蕎麥中的多酚提取和鑒定

1、本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 甜蕎麩皮中咖啡酰吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷的分離純化及抗氧化活性分析 姓 名 顧焱 班 級(jí) 應(yīng)用化學(xué)1101 學(xué) 號(hào) 4103110124 指導(dǎo)老師 劉琴 答辯日期 2015.06.06 目錄1前言61.1蕎麥簡(jiǎn)介61.2植物多酚61.3植物多酚的生物活性71.3.1清除自由基、抗氧化71.3.2抗病毒、抗菌功能71.3.3抗腫瘤活性71.3.4抗心腦血管疾病81.3.5美白防曬、延緩衰老81.4甜蕎多酚81.5多酚的提取方法81.6多酚的分離純化方法91.6.1大孔樹脂柱層析91.6.2聚酰胺柱層析91.6.3葡聚糖凝膠柱層析101.6.4 HPLC/MS檢測(cè)方法簡(jiǎn)介10

2、1.7多酚抗氧化活性的測(cè)定方法111.7.1 DPPH法(Radical Scavenging Capacity Assay)111.7.2 FRAP法(Ferric-reducing Antioxidant Power)111.8本文研究目的122實(shí)驗(yàn)材料與方法132.1 材料和試劑132.2 儀器設(shè)備132.3 實(shí)驗(yàn)方法142.3.1樣品的預(yù)處理142.3.2蕎麥麩皮中多酚的提取142.3.3液質(zhì)聯(lián)用法(HPLC-MS)鑒定甜蕎麩皮中的多酚142.3.4甜蕎麩皮多酚的分離純化152.3.4.1大孔樹脂分離152.3.4.2聚酰胺分離162.3.4.3 Sephadex-LH 20葡聚糖分離

3、162.3.5分離純化產(chǎn)物的抗氧化性分析172.3.5.1 DPPH法172.3.5.2 FRAP法182.3.6數(shù)據(jù)分析203實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論203.1蕎麥麩皮粗提液的液相色譜析203.2大孔樹脂分離純化223.3聚酰胺分離純化233.4 Sephadex-LH 20葡聚糖的分離純化263.5 咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷的抗氧化性分析274結(jié)論與展望295參考文獻(xiàn)296致謝32甜蕎麩皮中咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷的分離純化及抗氧化活性分析摘要：本文主要以甜蕎麩為原料，對(duì)甜蕎麩中的多酚進(jìn)行提取，再分別利用不同的柱層析方法對(duì)其中的咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷進(jìn)行分離純化，最后對(duì)純化

4、產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化性分析。經(jīng)鑒定甜蕎麩皮中主要有15種多酚成分，其中最主要的物質(zhì)為咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷；先后分別利用大孔樹脂、聚酰胺和Sephadex-LH20葡聚糖凝膠柱層析方法使咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷得到了純化；最后用DPPH和FRAP方法對(duì)純化產(chǎn)物及其苷元咖啡酸進(jìn)行抗氧化性比較，發(fā)現(xiàn)純化產(chǎn)物的抗氧化性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于咖啡酸，由此推斷其中的糖苷鍵可能是由咖啡酰中酚羥基與糖環(huán)中的酚羥基形成。關(guān)鍵詞：甜蕎麩； 多酚； 分離純化； 咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷；抗氧化性The purification and antioxidant activity studies of caff

5、eoyl-rhamnopyranoside-glucopyra-noside in common buckwheat branAbstract:In this work, polyphenol in common buckwheat bran was separated and purified by using column chromatography in order to get caffeoyl-rhamno-pyranoside-glucopyra-noside. The antioxidant activity of purified caffeoyl-rham- nopyran

6、oside-glucopyra-noside was studied as well. Fifteen polyphenol species were detected in the common buckwheat bran, and caffeoyl-rhamnopyranoside-glucopyra-noside had highest content. Therefore, caffeoyl-rhamnopyranoside-glu-copyra-noside was purified by colomn chromatography method and macroporousre

7、sin, polyamide combine with glucan (Sephadex-LH20) ere used as purification ma-terial. The antioxidant activities of purified product were then studied by DPPHand FRAP method. The results showed that the antioxidant activity of caffeoyl-rhamnopyranside-glucopyranoside was much lower than that of caf

8、feic acid inboth methods. As a result, a structure of the product was proposed.Keywords: common buckwheat bran; polyphenol; purification; cafeoyl-rhamn- opyranoside-glucopyranoside; antioxidant activity;1前言1.1蕎麥簡(jiǎn)介蕎麥?zhǔn)且环N古老的蕎麥屬植物(蓼科)，其起源于中國和其他的亞洲國家，一年一熟，蕎麥屬約有19種。蕎麥有兩個(gè)大的分類甜蕎和苦蕎。蕎麥?zhǔn)且环N重要的糧食作物，為傳統(tǒng)農(nóng)民的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生

