第二章,光譜分析儀器與技術(shù)

1、第二章 光譜分析儀器與技術(shù)錢士勻錢士勻目 錄第一節(jié)第一節(jié) 吸收光譜分析儀器與技術(shù)吸收光譜分析儀器與技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 發(fā)射光譜分析儀器與技術(shù)發(fā)射光譜分析儀器與技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 散射光譜分析儀器與技術(shù)散射光譜分析儀器與技術(shù)重點提示1. 光的基本性質(zhì)和朗伯-比爾定律的意義是什么？2. 光譜分析技術(shù)如何分類，各有哪些技術(shù)特征？3. 紫外-可見分光光度計按其光學(xué)系統(tǒng)可分為哪幾類，各有何特點？4. 原子吸收分光光度計的結(jié)構(gòu)組成及影響測定靈敏度和精確度的因素有哪些？5. 簡述原子發(fā)射光譜分析的特點及其局限性。6. 熒光光譜儀的種類和基本結(jié)構(gòu)有哪些？影響熒光強度的因素有哪些？7. 散射光譜技術(shù)分析方法有哪兩類

2、？簡述其檢測原理。8. 根據(jù)雷萊光散射理論，散射光強度主要與哪些因素有關(guān)？光譜分析技術(shù) 光譜分析技術(shù)是利用物質(zhì)具有發(fā)射光譜、吸收光譜或散射光譜的特征，對物質(zhì)進行定性、定量分析的一類分析方法。 光譜分析依據(jù)光譜特征可分為吸收光譜分析技術(shù)、發(fā)射光譜分析技術(shù)和散射光譜分析技術(shù)三大類。 光譜分析技術(shù)在生物化學(xué)檢驗中是最基本和最常用的，它因具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡便、選擇性好等特點而被廣泛使用。第一節(jié) 吸收光譜分析儀器與技術(shù)一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)（一）光的基本性質(zhì) 光是一種電磁波，具有波動性和粒子性。 光的波長可用納米（nm）為單位來表示。 E = h（二）光的選擇吸收與物質(zhì)顏色的關(guān)系 物

3、質(zhì)的分子或離子團對可見和紫外光區(qū)的光波具有選擇吸收作用。 可見光譜分析要求被測溶液的顏色與所用的單色光互補，以求達到溶液對光的最大吸收。：不同不同的物質(zhì)會吸收不同波長的光。改變?nèi)肷涔獾奈镔|(zhì)會吸收不同波長的光。改變?nèi)肷涔獾牟ㄩL，并依次記錄物質(zhì)對不同波長光的的波長，并依次記錄物質(zhì)對不同波長光的吸收程度，就得到該物質(zhì)的吸收程度，就得到該物質(zhì)的吸收光譜吸收光譜 。 第一節(jié) 紫外-可見分光光度計 的工作原理和基本結(jié)構(gòu)各種試液的紫外掃描圖譜 A一葛根素；B空白微乳；c一空白腸循環(huán)液；D一酚紅吸收光譜：又名吸收曲線。不同波長光對樣品作用不同，吸收強度不同 以A（波長做橫坐標(biāo)，吸光度做縱坐標(biāo)）作圖一、紫外-可

4、見分光光度分析儀器與技術(shù)（三）紫外（三）紫外- -可見分光光度技術(shù)可見分光光度技術(shù) 紫外光（200400nm），可見光（400780nm） 1. 1.朗伯朗伯- -比爾定律比爾定律 一束單色光通過物質(zhì)溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度及液層厚度的乘積成正比。 A = KCb A為吸光度；K為比例系數(shù)；C為吸光物質(zhì)的濃度；b為溶液的液層厚度。 當(dāng)K、C一定時，吸光度A與液層厚度b成正比，稱為朗伯定律（Lambert定律）； 當(dāng)K、b一定時，吸光度A與溶液濃度C成正比，稱為比爾定律（Beer定律）。一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)1.1.朗伯朗伯- -比爾定律比爾定律（1）吸光度：吸光度表示單色

