第10章—液相色譜法

1、注：自帶護膚品（高效液相色譜法）注：自帶護膚品（高效液相色譜法）離子色譜法離子色譜法1月月6日日(星期日星期日)補補1月月3日（星期四）的課程日（星期四）的課程 第十章第十章 高效液相色譜法高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography, HPLC一、一、HPLC概述概述二、高效液相色譜儀二、高效液相色譜儀三、高效液相色譜法的類型三、高效液相色譜法的類型一、高效液相色譜法概述一、高效液相色譜法概述n氣相色譜：氣相色譜：流動相為氣體流動相為氣體n液相色譜：液相色譜：流動相為液體，流動相為液體，70年代以后，在高壓下輸送流動相，年代以后，在高壓下輸送流動

2、相，稱之為高效液相色譜（高壓液相色譜），簡稱為稱之為高效液相色譜（高壓液相色譜），簡稱為HPLC。主要差別：主要差別：n分析對象差別分析對象差別GC（20）：）：能氣化、熱穩(wěn)定性好且沸點較低的樣品，能氣化、熱穩(wěn)定性好且沸點較低的樣品，HPLC（80）：）：溶解后能制成溶液的樣品，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)溶解后能制成溶液的樣品，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測定性差及高分子和離子型樣品均可檢測n流動相差別流動相差別 GC：流動相為惰性氣體；組分與流動相無作用力，只與固定相作用流動相為惰性氣體；組分與流動相無作用力，只與固定相作用 HPLC：流動相為液體（種類多，另可選用不同

3、比例的多種液體作為流流動相為液體（種類多，另可選用不同比例的多種液體作為流動相）；流動相與組分間有親合作用力，柱選擇性好、分離效果佳動相）；流動相與組分間有親合作用力，柱選擇性好、分離效果佳n操作條件差別操作條件差別 GC：加溫操作加溫操作 HPLC：室溫；高壓室溫；高壓二、高效液相色譜儀二、高效液相色譜儀高效液相色譜儀簡單流程圖高效液相色譜儀簡單流程圖2.1 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)n貯液器：貯液器：貯存流動相，由玻璃、不銹鋼或氟塑料作成（貯存流動相，由玻璃、不銹鋼或氟塑料作成（0.52L）n高壓泵高壓泵： 作用：將貯液器中的流動相以作用：將貯液器中的流動相以高壓（高壓（150350105

4、Pa）形式連形式連續(xù)不斷地送入柱系統(tǒng)續(xù)不斷地送入柱系統(tǒng) 性能：高壓、恒流、壓力變化小、流量范圍可調(diào)、耐腐蝕、密性能：高壓、恒流、壓力變化小、流量范圍可調(diào)、耐腐蝕、密封性好封性好 主要類型：往復式柱塞泵（恒流）主要類型：往復式柱塞泵（恒流）當柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）當柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進入的的單向閥打開，同時，流動相進入的單向閥（下部）關閉，這時就輸出少單向閥（下部）關閉，這時就輸出少量的流體。反之，當柱塞向外拉時，量的流體。反之，當柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關閉，一定量的流動相就由向閥同

5、時關閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。其儲液器吸入缸體中。（內(nèi)梯度）（內(nèi)梯度）（外梯度）（外梯度）n梯度洗脫置（程序升溫裝置）：梯度洗脫置（程序升溫裝置）： 概念：在分離過程中使用兩種或兩種以上的不概念：在分離過程中使用兩種或兩種以上的不同極性的溶液為流動相，通過不斷改變它們之間的同極性的溶液為流動相，通過不斷改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、比例，從而使流動相的強度、極性、pH或離子強度或離子強度相應的改變，從而使各組分以它們的最佳相應的改變，從而使各組分以它們的最佳k值通過值通過色譜柱，色譜柱， 達到高的分離效果。達到高的分離效果。 分類：內(nèi)梯度和分類：內(nèi)梯度和外梯度外

6、梯度 LC梯度洗脫與梯度洗脫與GC程序升溫的比較程序升溫的比較a、 弱溶劑時，弱溶劑時，k大的組分未流出；大的組分未流出；b、強溶劑時，強溶劑時，k小的組分分不開；小的組分分不開；c、中等強度溶劑時，中等強度溶劑時，k小的組分小的組分1，2分不開；分不開； d、梯度洗脫，各組分得到良好的分離梯度洗脫，各組分得到良好的分離2.2 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)n作用：作用：把分析試樣有效地送入色譜柱把分析試樣有效地送入色譜柱n進樣方式：進樣方式：微量注射器；進樣閥（耐高壓的六微量注射器；進樣閥（耐高壓的六通閥：自動化進樣、重現(xiàn)性好）通閥：自動化進樣、重現(xiàn)性好）2.3 分離系統(tǒng)（色譜柱）分離系統(tǒng)（色譜柱）n作用