9、存提供了保障。蕎麥作為一種綠色的保健類食品已經(jīng)風(fēng)靡全世界，主要在于因?yàn)槭w麥中含有較高生物價(jià)的蛋白質(zhì)和豐富的維生素。近幾年的研究表明，蕎麥中最重要的具有保健效果的物質(zhì)是多酚類物質(zhì)?？嗍w中的主要多酚類物質(zhì)為蘆丁，它其有強(qiáng)化毛細(xì)血管、降血壓、預(yù)防腦中風(fēng)等功效1。而甜蕎中的多酚類物質(zhì)比苦蕎中要豐富得多,在甜蕎殼、麩皮和粉中的分布各不相同。1.2植物多酚一般，我們將多個(gè)羥基與一個(gè)或多個(gè)苯環(huán)相連的化合物統(tǒng)稱為多酚類化合物。植物多酚(Plant polyphenol)又名植物單寧(Vegetable tannin)，具有多元酚結(jié)構(gòu)，主要存在于植物的皮、根、葉子、和果實(shí)中2。Haslam將植物多酚分為棸棓酸酯

10、類和聚黃烷醇類兩大基本類型，其統(tǒng)稱為植物多酚。棸棓酸酯類多酚的分子內(nèi)具有酯鍵，一般以多元醇為中心，由酯鍵與多個(gè)酚羧酸相連接而成。不穩(wěn)定，其在酸、堿、酶的作用下容易水解。聚黃烷醇類多酚是一種是黃烷醇聚合物，其分子中的芳香環(huán)全部以C-C鍵相連，難水解，強(qiáng)酸條件下可縮合成不溶于水的物質(zhì)3。由于具有獨(dú)特的功能活性,目前植物多酚已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、制革和日用化工等相關(guān)領(lǐng)域,并發(fā)揮著不可替代的作用。同時(shí),隨著天然產(chǎn)物開發(fā)利用的逐漸興起,植物多酚類物質(zhì)已成為天然產(chǎn)物和有化學(xué)研究的熱點(diǎn),國內(nèi)外研工作者紛紛從各個(gè)領(lǐng)域和角度對(duì)植物多酚開展了廣泛深入的研究工作4,5。1.3植物多酚的生物活性1.3.1清除自由基

11、、抗氧化多酚類物質(zhì)因其羥基取代的高反應(yīng)性和吞噬自由基的能力而具有很好的抗氧化活性。多酚以大量的酚羥基作為氫供體，可以將活性較高的單線態(tài)氧1O2，變?yōu)榛钚暂^低的三線態(tài)氧3O2，對(duì)多種活氧具有清除作用，從而減少自由基產(chǎn)生的可能性，同時(shí)也是各種自由基的有效的清除劑，生成活性較低的多酚自由基，從而打斷自由基氧化的鎖鏈反應(yīng)；其次，多酚可以鄰位二羥基與金屬離子螯合，減少金屬離子對(duì)氧化反應(yīng)的催化；再者，對(duì)于有氧化酶存在的體系，如體內(nèi)主要的氧自由基生成的源頭XOD，多對(duì)其有顯著的抑制能力；植物多酚還能與 VC和 VE等抗氧化劑間產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，具有增效劑作用6。1.3.2抗病毒、抗菌功能以單寧為主體的植物多酚對(duì)

12、微生物具有廣譜性，其機(jī)理為：以單寧為主的多酚可以和微生物的體內(nèi)的酶結(jié)合(如纖維素酶、果膠酶)，從而抑制該類酶的活性以達(dá)到抑菌的效。對(duì)細(xì)菌的最低抑制濃度MIC范圍一般0.0121 g/L之間，對(duì)酵母為25125 g/L7。1.3.3抗腫瘤活性植物多酚的抗癌作用已經(jīng)得到證實(shí)，其機(jī)理主要是清除自由基、調(diào)控致癌過程中的關(guān)鍵酶、直接與親電子的最終致癌物作用，抑制癌細(xì)胞的增值，從而抑制癌癥的發(fā)生8。有統(tǒng)計(jì)資料顯示，日本國內(nèi)綠茶消費(fèi)較多的地區(qū)，胃癌發(fā)病率較低。長(zhǎng)期飲用綠茶、水果以及蔬菜，也能有效減少癌癥和腫瘤的發(fā)病率。已有研究證明，綠茶、花茶、烏龍茶均有抗癌作用，這是由于茶葉中的茶多酚可以阻斷亞硝酸鹽等多種

13、致癌物質(zhì)在體內(nèi)合成，并具有直殺傷癌細(xì)胞的功效，對(duì)胃癌、腸癌等多種癌癥的預(yù)防和治療均有裨益。長(zhǎng)期飲用，能減少癌癥和腫瘤發(fā)病率9。1.3.4抗心腦血管疾病多酚能夠有效誘導(dǎo)血管舒張，抑制血小板的聚粘連和抑制脂新陳代謝中的酶作用，故有助于防止動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)和冠心病等常見心腦血管疾病的發(fā)生10。1.3.5美白防曬、延緩衰老植物多酚在200300nm之間尤其是在遠(yuǎn)紫外區(qū)具有很強(qiáng)的紫外吸收能力。多酚還能夠有效抑制皮膚黑色素的生成，從而起到美白防曬的作用11。同時(shí)多酚也能夠促進(jìn)皮膚新陳代謝和延緩皮膚衰老。故多酚可作為許多具有美白、防曬和抗老化功效的化妝品的有效成分。 1.4甜蕎多酚Mitsuru Wata