5、光通過溶液時被吸收的程度，以A表示。（2）透光度：透光度又稱為透光率，表示透過光占入射光的比例，以T表示。 吸光度與透光度之間的關(guān)系：A = log =logT（3）比例系數(shù)K：K值表示單位濃度、單位液層厚度溶液的吸光度，是與吸光物質(zhì)性質(zhì)及入射光波長有關(guān)的常數(shù)。K值的表示方法依賴于溶液濃度的表示方法。 吸收系數(shù)a、摩爾吸收系數(shù) 、百分吸收系數(shù)。 一、紫外一、紫外-可見分光光度計的工作原理可見分光光度計的工作原理 kbcIIT100J朗伯-比爾定律：I0：入射光強度b:液層厚度T:透光度k:吸光系數(shù)kbcTIIIITA1lglglglg00C:溶液濃度I:透射光強度A:吸光度一、紫外-可見分光光

6、度分析儀器與技術(shù)2.2.定量分析的方法定量分析的方法（1）直接比較法：分別測出試樣溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度Ax及As，進行比較可求得樣品的濃度。 Cx = Ax CsAs （2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)2.2.定量分析的方法定量分析的方法（3）摩爾吸光系數(shù)（=K）檢測法： 在給定條件（單色光波長、溶劑、溫度等）下，吸光系數(shù)是表示物質(zhì)特性的常數(shù)。根據(jù)朗伯-比爾定律，可以用C = A/ b公式直接計算物質(zhì)的含量。（4）雙波長分光光度法（補充）： 當(dāng)吸收光譜相互重疊的兩種組分共存時，利用雙波長分光光度法可對單個組分進行測定或同時對兩個組分進行分析。1、朗伯朗伯- -比爾定律比爾

7、定律 ： A = KCb 2 2、吸光度與透光度：、吸光度與透光度：A = log =logTA：吸光度； I。：入射光的強度； I1：透射光的強度； T：透射比，或稱透光度； K：系數(shù)，可以是吸收系數(shù)或摩爾吸收系數(shù)b：吸收介質(zhì)的厚度，一般以cm為單位； C：吸光物質(zhì)的濃度，單位可以是g/L 或mol/L。3、 直接比較法（有標(biāo)準(zhǔn)溶液時）：直接比較法（有標(biāo)準(zhǔn)溶液時）：Cx = Ax CsAs4 4、摩爾吸光系數(shù)（、摩爾吸光系數(shù)（ ）檢測法（）檢測法（在給定條件（單色光波長、溶劑、溫度等）下）：）： C = A/ b5 5、吸光系數(shù)K:(Akbc) (1) k與入射波長、溶液的性質(zhì)以及溫度有關(guān)。

8、吸收物質(zhì)在特定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)；不隨濃度c 和光程長度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，k僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)；入射光入射光 I0透射光透射光 It（2）是物質(zhì)吸光能力的量度，可作為定性鑒定的參數(shù)；同一物質(zhì)在不同波長下的 k 值是不同的。在最大吸收波長max處的摩爾吸光系數(shù)，常以 kmax表示。K max表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達到的最大靈敏度。 kmax越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強，用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。 （3）k在數(shù)值上等于單位濃度為、單位液層厚度為時特定溶液在某一波長下的吸光度。濃度單位不同：吸收系數(shù)a、摩爾吸收系

9、數(shù) 、百分吸收系數(shù)一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)（四）（四）紫外紫外- -可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)1.1.光源光源 可見光區(qū)：可見光區(qū)：鎢燈、鹵鎢燈光源鎢燈、鹵鎢燈光源，波長范圍在，波長范圍在3203202500nm2500nm。紫外區(qū)：紫外區(qū)：氫、氘燈氫、氘燈光源，波長光源，波長185185400nm400nm。一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)（四）紫外（四）紫外- -可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu) 2. 單色器 將來自光源的復(fù)合光分解為單色光并分離出所需波段光束的光學(xué)裝置，由棱鏡或光柵、狹縫和準(zhǔn)直鏡等部分組成。 常用單色器：棱鏡、干涉濾光

10、片、光柵分光。 3. 吸收池 分光光度計中用來盛放溶液的容器，又稱比色皿或比色杯。 多用石英比色杯，適用于紫外和可見光區(qū)；玻璃比色杯只能用于可見光區(qū)。自動生化分析儀多用塑料比色杯。一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)（五）紫外（五）紫外- -可見分光光度計的類型可見分光光度計的類型1.單光束分光光度計 （1）單光束可見光分光光度計1. 光源；2. 聚光透鏡；3. 色散棱鏡；4. 準(zhǔn)直鏡；5. 保護玻璃；6. 狹縫；7. 反射鏡；8. 光柵；9. 聚光透鏡；10. 吸收池；11.光門；12.保護玻璃；13.光電倍增管一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)（五）紫外（五）紫外- -可見分光光度計的類

