū)動(dòng)、計(jì)算機(jī)接口、電源等部分組成。計(jì)算機(jī)接口、電源等部分組成。Instruments: Cary 300, Cary 50 with fiber optic probesingle beam uv-vis spectrophotometer dual-beam uv-vis spectrophotometer光譜掃描 如實(shí)地顯示樣品的全波長(zhǎng)圖譜，是化學(xué)分析工作者的常規(guī)分析手段。參數(shù)設(shè)置： A、

20、光度范圍： B、取樣間隔： C、掃描速度：測(cè)量運(yùn)行： 比色皿(cuvette)校正單波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)法 雙波長(zhǎng)等吸收點(diǎn)法雙波長(zhǎng)系數(shù)倍率法三波長(zhǎng)法Beer-Lambert Law 朗伯朗伯比爾定律比爾定律cl0IIlogAA=吸光度 I0=入射光強(qiáng)度I=入射光通過(guò)樣品后的透射強(qiáng)度摩爾吸光度（cm-1.m-1）C=摩爾濃度(mol) l=光程(cm)標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法在決定一系列維生素、抗菌素及一些天然物結(jié)構(gòu)曾起過(guò)重要作用，如維生素A1、A2、B12、B1、青霉素、鏈霉素、土霉素、螢火蟲尾部的發(fā)光物質(zhì)（是由熒光酶(luciferase)作為酶催化底物分子熒光素(luciferin)）等。紫外吸收光譜

21、用來(lái)決定雙鍵的位置，既簡(jiǎn)單又有效，例如：COOHH3CCH(CH3)2CH3COOHH3CCH(CH3)2CH3 松香酸235248nm左旋海松酸260283nm紫外光譜應(yīng)用舉例紫外光譜應(yīng)用舉例For the spectrum on the right, a solution of 0.249 mg of the unsaturated aldehyde in 95% ethanol (1.42 10-5 M) was placed in a 1 cm cuvette for measurement. Using the above formula, = 36,600 for the 395

22、nm peak, and 14,000 for the 255 nm peak. Note that the absorption extends into the visible region of the spectrum, so it is not surprising that this compound is orange colored.Typical UV / VIS spectum of chlorophyll a a in dry diethyl ether on a Shimadzu Spectrophotometer UV 3101. Typical UV / VIS s

23、pectum of chlorophyll a a in dry diethyl ether on a Shimadzu Spectrophotometer UV 3101. UV-vis spectrum of bisulphide in sewage二硫化物 (下水道里的)污物 p-硝基苯酚降解的硝基苯酚降解的UV-Vis光譜圖光譜圖The n electrons (or the nonbonding electrons) are the ones located on the oxygen of the carbonyl group of tetraphenyclopentadienon

24、e. Thus, the n to pi* transition corresponds to the excitation of an electron from one of the unshared pair to the pi* orbital.Tetraphenylcyclopentadienone四苯基環(huán)戊二烯酮Protein absorbances come from 3 sources 1. Peptide Bond Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, and His sidechains have absorption in this region also (

25、190 - 230 nm) but is very weak compared to peptide bond p - p*. Absorption in the 190-230 nm region can be and is used to quantitate protein/peptide concentrations, but this is complicated by many compounds used in buffers which also absorb at these wavelengths. Phe 250 = 400 symmetry forbidden p p - p p*Tyr 274 = 1400 p p - p p*Trp 280 = 4500 at least 3 different transitions.A280 is one of the most commonly used methods to measure protein concentration (aside from colorimetric methods such as the Lowry or Bradford dye binding assays), bu