14、naba12經(jīng)過對(duì)甜蕎麥籽粒進(jìn)行研究后表明,蕎麥籽粒中抗氧化成分主要是(-)-表兒茶素、(-)-表兒茶素-3-O-P-羥基苯甲酸苷、(+)-兒茶素-7-O-b-D-吡喃葡萄糖苷、(-)-表兒茶素-3-O-(3，4-雙甲氧基)棓酸鹽(屬黃烷醇),它們比蘆丁含量多,且抗氧化性比蘆丁強(qiáng)。33Mitsuru Watanba在甜蕎殼中發(fā)現(xiàn)以下五種主要的抗氧化劑：原兒茶酸、3，4雙羥基苯甲醛、槲皮黃酮、金絲桃苷和蘆丁13。1.5多酚的提取方法常見的多酚的提取方法有溶劑提取法、微波輔助提取、超聲波輔助提取、生物酶解提取、超臨界流體萃取和膜技術(shù)提取法等。溶劑提取法是一種較為傳統(tǒng)的提取方法，也是當(dāng)下采用的最廣泛

15、的提取方法?？紤]溶劑的選擇時(shí)，一般我們會(huì)遵循相似相溶的原則。由于多酚是一種極性較強(qiáng)的化合物，應(yīng)該選擇大極性的溶劑提取。一般實(shí)驗(yàn)中我們會(huì)在除雜之后的蕎麥原料中加入極性較大的水、乙醇、丙酮、甲醇、乙酸乙酯等作為提取劑。除雜過程可用活性炭脫色、氯仿除雜、石油醚除色素、低溫靜置等方法14,15。有些有機(jī)溶劑回收難，有毒性，因此，溶劑法的缺點(diǎn)是：(1)涉及的有機(jī)溶劑多且用量大；(2)工序多工藝繁瑣復(fù)雜，需多次蒸餾；(3)加熱時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)品及操作不夠安全，生產(chǎn)成本偏高16。1.6多酚的分離純化方法1.6.1大孔樹脂柱層析大孔樹脂是一種內(nèi)部具有三維空間立體孔結(jié)構(gòu),孔徑與比表面積都比較大的高分子聚合物,它不溶于

16、酸、堿及乙醇、丙酮和烴類等有機(jī)溶劑,對(duì)氧、熱和化學(xué)試劑穩(wěn)定。大孔樹脂包括大孔離子交換樹脂和大孔吸附樹脂,一般認(rèn)為,依靠物理界面力作用引起溶液中溶質(zhì)濃度的減少稱為吸附,因化學(xué)作用引起溶液中溶質(zhì)變化的稱為離子交換17。采用大孔樹脂對(duì)蕎麥中存在的各種多酚的分離，先利用大孔樹脂將蕎麥中多酚進(jìn)行吸附，然后依靠每種多酚的極性的差異，用不同濃度的甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，將沖出的液體流經(jīng)紫外檢測(cè)儀，紫外檢測(cè)儀的示數(shù)的變化進(jìn)行分接，以達(dá)到將不同的多酚進(jìn)行粗分離的目的。1.6.2聚酰胺柱層析聚酰胺(Polymide)是通過酰胺基聚合而成的一類高分子化合物層析柱分離中常用的聚酰胺是由己內(nèi)酰胺聚合而成的尼龍6和由己二酸

17、和己二胺聚合而成的尼龍66。聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿以及丙酮等有機(jī)溶劑，對(duì)堿較穩(wěn)定，對(duì)酸尤其是無機(jī)酸的穩(wěn)定性較差，可溶于濃鹽酸、冰醋酸及甲酸。聚酰胺由酰胺鍵聚合形成的高分子聚合物。其酰胺基可以與羥基酚類、酸類、醌類等化合物以氫鍵形成結(jié)合而被吸附，其脂肪長(zhǎng)鏈可作為分配層析的載體。聚酰胺在含水系統(tǒng)中層析時(shí)，聚酰胺作為非極性固定相，其層析行為為反向?qū)游鲋?；在非水溶劑系統(tǒng)時(shí)，聚酰胺作為分配層析的載體，其層析行為為正向?qū)游鲋＞埘０贩肿又杏袠O性酰胺基團(tuán)和非極性的脂肪鍵。作為一個(gè)相對(duì)弱極性的化合物，當(dāng)移動(dòng)相為極性強(qiáng)的溶劑時(shí)，聚酰胺作為非性固定相，其層析行為類似反向分配層析，極性交大的吸附物易

18、被洗脫。隨著洗脫劑極性降低，極性小的化合物可相繼被洗脫下來。1.6.3葡聚糖凝膠柱層析凝膠層析是一種液相層析，機(jī)理是分子篩效應(yīng)。當(dāng)洗脫開始以后，小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流程長(zhǎng)，流動(dòng)慢；大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流程短，流動(dòng)快。這樣就可以是大小不同的分子分開18。Sephadex G和Sephadex LH-20是分離多酚類化合物時(shí)最常使用凝膠材料，它們洗脫速度快，可以反復(fù)使用而且分離物質(zhì)損失較少。其中交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20為分離純化植物中天然活性物質(zhì)最廣泛使用的葡聚糖凝膠。Sephadex LH-20為親脂性的凝膠，其分離原理主要是凝膠過濾，當(dāng)洗脫劑為反相溶劑(常見的