11、型可見分光光度計的類型1.單光束分光光度計 單光束紫外-可見分光光度計一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)（五）紫外（五）紫外- -可見分光光度計的類型可見分光光度計的類型 2. 雙光束分光光度計一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)（五）紫外（五）紫外- -可見分光光度計的類型可見分光光度計的類型 3. 雙波長分光光度計一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)（六）（六）分光光度計分析條件的選擇分光光度計分析條件的選擇1.1.入射光波長的選擇入射光波長的選擇 選擇最強吸收帶的最大吸收波長（max）的單色光為入射光，以得到最大的測量靈敏度。 當(dāng)最強吸收峰的峰形比較尖銳時，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦

12、的次強峰或肩峰進行測定。 2 2吸光度范圍的選擇吸光度范圍的選擇 選擇適宜的吸光度范圍，以保證測量結(jié)果的誤差最小。 吸光度范圍為0.12.0時，測定結(jié)果的相對誤差最小。一、紫外-可見分光光度分析儀器與技術(shù)（六）分光光度計分析條件的選擇（六）分光光度計分析條件的選擇 3 3. . 狹縫寬度的選擇狹縫寬度的選擇 狹縫寬度影響測定的靈敏度和校準(zhǔn)曲線的線性范圍。 狹縫寬度增大，入射光的單色性降低，會使靈敏度下降，校準(zhǔn)曲線偏離朗伯-比爾定律。 狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的1/10。 4. 4. 顯色反應(yīng)條件的選擇顯色反應(yīng)條件的選擇 反應(yīng)的生成物的摩爾吸光系數(shù)較大； 反應(yīng)應(yīng)有較高的選擇性； 反應(yīng)生成物

13、有足夠的穩(wěn)定性； 反應(yīng)生成物的組成恒定。二、原子吸收分光光度分析儀器與技術(shù)（一）原子吸收分光光度法原理（一）原子吸收分光光度法原理 E=E2El=h 式中：E為能級差；E2、E1分別為高、低能級的能量；h為普朗克常數(shù)；為吸收光的頻率。 電子從低能級躍遷到高能級時，需要吸收特定波長的光。 用特定波長的光去照射待測元素，待測元素就會吸收一部分光能而被激發(fā)，使得入射光變?nèi)?、變暗，如同溶液對單色光的吸收?利用光電檢測器檢測出入射光線的強度變化即待測元素的吸光度，根據(jù)朗伯-比爾定律，得到待測元素的濃度。二、原子吸收分光光度分析儀器與技術(shù)（二）原子吸收分光光度計的基本結(jié)構(gòu)（二）原子吸收分光光度計的基本結(jié)

14、構(gòu)1600條譜線二、原子吸收分光光度分析儀器與技術(shù)（二）原子吸收分光光度計的（二）原子吸收分光光度計的基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu) 1 1光源光源 能夠產(chǎn)生待測元素所需的特征線性光譜，譜線的寬度要窄，發(fā)射強度要高，還要十分穩(wěn)定。 常用的光源為空心陰極燈。 2 2原子化器原子化器 提供合適的能量，將樣品干燥、蒸發(fā)并轉(zhuǎn)化為所需的基態(tài)原子蒸氣。 原子化器有火焰原子化器與石墨爐原子化器。二、原子吸收分光光度分析儀器與技術(shù)（二）原子吸收分光光度計的（二）原子吸收分光光度計的基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu) 3 3分光系統(tǒng)（單色器）分光系統(tǒng)（單色器） 單色器由入射和出射狹縫、反射鏡和色散元件等組成， 作用是將所需的共振吸收線與鄰近干

15、擾線分離。 4 4檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 由檢測器、放大器、對數(shù)變換器和顯示裝置組成。 檢測器的作用是進行光電信號轉(zhuǎn)換變成電信號，然后再經(jīng)放大，濾波后，被測信號進行對數(shù)變換，變成線性信號，最后由讀出裝置顯示讀數(shù)或由記錄儀記錄下來。二、原子吸收分光光度分析儀器與技術(shù)（三）原子分光光度計分析條件的選擇（三）原子分光光度計分析條件的選擇 1 1吸收波長吸收波長 選擇元素的共振線作為分析線； 分析濃度較高的樣品時，可選擇靈敏度較低的譜線進行分析； 有些元素的共振線靠近遠紫外區(qū)，最好用背景吸收校正法扣除背景吸收，若濃度較高，可改用次靈敏線作為分析線。 2 2燈電流燈電流 在所選的電流下，光源能夠提供足夠強和穩(wěn)

