醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)第03章細胞生物學(xué)研究方法匯總

1、進行初步觀察進行初步觀察形成可驗證的假說形成可驗證的假說設(shè)計對照試驗設(shè)計對照試驗收集資料收集資料解釋結(jié)果解釋結(jié)果作出合理結(jié)論作出合理結(jié)論查閱已查閱已有知識有知識生物學(xué)研究模式生物生物學(xué)研究模式生物不同物種享有共同分子機制不同物種享有共同分子機制l抽象思維與動態(tài)觀點抽象思維與動態(tài)觀點l結(jié)構(gòu)與功能統(tǒng)一的觀點結(jié)構(gòu)與功能統(tǒng)一的觀點l同一性同一性(unity)和多樣性和多樣性(diversity)的問題的問題l細胞生物學(xué)的主要內(nèi)容：細胞生物學(xué)的主要內(nèi)容： 結(jié)構(gòu)與功能（動態(tài)特征）；結(jié)構(gòu)與功能（動態(tài)特征）； 細胞的生命活動細胞的生命活動 ；l實驗科學(xué)與實驗技術(shù)實驗科學(xué)與實驗技術(shù)細胞真知源于實驗室細胞真知源于

2、實驗室 What we know/How we know. 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 細胞組分的分析方法細胞組分的分析方法 細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù) 光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡技術(shù)（light microscopy） 電子顯微鏡技術(shù) (Electro microscopy) 掃描探針顯微鏡（掃描探針顯微鏡（Scanning Probe Microscope） 掃描遂道顯微鏡掃描遂道顯微鏡 (scanning tunneling microscope ) 離心分離技術(shù)離心分離技術(shù) 細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法細胞內(nèi)核酸、蛋

3、白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法 特異蛋白抗原的定位與定性特異蛋白抗原的定位與定性 細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 放射自顯影技術(shù)放射自顯影技術(shù) 定量細胞化學(xué)分析技術(shù)定量細胞化學(xué)分析技術(shù) 細胞的培養(yǎng)細胞的培養(yǎng) 細胞工程細胞工程 普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù) 熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)（Fluorescence Microscopy） 激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（Laser Confocal Microscopy） 相差顯微鏡相差顯微鏡（phase-contrast microscope） 微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡 （different

4、ial interference contrast microscope, DIC） 錄像增差顯微鏡技術(shù)錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhance microscopyvideo-enhance microscopy） 電子顯微鏡的基本知識電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子顯微鏡的基本構(gòu)造 主要電鏡制樣技術(shù)主要電鏡制樣技術(shù)負染色技術(shù)負染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 掃描電鏡掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM） S

5、PM(Scanning probe microscope)Scanning Probe Microscope,SPM (80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器) 包括：包括：STMSTM、AFMAFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如原理：掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如 量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等， 并在計算機顯示出來，從而反映出樣品表面

6、形貌信息、電特性或磁特性等。并在計算機顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。 裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。系統(tǒng)。特點：（特點：（1 1）可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計算，且分辨本領(lǐng)高。）可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計算，且分辨本領(lǐng)高。 （側(cè)分辨率為（側(cè)分辨率為0.10.10.2nm0.2nm，縱分辨率可達，縱分辨率可達0.01nm0.01nm）；）；（2 2）可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；）可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息； （

7、3 3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。（4 4）可連續(xù)成像，進行動態(tài)觀察）可連續(xù)成像，進行動態(tài)觀察用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具, ,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。 光鏡樣本制作光鏡樣本制作分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離原理與應(yīng)用原理與應(yīng)用 直接熒光標記技術(shù)直接熒光標記技術(shù) 間接免疫熒光標記技術(shù)間接免疫熒光標記技術(shù) 在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì) 等生物大分子的定性定位：等生物大分子的

8、定性定位： 如綠色熒光蛋白如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用的應(yīng)用 原理原理應(yīng)用：應(yīng)用：排除焦平面以外光的干擾，增強排除焦平面以外光的干擾，增強 圖像反差和提高分辨率圖像反差和提高分辨率(1.41.7)， 可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)?？芍貥?gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡（相差顯微鏡（phase-contrast microscope）將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細胞將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細胞 微分干涉顯微鏡（微分干涉顯微鏡（differential-interference microscope） 偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上

9、的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成 明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究 活細胞中較大的細胞器活細胞中較大的細胞器錄像增差顯微鏡技術(shù)（錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhance microscopyvideo-enhance microscopy） 計算機輔助的計算機輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活顯微鏡可在高分辨率下研究活 細胞中的顆粒及細胞器的運動細胞中的顆粒及細胞器的運動 顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700） 紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透

10、鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差 超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù) 用于電鏡觀察的樣本制備示意圖用于電鏡觀察的樣本制備示意圖 負染色技術(shù)負染色技術(shù)（Negative staining）與金屬投影）與金屬投影 染色背景，襯托出樣品的精細結(jié)構(gòu)染色背景，襯托出樣品的精細結(jié)構(gòu)冰凍蝕刻技術(shù)（冰凍蝕刻技術(shù)（Freeze etching） （技術(shù)示意圖）（技術(shù)示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒 和膜表面結(jié)構(gòu)。和膜表面結(jié)構(gòu)。