7、：作用： 實現(xiàn)組分的分離實現(xiàn)組分的分離n性能：性能：直形（由不銹鋼制成）；內(nèi)徑：直形（由不銹鋼制成）；內(nèi)徑：26mm；長度：；長度：1050cm2.3 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)n作用：作用：檢測并收集各組分檢測并收集各組分n類型：類型：溶質(zhì)型檢測器和總體檢測器兩種溶質(zhì)型檢測器和總體檢測器兩種溶質(zhì)型檢測器：溶質(zhì)型檢測器：對被分離組分的物理或物理化學性質(zhì)有響應，例：對被分離組分的物理或物理化學性質(zhì)有響應，例：紫外、紫外、DAD、熒光、電化學檢測器等熒光、電化學檢測器等總體檢測器：總體檢測器：對試樣和洗脫液總的物理或物理化學性質(zhì)有響應，例：對試樣和洗脫液總的物理或物理化學性質(zhì)有響應，例：示差折光、介電常數(shù)檢

8、測器等示差折光、介電常數(shù)檢測器等n 紫外檢測器：紫外檢測器：應用最廣，可用于梯度洗脫，對大部分有機化合物有響應應用最廣，可用于梯度洗脫，對大部分有機化合物有響應 光源：光源：低壓汞燈，低壓汞燈，254或或280nm（固定波長）；氫燈、氘燈，（固定波長）；氫燈、氘燈，200-400nm（ 可調(diào)波長）可調(diào)波長） 檢測池：檢測池：很小，（很小，（1mm 10mm ，容積，容積 小于小于10L）；）； 接收元件：接收元件：光電倍增管光電倍增管n 二極管陣列檢測器（二極管陣列檢測器（DAD)：可可得到所有波長上的色譜信號得到所有波長上的色譜信號 紫外檢測器的重要進展；紫外檢測器的重要進展； 光電二極管陣

9、列檢測器：光電二極管陣列檢測器：計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。美國惠普公司美國惠普公司1100型液相色譜儀型液相色譜儀三、三、HPLC的主要類型及分離原理的主要類型及分離原理流動相要求：流動相要求： n 流動相純度高流動相純度高 n 不使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑不使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑 n 能溶解樣品，但不與樣品發(fā)生反應能溶解樣品，但不與樣品發(fā)生反應n 粘度小，以此提高柱效粘度小，以此提高柱效n 與所選用的檢測器匹配與所選用的檢測器匹配固定相分類：固定相分類： n 承受壓力：剛性固體（可承受高壓，以二氧化硅為基質(zhì)，表面鍵合承受壓力：剛性固體（可承受高壓，以

10、二氧化硅為基質(zhì)，表面鍵合各種官能團，成化學鍵合固定相）；硬膠（承受壓力低，由聚苯乙烯各種官能團，成化學鍵合固定相）；硬膠（承受壓力低，由聚苯乙烯和二乙基苯交連而成）和二乙基苯交連而成）n 孔隙深度：表面多孔型和全多孔型孔隙深度：表面多孔型和全多孔型液固色譜液固色譜（LSC, liquid-solid adsorption chromatography）固固 定定 相相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是常使用的是510m的硅膠吸附劑。的硅膠吸附劑。流流 動動 相相：各種不同極性的一元或多元溶劑。：各種不同極性的一元或多元溶劑?；驹砘驹恚航M分

11、在固定相吸附劑上的吸附與解吸；：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 應用：應用：用于分離相對用于分離相對分子量中等的油溶性分子量中等的油溶性物質(zhì)，另用于分離不物質(zhì)，另用于分離不同官能團的化合物和同官能團的化合物和異構體。異構體。缺點：缺點：非線性等溫吸非線性等溫吸附常引起峰的拖尾現(xiàn)附常引起峰的拖尾現(xiàn)象象 （2）應用和缺點應用和缺點脲的取代物與氨基甲酸酯的高速分離脲的取代物與氨基甲酸酯的高速分離硝基苯胺異構體在硝基苯胺異構體在10 m氧化鋁上的氧化鋁上的LSC分離分離液液分配色譜（液液分配色譜（LLPC) )固定相與流動相均為液體（互不相溶）；固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理基本原理

12、：組分在固定相和流動相上的分配；：組分在固定相和流動相上的分配；流流 動動 相相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極 性小于固定液的極性（性小于固定液的極性（正相正相 normal phase），反之，流），反之，流 動相的極性大于固定液的極性（動相的極性大于固定液的極性（反相反相 reverse phase）。）。 正相與反相的出峰順序相反；正相與反相的出峰順序相反；固固 定定 相相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學鍵合固定相化學鍵合固定相：（將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠

13、：（將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠 （擔體）表面的游離羥基上。（擔體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。柱（反相柱）。固定相：固定相：將固定液化學鍵合于載體（硅膠）表面形成固定相將固定液化學鍵合于載體（硅膠）表面形成固定相固定相類型：固定相類型：u 極性固定相：正相色譜極性固定相：正相色譜 以極性有機基團如胺基（以極性有機基團如胺基（-NH2）、腈基（）、腈基（-CN）、醚基（）、醚基（-O-）等）等鍵合在硅膠表面制成的鍵合在硅膠表面制成的 u 非極性固定相：反相色譜非極性固定相：反相色譜 反相色譜法最常用的固定相是反相色譜法最常用的固定相是C18 （十八烷基硅烷）、（十八烷基硅烷

14、）、 C8 （辛烷（辛烷基）和苯基鍵合相的填料?；┖捅交I合相的填料?；瘜W鍵合相色譜化學鍵合相色譜（CBPC)固定相使用條件：固定相使用條件： 為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值，但值，但需要注意的是，需要注意的是，C18使用的使用的pH值通常為值通常為2.57.5。 太高的太高的pH值會使硅膠溶解，太低的值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。值會使鍵合的烷基脫落。 正相色譜法正相色譜法 反相色譜法反相色譜法 1.極性固定相極性固定相 聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相 2.相對非極性流動相相

15、對非極性流動相 正已烷、環(huán)已烷正已烷、環(huán)已烷 3.極性調(diào)節(jié)劑極性調(diào)節(jié)劑 乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷 4.分離中等極性和極性較強化合物分離中等極性和極性較強化合物. 酚類、胺類、羰基類及氨基酸類酚類、胺類、羰基類及氨基酸類 5.組分流出順序組分流出順序 極性小先洗出極性小先洗出 1.非極性固定相非極性固定相 C18（簡稱（簡稱ODS）、）、C8 2.極性流動相極性流動相 水或緩沖液水或緩沖液 3.極性調(diào)節(jié)劑極性調(diào)節(jié)劑 甲醇、乙腈、四氫呋喃甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物分離非極性和極性較弱化合物 占整個占整個HPLC應用的應用的80%左右左右 5.組分流出

16、順序組分流出順序 極性大先洗出極性大先洗出 IC是是HPLC的一種，是分析水溶液中陰離子的最佳方法。的一種，是分析水溶液中陰離子的最佳方法。 固定相是固定相是離子交換樹脂離子交換樹脂，流動相是，流動相是淋洗液淋洗液(強電解質(zhì)強電解質(zhì))；電導電導檢測器。檢測器。 常用的淋洗劑是常用的淋洗劑是Na2CO3-NaHCO3混合液。只要改變兩種物混合液。只要改變兩種物質(zhì)的濃度比，就可以得到不同淋洗能力和質(zhì)的濃度比，就可以得到不同淋洗能力和pH值的流動相。值的流動相。 為消除淋洗液中強電解質(zhì)背景離子對電導檢測器的干擾，設為消除淋洗液中強電解質(zhì)背景離子對電導檢測器的干擾，設置了置了抑制柱或抑制器抑制柱或抑制

17、器。離子色譜法（離子色譜法（IC） 臨時過程臨時過程 （1）原理：）原理：離離子交換子交換（離子價態(tài)和離子半徑離子價態(tài)和離子半徑）淋洗液瓶淋洗液瓶Pump保護柱保護柱分析柱分析柱抑制器裝置抑制器裝置電導池電導池色譜工作站色譜工作站淋洗液輸淋洗液輸送送離子交換離子交換分離分離抑制電導抑制電導檢測檢測數(shù)據(jù)采集和儀數(shù)據(jù)采集和儀器控制器控制樣品注射樣品注射（2 2）離子色譜結(jié)構）離子色譜結(jié)構檢測具有電導性化合物的通用型檢測器檢測具有電導性化合物的通用型檢測器，最常用。，最常用。溶液溶液至至檢測檢測池池電電極極 檢測檢測池池w 安裝在電導池之前安裝在電導池之前w 提高待測離子的電導率提高待測離子的電導率