16、定的入射譜線，以提高信噪比和測定精確度；同時，還要有較高的測定靈敏度。二、原子吸收分光光度分析儀器與技術(shù)（三）原子分光光度計分析條件的選擇（三）原子分光光度計分析條件的選擇 3 3狹縫的寬度狹縫的寬度 狹縫寬度的選擇應(yīng)以能分開分析線與鄰近線為原則。 4 4燃燒器的高度燃燒器的高度 必須使測量光束從自由原子濃度最大的火焰區(qū)域通過。 5 5霧化器的調(diào)節(jié)霧化器的調(diào)節(jié) 一般約4ml/min的進樣量是比較合適的。第二節(jié) 發(fā)射光譜分析儀器與技術(shù)一、原子發(fā)射光譜分析儀器與技術(shù)（一）原子發(fā)射光譜分析基本工作原理（一）原子發(fā)射光譜分析基本工作原理 當(dāng)原子受到外界能量的作用時，原子由于與高速運動的氣態(tài)粒子和電子相

17、互碰撞而獲得了能量，使原子中外層電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，使樣品蒸發(fā)并將各組分轉(zhuǎn)變成氣態(tài)原子或離子，引起氣體中各基本粒子的電激發(fā)。 被激發(fā)的原子或離子回到基態(tài)時發(fā)射出每個元素的特征譜線。 研究特征譜線的波長和強度就可以對被測樣品進行定性和定量分析。 原子發(fā)射光譜分析對一個試樣既能同時進行多元素分析，又可測定元素各種不同的含量（高、中、微含量）。具有分析速度快，選擇性、準(zhǔn)確性高，檢出限低，樣品消耗少等優(yōu)點。一、原子發(fā)射光譜分析儀器與技術(shù)（二）原子發(fā)射光譜分析儀器（二）原子發(fā)射光譜分析儀器1.1. 儀器基本結(jié)構(gòu)儀器基本結(jié)構(gòu) 原子發(fā)射光譜儀由激發(fā)光源和光譜儀兩部分組成。 （1 1）激發(fā)光源：）激發(fā)光源

18、： 提供使試樣中被測元素原子化和原子激發(fā)發(fā)光所需要的能量，使樣品蒸發(fā)、原子化、激發(fā)，產(chǎn)生光譜。 常用火花式與電感耦合等離子體兩種方式。 （2 2）光譜儀：）光譜儀： 常用的光譜儀有棱鏡攝譜儀、光柵攝譜儀和光電直讀光譜儀。 光譜儀的作用是將光源發(fā)射的電磁輻射色散后，得到按波長順序排列的光譜，并對不同波長的輻射進行檢測與記錄。一、原子發(fā)射光譜分析儀器與技術(shù)2. 2. 原子發(fā)射光譜分析方法原子發(fā)射光譜分析方法 （1 1）定性定性分析方法分析方法 元素的特征譜線波長是由元素的原子性質(zhì)所決定的。 通過檢查譜圖上有無特征譜線的出現(xiàn)來確定該元素是否存在。（2 2）定量定量分析方法：分析方法： 根據(jù)樣品中被測

19、元素的譜線強度來確定其元素含量的方法。 元素的譜線強度與該元素在試樣中濃度c的相互關(guān)系： I=acI=acb b 式中：I為被測元素譜線強度；a是與樣品的蒸發(fā)、激發(fā)過程和樣品組成等有關(guān)的一個參數(shù)；c為被測元素的濃度；b為自吸系數(shù)，其數(shù)值與譜線的自吸有關(guān)。一、原子發(fā)射光譜分析儀器與技術(shù)（三）原子發(fā)射光譜分析的干擾與處理（三）原子發(fā)射光譜分析的干擾與處理 基體效應(yīng)是其他元素的存在影響被測元素譜線強度的干擾作用。 樣品組成越復(fù)雜，基體效應(yīng)越明顯，分析誤差越大。 向樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品中加入經(jīng)過選擇的輔助物質(zhì)，如光譜緩沖劑或光譜載體，以消除或減少基體干擾。 光譜緩沖劑可稀釋樣品，能控制樣品在弧焰中蒸發(fā)、激發(fā)