19、為醇和水的混合溶劑)時(shí)，還有伴隨著反相分配作用，即極性大的物質(zhì)先洗脫出，極性小的后洗脫出。多酚化合物在葡聚糖凝膠上的吸附能力的主要取決于分子中的游離羥基數(shù)，游離羥基越多吸附能力越強(qiáng)。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠常用有機(jī)溶劑醇和水按不同比例混合的混合溶劑作為洗脫劑，可以用一種濃度的醇溶液等梯度洗脫，也可以逐步提高甲醇的含量，進(jìn)行梯度洗脫。 1.6.4 HPLC/MS檢測(cè)方法簡(jiǎn)介高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography /HPLC)具有易操作、靈敏度高和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，已成為分析測(cè)定黃酮類物質(zhì)的主要方法。應(yīng)用HPLC進(jìn)行分析時(shí)，一般根據(jù)

20、同種物質(zhì)在相同的液相條件下保留時(shí)間相同，以及不同黃酮類物質(zhì)具有不同的紫外特征吸收的特點(diǎn)，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照來確定黃酮類物質(zhì)的種類。同時(shí)HPLC可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，因此應(yīng)用非常的廣泛。但是要鑒定一種未知的黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，只用HPLC分析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。液質(zhì)聯(lián)用(HPLC/MS法集色譜分離和質(zhì)譜定性為一體簡(jiǎn)化了復(fù)雜體系的前處理，并可獲得被測(cè)組分的結(jié)構(gòu)信息，因此在黃酮化合物的分析中具有很大優(yōu)勢(shì)。1.7多酚抗氧化活性的測(cè)定方法1.7.1 DPPH法(Radical Scavenging Capacity Assay)DPPH 自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)是一種

21、穩(wěn)定的人工合成自由基，其醇溶液在 516 nm 處有一特征的紫紅色團(tuán)吸收峰。在抗氧化劑存在的條件下，抗氧化劑提供一個(gè) H 質(zhì)子使 DPPH 形成穩(wěn)定的 DPPH-H 分子，溶液的顏色從紫紅色慢慢轉(zhuǎn)變成淡黃色導(dǎo)致其在 516nm 處的吸光度減少。通常利用 DPPH 自由基的褪色反應(yīng)研究天然產(chǎn)物的抗氧化活性，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用紫外分光度法進(jìn)行定量分析酚酸類物質(zhì)的抗氧化活性。該方法因具有操作簡(jiǎn)單、快速、可靠等優(yōu)點(diǎn)，在抗氧化活性的研究中被廣泛的應(yīng)用19。1.7.2 FRAP法(Ferric-reducing Antioxidant Power)FRAP法即“亞鐵還原能力實(shí)

22、驗(yàn)”，其測(cè)定總抗氧化能力的原理是：酸性條件下，抗氧化物可以還原Fe3+-TPTZ產(chǎn)生藍(lán)紫色的Fe2+-TPTZ，隨后在596nm測(cè)定吸光度，其吸光度的變化與還原物質(zhì)的含量呈比例關(guān)系，即可作為樣品的總抗氧化能力的指標(biāo)。由于反應(yīng)在酸性條件下進(jìn)行，可以抑制內(nèi)源性的一些干擾因素。并且由于樣品的Fe3+或Fe2+的總濃度通常低于10M，因此樣品中的Fe3+或Fe2+不會(huì)顯著干擾FRAP法的檢反應(yīng)。由于反應(yīng)體系中的鐵離子或亞鐵離子是和TPTZ螯合的，樣品本身含有的少量金屬離子螯合劑通常也不會(huì)顯著影響檢測(cè)反應(yīng)20。1.8本文研究目的甜蕎作為藥食兩用的粗糧得到了人們?cè)絹碓蕉嘤H睞，甜蕎麩皮中含有豐富的具有抗氧化

23、性的植物化學(xué)素，如多酚等物質(zhì)，這類物質(zhì)可以作為功能性成分添加在食品中或用于生產(chǎn)功能保健品。甜蕎麩皮中多酚的種類豐富，咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷是其中最主要物質(zhì)，目前還沒有對(duì)于物質(zhì)進(jìn)行分離純化的報(bào)道。本課題的研究以甜蕎麩皮為原料，對(duì)其多酚多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，并分別利用大孔樹脂、聚酰胺和Sehpdex-LH20葡聚糖凝膠柱層析方法，對(duì)咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷進(jìn)行分離純化，對(duì)純化產(chǎn)物與其苷元咖啡酸進(jìn)行抗氧化性比較，研究糖苷對(duì)多酚類物質(zhì)抗氧化活性的影響。本文通過對(duì)甜蕎麩皮中咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷提取純化工藝條件的探索和氧化活性的研究，對(duì)甜蕎麩皮加工再利用需找新的途徑，也為多酚類

24、物質(zhì)抗氧化性研究提供基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)。2實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1 材料和試劑甜蕎，購自蘇果超市；AB-8型大孔樹脂，購自天津大學(xué)化工廠；聚酰胺樹脂，購自上海源葉生物科技有限公司；Sephadex-LH 20葡聚糖凝膠，購自上海藍(lán)技科技發(fā)展有限公司；石油醚、丙酮、甲醇、乙醇、鹽酸均為分析純，購自南京化學(xué)試劑有限公司；Trolox(水溶性VE)、1,1- 二苯基-2- 苦肼基(DPPH自由基)、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)、2，2偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、熒光素鈉(Fluorescein disodium)，購自Sigma-Aldrich 公司；2.2 儀器設(shè)備德