11、 快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quick freeze deep etchingquick freeze deep etching）電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機圖象處理相結(jié)合而形成的電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機圖象處理相結(jié)合而形成的 具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振 分析技術(shù)相結(jié)合，是當前結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合，是當前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（Structural BiologyStructural Biology） 主要研究生物大分子

12、空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實驗手段。主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實驗手段。 原理與應(yīng)用：原理與應(yīng)用：電子電子“探針探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。探測器收集二次電子成象。 CO 2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張 力問題力問題 用途：于分離細胞器與生物大分子及其復(fù)合物用途：于分離細胞器與生物大分子及其復(fù)合物 差速離心差速離心：分離密度不同的細胞組分：分離密度不同的細胞組分 密度梯度離心密度梯度離心：精細組分或生物大分子的分離：精細組分或生物大分子的分離原理原理：利用一些顯色劑與

13、所檢測物質(zhì)中一些：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些 特殊基團特異性結(jié)合的特征，通過顯特殊基團特異性結(jié)合的特征，通過顯 色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來 判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量。判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量。 Feulgen Staining 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)：快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限 （圖）（圖） 蛋白電泳蛋白電泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE) 與免疫印跡反應(yīng)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)(Western-Blot) 免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)：免疫鐵蛋白技術(shù)免疫鐵蛋白技術(shù)

14、免疫酶標技術(shù)免疫酶標技術(shù)免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù) 應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等定位等 光鏡水平的原位雜交技術(shù)光鏡水平的原位雜交技術(shù) （同位素標記或熒光素標記的探針）（同位素標記或熒光素標記的探針） 電鏡水平的原位雜交技術(shù)電鏡水平的原位雜交技術(shù) （生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結(jié)合）（生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結(jié)合） PCR技術(shù)技術(shù) 原理及應(yīng)用：原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對細胞內(nèi)生物

15、大分子進行利用同位素的放射自顯影，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究；定性、定位與半定量研究；實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究。實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究。步驟：步驟：前體物摻入細胞（標記：持續(xù)標記和脈沖標記）前體物摻入細胞（標記：持續(xù)標記和脈沖標記） 放射自顯影放射自顯影 細胞顯微分光光度術(shù)細胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì)利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。 包括：包括： 紫外光顯微分光光度測定

16、法紫外光顯微分光光度測定法 可見光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法 流式細胞儀流式細胞儀（Flow Cytometry）主要應(yīng)用主要應(yīng)用：用于定量測定細胞中的用于定量測定細胞中的DNADNA、RNARNA或某一特異蛋白的含量；或某一特異蛋白的含量；測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量；測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量；從細胞群體中分離某些特異染色的細胞；從細胞群體中分離某些特異染色的細胞；分離分離DNADNA含量不同的中期染色體。含量不同的中期染色體。 動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng) 類型：原代培養(yǎng)細胞（類型：原代培養(yǎng)細胞（primary culture cellprimary culture

17、 cell） 繼代培養(yǎng)細胞（繼代培養(yǎng)細胞（sub-culture cellsub-culture cell） 細胞株（細胞株（cell straincell strain） 正常二倍體，接觸抑制正常二倍體，接觸抑制 細胞系（細胞系（cell linecell line） 亞二倍體，接觸抑制喪失亞二倍體，接觸抑制喪失植物細胞植物細胞 類型類型： 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) （體細胞培養(yǎng)）（體細胞培養(yǎng)） 單倍體細胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）單倍體細胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)） 非細胞體系（非細胞體系（cell-free systemcell-free system） 細胞融合（細胞融合（cell fusion）與細胞雜

18、交（）與細胞雜交（cell hybridization）技術(shù)）技術(shù)單克隆抗體（單克隆抗體（monoclone antibodymonoclone antibody）技術(shù)）技術(shù) 圖圖細胞拆合與顯微操作技術(shù)細胞拆合與顯微操作技術(shù)物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)( (圖圖1 1、圖、圖2)2)化學(xué)法結(jié)合離心技術(shù)化學(xué)法結(jié)合離心技術(shù)制備核體（制備核體（karyoplastkaryoplast）和胞質(zhì)體（）和胞質(zhì)體（cytoplastcytoplast）。）。 其它技術(shù)其它技術(shù) 遺傳分析（遺傳分析（mutant, knock out, knock in） 對細胞生命活動的研究成為當今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸對細胞生命活動的研究成為當今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸細胞生命活動突變體分析突變體分析蛋白修飾分析基因表達多肽定性分析生物信息學(xué)序列測定雙向電泳分析DNA分離與克隆機器人技術(shù) (robotics) 功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)分離與制備 蛋白質(zhì)組學(xué)A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM.a)under bright-field;b)phase-co