20、的溫度和降低背景影響。 光譜緩沖劑純度要高，譜線簡單。按所起的作用不同。 光譜載體的作用是改變樣品中被測元素的熔點、沸點，從而改變各元素的蒸發(fā)狀況，起到增強被測元素譜線強度或抑制干擾元素譜線強度等作用，提高分析的靈敏度。二、熒光分析儀器與技術(shù)（一）熒光分析工作原理（一）熒光分析工作原理 物質(zhì)經(jīng)高能量射線激發(fā)后，所發(fā)出的比原激發(fā)光波長較長的可見光稱為熒光。 某些物質(zhì)受到紫外光照射后，發(fā)射出比吸收的紫外光波長更長或相等的紫外光熒光或可見光熒光。 通過測定物質(zhì)分子產(chǎn)生的熒光強度進行分析的方法稱為熒光分析。 熒光分析可應(yīng)用于物質(zhì)的定性檢測及定量分析。 熒光法的主要特點是靈敏度高，檢出限為10-710-

21、9g/ml。 熒光法的選擇性強。 熒光法樣品用量少、操作簡便。二、熒光分析儀器與技術(shù)（二）熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)（二）熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu) 激發(fā)單色器中的激發(fā)光，投射到樣品上。樣品杯里的熒光物質(zhì)被激發(fā)而發(fā)出熒光光譜。熒光光譜投射到光電檢測器上。光電檢測器將熒光強度轉(zhuǎn)換成電信號，信號強度與物質(zhì)濃度的成正比。1.1. 激發(fā)光源激發(fā)光源 激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，通常用氙燈、汞燈、氙-汞弧燈、激光器及閃光燈等。 2. 2. 單色器單色器 分為激發(fā)單色器和發(fā)射單色器，分別將入射的激發(fā)光和發(fā)射的熒光變成單色光。二、熒光分析儀器與技術(shù)（二）熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)（二）熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)二、熒光分析儀器與技術(shù)（三

22、）分子熒光定量分析方法（三）分子熒光定量分析方法 分子熒光定量分析方法與紫外-可見分光光度法相同，也是采用直接比較法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法。1. 直接比較法 C Cx x = = C Cs s 式中：Cx為待測樣品溶液的濃度；Cs為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；Fx為待測樣品溶液的熒光強度；Fs為標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強度。 2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強度。以熒光強度為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定待測樣品的熒光強度，由樣品的熒光強度和標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品中熒光物質(zhì)的含量。二、熒光分析儀器與技術(shù)（四）影響熒光強度的因素（四）影響熒光強度的因素1.1.

23、 溶劑的影響溶劑的影響 熒光強度在一定范圍內(nèi)可隨溶劑黏度的減小而減小。 溶劑和熒光物質(zhì)反應(yīng)，會使熒光峰的波長和熒光強度改變。 溶劑中的雜質(zhì)會影響熒光光譜。 2. 2. 溫度溫度的影響的影響 熒光強度對溫度變化敏感。溫度增加，熒光效率和熒光強度會明顯降低。 3. 3. pHpH的影響的影響 pH影響熒光物質(zhì)的存在形式。 苯胺在pH 712的溶液中以分子形式存在發(fā)射藍色熒光。 在pH2和pH13的溶液中呈苯胺離子形式不能發(fā)射熒光。二、熒光分析儀器與技術(shù)（四）影響熒光強度的因素（四）影響熒光強度的因素。 4. 4. 熒光淬滅熒光淬滅 熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強度降低，或

24、熒光強度不與濃度成線性關(guān)系的現(xiàn)象。 熒光熄滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物等均為常見的熒光熄滅劑。 5. 5. 其他干擾因素其他干擾因素 光散射可以影響熒光強度； 洗滌器皿的合成去污劑常能產(chǎn)生很強的熒光； 玻璃器皿所使用的潤滑油也能產(chǎn)生較強熒光。第三節(jié) 散射光譜分析儀器與技術(shù)一、散射光譜技術(shù)基本原理 光的散射光的散射 光在媒質(zhì)中傳播的過程中，不完全沿著原來的方向傳播，沿著四面八方或多或少都有光線存在的現(xiàn)象。 散射光譜分析散射光譜分析 測定光線通過溶液后的光吸收或光散射程度的一類免疫濁度定量分析方法。 測定方式測定方式 分為散射免疫比濁法和透射免疫比濁法。 按照形成