25、國Retsch超離心粉碎儀ZM200；西德 Brabander-880200 型磨粉機(jī)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；電子天平JA5003N，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) ，美國貝克曼公司；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵，鞏義市子華儀器有限公司；HL-2恒流泵，上海滬西分析儀器廠；高效液相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1100 LC/ MSD VL)；752紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器SHA-B金壇市榮華儀器造有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；ZNHW-II型精密電子控制儀，杭州大衛(wèi)科教

26、儀器有限公司；2.3 實(shí)驗(yàn)方法2.3.1樣品的預(yù)處理將超市購買的甜蕎用超離心粉碎儀進(jìn)行粉碎、過40目和80目的篩。取過40目但不過80目的粉末作為甜蕎麩皮原料。將粉末包入濾紙，于索氏提取器用石油醚除油8h，晾干至室溫后作為原料備用。2.3.2蕎麥麩皮中多酚的提取準(zhǔn)確稱量已除油的蕎麥麩皮30g，以1:15料液比加入450ml 30%(體積比)丙酮水，在40條件下于恒溫水浴鍋中震蕩提取2h。將所得提取液進(jìn)行減壓抽濾，取濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將蒸發(fā)所得殘?jiān)?0%甲醇定容至10ml。用高速冷離心機(jī)于18000r/min，20條件下離心20min。取離心后的上層清液過0.45um微孔濾膜，得粗提液。將粗提

27、液做高效液相色譜分析。2.3.3液質(zhì)聯(lián)用法(HPLC-MS)鑒定甜蕎麩皮中的多酚甜蕎麩皮提取液的液質(zhì)聯(lián)用方法：自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量：10L，液相色譜部分條件為：流動(dòng)相A為1% HAc水，流動(dòng)相B為含1% HAc的甲醇，流速為 0.5 mL /min，控制柱溫 35，采用DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm、280nm。按照表1梯度洗脫：質(zhì)譜條件：控制霧化氣(N2 )氣壓為25(Psi)；干燥氣(N2)流量為 9(l/min)；毛細(xì)管溫度為350，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，采用負(fù)離子模式。質(zhì)譜測(cè)定范圍：m/z 100-2000。表1 HPLC洗脫梯度時(shí)間（min）A%B%020803035655550

28、506060406560407010907520802.3.4甜蕎麩皮多酚的分離純化2.3.4.1大孔樹脂分離大孔樹脂的預(yù)處理：將大孔樹脂用95%的乙醇浸泡24h，以沖出其中的雜質(zhì)。將除雜之后的大孔樹脂用蒸餾水沖洗數(shù)次，置換出其中的乙醇。大孔樹脂的裝柱：(1) 將層析柱與地面垂直裝上鐵架臺(tái)，蓋上兩端的塞子(注意下方塞子有一層膜，不要裝反)，用止水夾夾住下方軟管，向柱子中加入少量蒸餾水。(2) 將燒杯中的大孔樹脂通過一根玻璃棒的引流作用倒入層析柱中，并且將燒杯中的剩余的大孔樹脂用少量的蒸餾水沖洗一并倒入層析柱。(3) 打開止水夾，將層析柱中的部分水排出，以達(dá)到將層析柱中大孔樹脂壓實(shí)的目的，但與此

29、同時(shí)應(yīng)該保持大孔樹脂上方的水面有一定的高度以防產(chǎn)生氣泡影響分離效果。(4) 待大孔樹脂全部轉(zhuǎn)移進(jìn)入層析柱中，用一定量的蒸餾水沖洗(約300ml)，以達(dá)到充分置換的目的。大孔樹脂分離：根據(jù)大孔樹脂的靜態(tài)吸附及解吸曲線，取適量的大孔樹脂經(jīng)預(yù)處理裝柱，用蒸餾水沖洗三遍(約500ml)，待水層接近大孔樹脂頂部1cm時(shí)開始緩慢滴加待分離溶液，然后用蒸餾水洗脫，約400ml，然后依次用，600ml 40%的甲醇，600ml 60%的甲醇，300ml 70%丙酮洗脫，根據(jù)連接的紫外檢測(cè)儀，在280nm檢測(cè)下吸光度值的變化收集脫液，并將收集的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用50%甲醇水溶液定容至5ml，并且過0.45um微

30、孔濾膜，然后做高效液相色譜及質(zhì)譜分析，合并成分相近的組分。2.3.4.2聚酰胺分離聚酰胺的前處理： 取適量聚酰胺以90-95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后將聚酰胺裝入色譜柱中，并對(duì)聚酰胺進(jìn)行預(yù)處理：先用95%乙醇洗脫聚酰胺材料，洗至洗脫液透明并在蒸干后沒有出現(xiàn)殘?jiān)?；再依次?倍柱體積的5%NaOH水溶液洗脫柱子，接著用1倍體積的蒸餾水洗去柱中的NaOH，然后用2倍體積的10% 醋酸水溶液中和柱子，最后用不少于4倍柱體積的蒸餾水將聚酰胺洗至pH中性。將預(yù)處理好的聚酰胺重新裝柱。 聚酰胺分離：向裝好的的聚酰胺柱中加入經(jīng)過大孔樹脂柱后合并濃縮的含有待分離物的組分，然后依次用500ml水，400ml