18、：提高靈敏度提高靈敏度Na+,Cl-H+,Cl-w 降低背景電導降低背景電導 (淋洗液淋洗液)： 減少噪音減少噪音Na+,HCO3-H2CO3Na+,OH-H2O極限摩爾電導值極限摩爾電導值 陽離子陽離子 陰離子陰離子 198 55 46 78 71 80 80（單位單位：S/m 當量當量）350395074735360背景背景： Na2CO3 / NaHCO3(700S)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4保留時間保留時間電導電導NaFNaCl NaNO3Na2HPO4Na2SO4背景背景： Na2CO3 / NaHCO3(700S)保留時間保留時間電導電導HFHClHN

19、O3H3PO4H2SO4保留時間保留時間背景背景： H2CO3 (15S)電導電導n 免試劑離子色譜（免試劑離子色譜（Reagent-Free ）：傳統(tǒng)離子色譜）：傳統(tǒng)離子色譜的問題的問題手工配制淋洗液和再生液手工配制淋洗液和再生液（3）離子色譜的最新發(fā)展）離子色譜的最新發(fā)展n 離子色譜樣品前處理離子色譜樣品前處理 常規(guī)樣品離子分析常規(guī)樣品離子分析 痕量離子分析痕量離子分析 大體積進樣大體積進樣在線濃縮在線濃縮 復雜基體中離子的處理復雜基體中離子的處理 預處理小柱預處理小柱n過濾：樣品中有顆粒狀物質(zhì)過濾：樣品中有顆粒狀物質(zhì)n基體消除：基體消除： * 去除樣品中所包含的，有可能損壞儀器或者影響去

20、除樣品中所包含的，有可能損壞儀器或者影響 色譜柱色譜柱/抑制器性能的成分抑制器性能的成分 重金屬離子、有機大分子重金屬離子、有機大分子 * 去除樣品中所包含的，有可能干擾目標離子測定去除樣品中所包含的，有可能干擾目標離子測定 的成分的成分 高離子強度基體高離子強度基體0.22，0.45um濾膜濾膜去除顆粒狀雜質(zhì)去除顆粒狀雜質(zhì)C18預處理小柱、預處理小柱、 On-Guard RPP柱柱去除有機分子去除有機分子On-Guard H柱柱去除溶液中的金屬離子去除溶液中的金屬離子On-Guard Ag柱柱去除溶液中的去除溶液中的Cl-離子離子 主要測定高氯物質(zhì)中的主要測定高氯物質(zhì)中的NO2-，NO3-等

21、離子等離子On-Guard Ba柱柱去除溶液中的硫酸根去除溶液中的硫酸根水中陰陽離子測定的樣品前處理水中陰陽離子測定的樣品前處理1.1.純凈水中陰離子測定純凈水中陰離子測定-直接進樣直接進樣2.2.自來水自來水 地下水中陰離子的測定地下水中陰離子的測定-0.45um-0.45um濾膜過濾膜過濾后直接進樣分析濾后直接進樣分析3.3.地表水地表水 生活污水中陰離子測定生活污水中陰離子測定-離心過濾后離心過濾后, ,用用C18C18與與0.45um0.45um濾膜過濾后進樣分析濾膜過濾后進樣分析4.4.工業(yè)廢水工業(yè)廢水-離心過濾后離心過濾后, ,用用On-Guard HOn-Guard H柱與柱與0

22、.450.45濾膜過濾進樣濾膜過濾進樣色譜柱：色譜柱：IonPac AG9-HC, AS9-HC淋洗液：淋洗液：9 mmol/L Na2CO3流速：流速：1 mL/min進樣量：進樣量：25 L色譜峰：色譜峰： 1. 氟離子氟離子 3mg/L 2. 亞氯酸根亞氯酸根 10 3. 溴酸根溴酸根20 4. 氯離子氯離子6 5. 亞硝酸根亞硝酸根15 6. 溴離子溴離子 25 7. 氯酸根氯酸根 25 8. 硝酸根硝酸根25 9. 磷酸根磷酸根40 10. 硫酸根硫酸根30空間排阻色譜空間排阻色譜（1）分離原理分離原理固定相：固定相：凝膠，含有許多不同尺寸的孔穴凝膠，含有許多不同尺寸的孔穴分離原理：分離原理：基于分子尺寸的大小進行分離，樣品組分與固定液間不存在基于分子尺寸的大小進行分離，樣品組分與固定液間不存在相互作用現(xiàn)象相互作用現(xiàn)象分離次序：分離次序：分子量大的先排出，分子量小的后排出分子量大的先排出，分子量小的后排出 固定相的排阻極限：因分子量過大而不能部分地進入某一給定固定固定相的排阻極限：因分子量過大而不能部分地進入某一給定固定相孔內(nèi)的最小的樣品粒子的分子量相孔內(nèi)的最小的樣品粒子的分子量 固定相的滲透極限：因分子量過小而能完全進入某一給定固定相最固定相的滲透極限：因分子量過小而能完