25、復(fù)合物的速度測定按照形成復(fù)合物的速度測定 可分為終點濁度法和速率濁度法。一、散射光譜技術(shù)基本原理透射法散射法雷萊散射（瑞利）米-德拜散射一、散射光譜技術(shù)基本原理（一）濁度分析的基本原理（一）濁度分析的基本原理 1 1膠體溶液膠體溶液 指一定大小的固體顆?；蚋叻肿踊衔锓稚⒃谌苊街兴纬傻娜芤海滟|(zhì)點一般在1100nm之間。 2 2朗伯朗伯- -比爾光透射理論比爾光透射理論 E= KC 式中：E為吸光度變化率； K為常數(shù)；C為溶液的濃度。一、散射光譜技術(shù)基本原理（一）濁度分析的基本原理（一）濁度分析的基本原理 3 3雷萊（雷萊（RayleighRayleigh）光散射理論）光散射理論 粒子尺度遠

26、小于入射光波長時（小于波長的十分之一）。 式中：I0為入射光強度；為入射光波長；n1、n2為分散介質(zhì)和分散相的折射率；為單位體積內(nèi)的粒子數(shù)；V為單個粒子的體積。一、散射光譜技術(shù)基本原理（一）濁度分析的基本原理（一）濁度分析的基本原理 3 3雷萊（雷萊（RayleighRayleigh）光散射理論）光散射理論 （1）單位體積的散射光強度與每個粒子體積的平方成正比。 （2）散射光總能量與入射光波長的四次方成反比。入射光波長愈短，散射愈顯著（藍光）。 （3）分散相與分散介質(zhì)的折射率相差愈顯著，則散射作用亦愈顯著。 （4）散射光強度與單位體積中的粒子數(shù)成正比。 公式僅適用于稀釋溶液，微粒直徑約為入射光

27、波長的1/201/10的溶液。一、散射光譜技術(shù)基本原理（一）濁度分析的基本原理（一）濁度分析的基本原理 4. 4. 米米- -德拜（德拜（Mie-DebyeMie-Debye）散射理論）散射理論 當(dāng)粒子直徑與入射光波長的比例大于1/10值時，各方向散射光的強度成為不對稱或各向異性的了，此時正向散射光強度趨于增強。 式中為光信號檢測器與入射光之間的夾角。表明檢測器的位置與被測光信號的性質(zhì)及強度之間的關(guān)系。 米-德拜公式適合于粒子直徑略小于入射光波長的情況，和粒徑等于或大于入射光波長的場合。這些修正反映了散射光的不對稱性與粒子大小及入射光波長之間的相關(guān)性變化。一、散射光譜技術(shù)基本原理（二）濁度分析

28、的基本方法（二）濁度分析的基本方法 透射免疫比濁法檢測器的與光源呈直線測定透射光強度和被測溶液中微粒濃度關(guān)系。 散射免疫比濁法檢測器在596角的方向上測量散射光強度和被測溶液中微粒濃度關(guān)系。一、散射光譜技術(shù)基本原理（二）濁度分析的基本方法（二）濁度分析的基本方法 1. 1.透射免疫比濁法透射免疫比濁法 測定入射光因反射、散射或吸收后的衰減，讀數(shù)以吸光度（A）表示，這種A值反映了透射光和入射光的比率。免疫復(fù)合物大小為35100nm之間，選擇290410nm波長最佳。加入促聚劑，如4%聚乙二醇（MW 60008000Da）可使復(fù)合物的形成在310分鐘內(nèi)完成。透射免疫比濁法可分為沉淀反應(yīng)透射免疫濁度

29、測定和免疫膠乳濁度測定?？乖贵w形成抗原-抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計算出未知蛋白質(zhì)的含量。透射免疫比濁法 靈敏度較低。要求抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大、足夠多，分子太小則入射光直接通過。加增敏劑。 直線光路，靈敏度有先天缺陷。設(shè)計散射比濁。 透射比濁是依據(jù)透射光減弱的原理來定量的，因此只能測定抗原抗體反應(yīng)的第二階段，檢測仍需抗原抗體溫育反應(yīng)時間，檢測時間較長。缺陷缺陷一、散射光譜技術(shù)基本原理（二）濁度分析的基本方法（二）濁度分析的基本方法 2 2散射免疫比濁法散射免疫比濁法 光源從水平軸照射，通過溶液時，遇到抗原-抗體復(fù)合物粒子，光線被粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)形成光