31、 10%的甲醇水，400ml 30%的甲醇水，450ml 50%的甲醇水，1000ml 80%的甲醇水，400ml 95%的甲醇水洗脫，根據(jù)連接的紫外檢測(cè)儀，在280nm檢測(cè)下吸光度值的變化收洗脫液，并將收集的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用50%甲醇水溶液定容至5ml，并且過0.45um微孔濾膜，然后做高效液相色譜及質(zhì)譜分析，合并成分相近的組分。2.3.4.3 Sephadex-LH 20葡聚糖分離葡聚糖的前處理：取一定量的葡聚糖，用蒸餾水溶脹48h，去掉懸浮顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液體中的氣體除掉。將層析柱洗干凈豎直固定到鐵架臺(tái)上，加入少量的蒸餾水，裝入適量

32、的葡聚糖凝膠(玻璃棒引流)。打開下端的止水夾，以壓實(shí)柱內(nèi)的葡聚糖，重復(fù)上述步驟，待加入的葡聚糖達(dá)到一定的厚度時(shí)，停止倒入葡聚糖，用300ml的蒸餾水沖洗一段時(shí)間。葡聚糖凝膠分離：取出處理完畢的葡聚糖凝膠(換一只干凈燒杯)，對(duì)取出的凝膠進(jìn)行重新裝柱,由于葡聚糖凝膠容易分層，故此次裝柱要一次完成。待重新裝柱完成之后，打開下端止水夾，壓實(shí)凝膠。待水面高過凝膠上層約1cm時(shí)，加入待分離組分。依次用200ml蒸餾水、300ml 10%、20%、30%、40%和50%甲醇水進(jìn)行梯度洗脫。根據(jù)連接的紫外檢測(cè)儀，在280nm檢測(cè)下吸光度值的變化集洗脫液，并將收集的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用50%甲醇水溶液定容至5ml

33、，并且過0.45um微孔濾膜，然后做高效液相色譜及質(zhì)譜分析，并成分相近的組分。2.3.5分離純化產(chǎn)物的抗氧化性分析將分離出來的樣品凍干，得到咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷的粉末，待用。2.3.5.1 DPPH法(1)標(biāo)準(zhǔn)品的配制：準(zhǔn)確稱取0.013g水溶性維生素E，同無水甲醇溶解至25mL。得到2.0mmol/L的儲(chǔ)備液。分別取上述儲(chǔ)備液80，310，540，770，1000 L用無水甲醇定容至2mL，稀釋得到濃度分別為0.08mmol/L，0.31mmol/L，0.54mmol/L，0.77mmol/L，1.0mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。(2)DPPH的配制：準(zhǔn)確稱取DPPH 0.00985g

34、用無水甲醇定容至250mL，得到0.1 mmol/L的DPPH溶液(避光保存，即配即用)。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定取上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.3mL，加入0.1mmol/L的DPPH溶液6ml于10mL試管中，避光并封口于 25水浴反應(yīng)60min，于516nm處測(cè)定其吸光度值(每組3個(gè)平行)。計(jì)算DPPH自由基的清除率 A%：A%= (A0 - At)/A0 *100 (At為樣品和DPPH的吸光度值；A0為無水甲醇和DPPH的吸光度值)。以自由基清除率A%為縱坐標(biāo)，以水溶性維生素E的濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=145.16B-2.0987，R2=0.9990。式中A為DP

35、PH清除率，B為水溶性維生素E的濃度。(4)樣品抗氧化性的測(cè)定準(zhǔn)確稱取不同質(zhì)量的樣品，用甲醇溶解并定容至25mL，得到濃度均為1.0 mmol/L的溶液。取0.3mL樣品溶液，加入 6.0mL 0.1mmol/L 的 DPPH 溶液于10mL試管，避光并封口于 25水浴反應(yīng)60min，于516nm處測(cè)其吸光度(每種樣品3個(gè)平行)。用水溶性維生素E(Trolx)做標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果用Trolox 當(dāng)量表示(mmol/g)，即每克樣品干重對(duì) DPPH 自由基清除能力相當(dāng)于Trolox 的毫摩爾數(shù)。2.3.5.2 FRAP法(1)標(biāo)準(zhǔn)品的配制:準(zhǔn)確稱取0.013g水溶性維生素E，同無水甲醇

36、溶解至25mL。得到2.0 mmol/L的儲(chǔ)備液。分別取上述儲(chǔ)備液80，310，540，770，1000 ，1200，1500，1800,2000L用無水甲醇定容至2mL，稀釋得到濃度分別為0.08 mmol/L，0.31 mmol/L，0.54 mmol/L，0.77 mmol/L，1.0 mmol/L，1.20 mmol/L，1.50 mmol/L，1.80 mmol/L，2.00 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。(2)TPTZ 工作液的配制:40 mmol/L HCl：取鹽酸(12 mmol/L)100 L溶于30 mL蒸餾水；20 mmol/L TPTZ溶液：準(zhǔn)確稱取0.0624g TPTZ