30、散射。偏轉(zhuǎn)角度可以從096，偏轉(zhuǎn)的角度可因光線波長和粒子大小不同而有所區(qū)別。散射光的強度與抗原-抗體復(fù)合物的含量、散射夾角成正比，波長成反比。二、常用濁度法分析儀器（一）（一）透射濁度分析儀透射濁度分析儀 1 1分光光度儀分光光度儀 普通分光光度儀可用于透射比濁分析，待測溶液在近紫外光區(qū)（400500nm）有一吸收峰，終點法可獲得定量數(shù)據(jù)（A值）。 2 2自動生化分析儀自動生化分析儀 臨床實驗室的自動生化分析儀一般均可用于濁度測定。（二）（二）散射濁度分析儀散射濁度分析儀1. 速率法散射濁度分析儀2. 終點法散射濁度分析儀散射免疫比濁法散射免疫比濁法速率散射比濁分析基本原理： 抗原抗體結(jié)合反應(yīng)

31、的一種動態(tài)測定法，適時檢測抗原抗體復(fù)合物形成的散射光信號。是測定抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動態(tài)過程。 所謂速率，是在單位時間內(nèi)抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速度。將各單位時間內(nèi)形成復(fù)合物的速率及測定的散射信號連接在一起，即是動態(tài)的速率比濁分析。 當(dāng)儀器測定到某一時間內(nèi)形成速率下降時，即出現(xiàn)速率峰，該峰值的高低，即代表所測抗原的量。 速率峰值一般在25秒時出現(xiàn)。 在反應(yīng)介質(zhì)中加入一定量的促凝劑，可加速抗原抗體復(fù)合物的形成，以減少反應(yīng)時間。 速率法的優(yōu)點：是快速、不需要減去樣本和試劑本底讀數(shù)，校正結(jié)果也較穩(wěn)定。免疫比濁技術(shù)分類按光路透射免疫比濁散射免疫比濁按測定時間終點比濁速率比濁按增敏劑無增敏PEG增敏膠乳增

32、敏本章小結(jié) 根據(jù)光譜來鑒別物質(zhì)和確定它的化學(xué)組成的方法叫做光譜分析技術(shù)。 依據(jù)光譜特征可分為吸收光譜分析技術(shù)、發(fā)射光譜分析技術(shù)和散射光譜分析技術(shù)三大類。 原子光譜法有：原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法及原子熒光光譜法等。 分子光譜法有：紫外-可見分光光度法、紅外光譜法、分子熒光光譜法和分子磷光光譜法等。 紫外-可見分光光度計是醫(yī)學(xué)實驗室的重要儀器，郎伯-比爾定律是比色分析的基本定律。本章小結(jié) 原子光譜分析儀器包括原子吸收和原子發(fā)射光譜分析儀，儀器基本結(jié)構(gòu)包括光源、原子化器、分光系統(tǒng)及檢測系統(tǒng)。 熒光光譜分析儀器是利用物質(zhì)吸收能量后可發(fā)射熒光，通過測定物質(zhì)分子產(chǎn)生的熒光強度進行物質(zhì)定性與定量的儀器

33、。 散射光譜分析技術(shù)主要有透射免疫比濁分析和散射免疫比濁分析兩種，其中速率測定和膠乳粒子增敏是散射比濁分析的發(fā)展方向。原子吸收與普通分光光度法的差別原子吸收與普通分光光度法的差別普通分光光度法原子吸收光譜分子或離子團的吸收分子或離子團的吸收基態(tài)原子的吸收基態(tài)原子的吸收溶液溶液基態(tài)原子蒸氣基態(tài)原子蒸氣寬帶吸收寬帶吸收(幾幾十幾幾十nm)窄帶吸收窄帶吸收(0.00Xnm)連續(xù)光源連續(xù)光源銳線光源銳線光源低分辨率單色器低分辨率單色器高分辨率單色器高分辨率單色器 吸收池吸收池原子化器原子化器+很好很好好好（+ +）尚可）尚可差；很差差；很差原子吸收（AAS）原子熒光（AFS）原子發(fā)射（AES)火焰法電