37、溶解于10mL， 40 mmol/L HCl；0.3mol/L，pH=3 .0醋酸鈉緩沖液：準(zhǔn)確稱取6.15g 無水乙酸鈉溶于250 mL 蒸餾水，并用12 mmol/L的濃鹽酸調(diào)至pH=3.0；20 mmol/L FeCl3 溶液：準(zhǔn)確稱取0.0324g FeCl3(無水)溶于10 mL醋酸鈉緩沖液；TPTZ工作液：取2.5mL 20 mmol/L TPTZ溶液，2.5mL 20 mmol/L的FeCl3溶液及25mL醋酸鈉緩沖液(pH=3.0)混合均勻，避光并封口于37水浴中孵化30min，即配即用。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定： 取上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1ml，TPTZ 工作液0.9ml及

38、醋酸鈉緩沖液9.0ml 于10mL試管，避光并封口于37水浴中反應(yīng)30min，于596nm處測(cè)定其吸光度值(每組3個(gè)平行)。以吸光度值為縱坐標(biāo)，水溶性維生素E的濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.3317B +0.0444，R2=0.9993。式中A為吸光度值，B為水溶性維生素E的濃度。(4)樣品抗氧化性的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取不同質(zhì)量的樣品，用甲醇溶解并定容至25mL，得到濃度均為1.0 mmol/L的溶液；取0.1mL樣品溶液，TPTZ 工作液0.9ml及醋酸鈉緩沖液9.0mL于10mL試管，避光并封口于 37水浴中反應(yīng)30min，于596nm處測(cè)其吸光度(每種樣品3個(gè)平行)；用

39、水溶性維素E(Trolox)做標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果用Trolox 當(dāng)量表示mmol/g)，即每克樣品干重抗氧化能力相當(dāng)于Trolox 的毫摩爾數(shù)。 2.3.6數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以三次實(shí)驗(yàn)的平均值±SD 表示。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論3.1蕎麥麩皮粗提液的液相色譜析甜蕎麩皮多酚的粗提液經(jīng)HPLC-MS分析，在320nm和280nm檢測(cè)出15種主要成分，液相圖見圖1，各物質(zhì)的保留時(shí)間、質(zhì)荷比以及對(duì)應(yīng)化合物在表2中列出。圖1甜蕎麩皮粗提液的HPLC圖表2 甜蕎麩皮粗提液中各組分的保留時(shí)間、質(zhì)荷比及對(duì)應(yīng)的化合物序號(hào)保留時(shí)間(min)m/z化合物112.187341.2/819.2未知215.0

40、54267.0/535.0未知317.622651.2未知418.771289.0原兒茶素522.792341.4咖啡酸己糖624.079473.2未知725.438487.2咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷826.994289.0原兒茶素929.184487.2咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷1030.896441.7/883.4表兒茶素-沒食子酸1133.666586.4未知1236.370692.3未知1339.906741.3未知1444.887609.3蘆丁1546.657469.1未知由圖1和表2可以看出，蕎麥麩皮中多酚種類比較復(fù)雜，主要物質(zhì)為1、2、7、10、13號(hào)峰，其中有許多

41、在現(xiàn)有的報(bào)道中均為出現(xiàn)的成分。7號(hào)峰無論在320nm還是280nm下均是甜蕎殼多多酚中最主要的物質(zhì)，該化合物的質(zhì)荷比(m/z)為487.2，對(duì)照之前的報(bào)道9，7號(hào)峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)可能為1-O-咖啡酰-6O-吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷。在之后的實(shí)驗(yàn)中，我們將對(duì)咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷的分離純化進(jìn)行研究，分析甜蕎麩皮中主要多酚的抗氧化活性。3.2大孔樹脂分離純化利用大孔樹脂柱層析，并用水、40%甲醇、60%甲醇和70%丙酮作為洗脫劑對(duì)甜蕎麩皮多粗提液進(jìn)行梯度洗脫，得到A1、A23、A4四個(gè)主要成分不同的組分如圖2，其中主要物質(zhì)7號(hào)峰在40%甲醇中被洗脫下來，即組分A2，圖3為A2組分的液相分析

42、圖。圖2 大孔樹脂分離流程圖3甜蕎麩皮經(jīng)大孔樹脂分離后A2組分的HPLC圖由圖3我們可以看出，經(jīng)過大孔樹脂的粗分離，粗提液中的部分主要多酚組分已經(jīng)被分離開，A2組分中的主要成分除了分離目產(chǎn)物7號(hào)峰還有2、6、10號(hào)峰?？梢钥闯鲋挥么罂讟渲瑹o法純化咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷，在下面的實(shí)驗(yàn)中我們將利用聚酰胺樹脂進(jìn)一步使7號(hào)峰得到分離。3.3聚酰胺分離純化將經(jīng)大孔樹脂粗分離得到的組分A2用聚酰胺進(jìn)一步分離純化，分別用水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇和95%甲醇進(jìn)行洗脫，得到B1、B2、B3、B4四個(gè)主要成分的組分，分離過程。目標(biāo)分離產(chǎn)物1-O-咖6-O-吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄

43、主要在水即組分B2中被洗脫下來。B1-B4組分的液相圖分圖5、圖6、圖7和圖8。圖4聚酰胺分離流程圖5 B1組分的HPLC圖圖6 B2組分的HPLC圖圖7 B3組分的HPLC圖圖8 B4組分的HPLC圖由圖5、6、7、8可知， B1組分中主要是峰1、2、4、9等物質(zhì)，B2組分中主要包含目標(biāo)產(chǎn)物7號(hào)峰，B3組分中除了7號(hào)峰，還包含雜質(zhì)峰2、5、6、9，B4組分中主要是保留時(shí)間靠后的一些雜質(zhì)峰。由此可知聚酰胺的分離已進(jìn)步使7號(hào)峰從2、4、5、9號(hào)峰中純化出來，但是B2組分中依然還存在主要的雜質(zhì)峰2，在下面的實(shí)驗(yàn)中我們還需要選擇其他的柱材料使7號(hào)峰咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷得到最終的純化。3.

44、4 Sephadex-LH 20葡聚糖的分離純化經(jīng)大孔樹脂和聚酰胺樹脂純化的B2組分再利用Sephadex-LH 20葡聚糖凝膠進(jìn)一步分離，用水、10%甲醇、30%甲醇和50%甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫流程見圖8。B2組分聚糖分離得到C1、C2、C3三個(gè)主要成分不同的組份，通PLC液相檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷主要出現(xiàn)在水的洗脫液中，即組分C1中，C1組分的液相圖見圖9。圖9 Sephadex-LH 20葡聚糖分離流程圖10 C1組分的HPLC圖如圖10，經(jīng)過Sephadex-LH 20葡聚糖凝膠進(jìn)一步分離，C1組分中的咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷在HPLC中的純度達(dá)到95%

45、以上，已經(jīng)達(dá)到純化。3.5 咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷的抗氧化性分析在上文中分別經(jīng)過大孔樹脂、聚酰胺和Sephadex-LH20葡聚糖的分離純化，我們已經(jīng)將甜蕎麩皮中的咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷成功分離出來。Vito Verardo等人曾在甜蕎中鑒定出咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵是由咖啡酸的羧基以及葡萄糖上的一個(gè)羥基所形成。圖11為咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷和其苷元咖啡酸的結(jié)構(gòu)式。將咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷和咖啡酸進(jìn)行抗氧化性比較，我們可以研究糖苷對(duì)酚酸抗氧化性的影響。 圖11 咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷和咖啡酸的結(jié)構(gòu)圖表3咖啡酸和 咖啡酰

46、吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷抗氧化能力比較樣品 抗氧化能力mmol(Trolox)/mmol(樣品) DPPH值 FRAP值咖啡酸0.643±0.0020.964±0.005咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷0.099±0.010.131±0.003由表3可以看出，DPPH和 FRAP結(jié)果是一致的，咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷的抗氧化性要遠(yuǎn)低于咖啡酸，這說明糖苷會(huì)使酚酸的抗氧化性降低。由于多酚類化合物的抗氧化活性與分子的酚羥基數(shù)量有很大關(guān)系，酚羥基越多，抗氧化性越強(qiáng)，如果咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)式如圖11所示，即咖啡酸中的羥基與糖環(huán)中的羥基

47、形成糖苷鍵，則其抗氧化性應(yīng)不會(huì)與咖啡酸有巨大的區(qū)別。由表3中可以看出，啡酸的抗化性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷，所以我們猜測(cè)純化產(chǎn)物中咖啡酰中酚羥基與糖環(huán)中的羥基形成了糖苷鍵，導(dǎo)致純化產(chǎn)物的抗氧化性遠(yuǎn)低于咖酸。純化產(chǎn)物可能的結(jié)構(gòu)如圖12所示。 圖12 純化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)推測(cè)圖12是根據(jù)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)出的純化產(chǎn)物7號(hào)峰的結(jié)構(gòu)式，由于研究的時(shí)間有限，其具體結(jié)構(gòu)還需在之后的實(shí)驗(yàn)中通過更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒ㄈヲ?yàn)證。4結(jié)論與展望1、甜蕎麩皮的多酚提取物中共鑒定出15種主要成分，其中最主要的組分為咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷。2、多種柱層析方法聯(lián)用分離甜蕎麩皮中的咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷

48、。在大孔樹脂柱層析中目標(biāo)分離產(chǎn)物主要在40%甲醇中被洗脫出來，在聚酰胺和葡聚糖柱層析中目標(biāo)分離產(chǎn)物均在水中被洗脫出來。先后分別經(jīng)過大孔樹脂、聚酰胺和葡聚糖柱層析分離，咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷從甜蕎麩皮多酚中純化出來。3、利用DPPH和FRAP方法對(duì)純化出的咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷和其苷元咖啡酸進(jìn)行抗氧化比較，發(fā)現(xiàn)純化產(chǎn)物的抗氧化性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于咖啡酸，由此推斷純化產(chǎn)物中糖苷鍵是由咖啡酰中的酚羥基與糖環(huán)中的羥基形成的。5參考文獻(xiàn)1李丹,丁霄霖.蕎麥生物活性成分的研究進(jìn)展(2)J.西部糧油科技，2005,7(21): 38-41.2付美云,周立祥.植物多酚在環(huán)境保護(hù)與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用J.用生態(tài)學(xué)報(bào),2004,14(9):1673-1677.3石碧,狄瑩.植物多酚D.北京:科學(xué)出版社,2000,5(13):46-48.4陳曾三.第七營(yíng)養(yǎng)素植物多酚功能性及其開發(fā)利用J.糧食與油脂,2000,9(30):40-42.5Stanislaw Burda,Wieslaw Oleszek,Chang