34、熱法 火焰法 電熱法ICP電弧法檢出限+精密度+（+） +（+）+準(zhǔn)確度+樣品用量+（+）+多元素分析（+） （+）+分析線性范圍（） （） （+） （+）+（+）操作簡單性+設(shè)備費用+（+） +（+）（+）1.1.在分光光度計中，常因波長不同而選用不同的檢在分光光度計中，常因波長不同而選用不同的檢測器，下面兩種檢測器各適用于哪個光區(qū)？測器，下面兩種檢測器各適用于哪個光區(qū)？A.A.光電倍增管用于（光電倍增管用于（ 可見紫外可見紫外） B.B.熱電偶用于（熱電偶用于（ 紅外紅外 ）（首都師范大學(xué)（首都師范大學(xué)19991999年）年）2.2.原子吸收分析法與發(fā)射光譜分析法，其共同點都原子吸收分析法

35、與發(fā)射光譜分析法，其共同點都是利用是利用_ _原子外層電子發(fā)生能級躍遷產(chǎn)生的光譜現(xiàn)原子外層電子發(fā)生能級躍遷產(chǎn)生的光譜現(xiàn)象象_ _，在本質(zhì)上有區(qū)別，前者利用的是，在本質(zhì)上有區(qū)別，前者利用的是_ _ _ _現(xiàn)象，現(xiàn)象，后者利用的是后者利用的是_現(xiàn)象?，F(xiàn)象。（首都師范大學(xué)（首都師范大學(xué)20012001年）年）考考 研研 真真 題題3.3.原子吸收法測量時，要求發(fā)射線與吸收線的原子吸收法測量時，要求發(fā)射線與吸收線的 一致，且發(fā)射線與吸收線相比，譜線半寬要一致，且發(fā)射線與吸收線相比，譜線半寬要 得多。產(chǎn)生這種發(fā)射線的光源，通常是得多。產(chǎn)生這種發(fā)射線的光源，通常是 4.4.熒光分光光度計通常具有兩個單色器

36、，其中，一熒光分光光度計通常具有兩個單色器，其中，一個 稱個 稱 ， 其 作 用 是， 其 作 用 是 ； 另 一 個 稱； 另 一 個 稱 ，其作用是，其作用是 。5.5.雙光束原子吸收分光光度計由于兩光束是由雙光束原子吸收分光光度計由于兩光束是由 光源發(fā)出，并且使用光源發(fā)出，并且使用 器，因此消除了器，因此消除了 的影響，但不能消除的影響，但不能消除 的影響。的影響。（鄭州大學(xué)（鄭州大學(xué)20022002年）年）6.6.用原子吸光光譜法測定銫時用原子吸光光譜法測定銫時, ,加入加入1%1%鉀鹽溶液鉀鹽溶液, ,其作其作用是用是( )( )A A減小背景減小背景 B B釋放劑釋放劑 C C消電

37、離劑消電離劑 D D提高火焰溫度提高火焰溫度（南開大學(xué)（南開大學(xué)20012001年）年）7.7.在原子吸收光譜法中，對光源進行調(diào)制的目的是（在原子吸收光譜法中，對光源進行調(diào)制的目的是（ ）A A校正背景干擾校正背景干擾 B B消除物理干擾消除物理干擾 C C消除原子化器的發(fā)射干擾消除原子化器的發(fā)射干擾 D D消除電離干擾消除電離干擾（南開大學(xué)（南開大學(xué)20022002年）年）8.8.原子吸收法測定鈉時，常加入原子吸收法測定鈉時，常加入1%1%的鉀鹽溶液，其作的鉀鹽溶液，其作用是（用是（ ）A.A.釋放劑釋放劑 B.B.消電離劑消電離劑 C.C.提高火焰溫度提高火焰溫度 D.D.減少背景減少背景9.9.原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜和原子熒光光譜三者原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜和原子熒光光譜三者共同之處（共同之處（ ）（多選）（多選）A.A.都是原子光譜都是原子光譜 B.B.都涉及原子外層價電子躍遷都涉及原子外層價電子躍遷C.C.都是無機物金屬元素分析都是無機物金屬元素分析 D.D.都具備多元素同時測定能力都具備多元素同時測