生物工程導(dǎo)論復(fù)習(xí)

1、1.生物工程: 它是以生物科學(xué)和生物技術(shù)為基礎(chǔ),結(jié)合化學(xué)工程,機(jī)械工程,控制工程,環(huán)境工程等工程科學(xué),研究和發(fā)展利用生物體系或其中的一部分生產(chǎn)有益于社會(huì)的產(chǎn)品或達(dá)到一定社會(huì)目標(biāo)的過(guò)程工程科學(xué).2.生物工程的研究對(duì)象: 包括活的生物體或它們的一部分.3.生物工程的任務(wù): 就是為細(xì)胞的生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物的積累創(chuàng)造最好的條件,研究開(kāi)發(fā)最適合的工藝路線和設(shè)備,實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)以滿足需要.4.生物工程的研究領(lǐng)域: 基因工程,在1967年完全確定DNA分子中64個(gè)三聯(lián)密碼子后不久,第一個(gè)基因工程產(chǎn)品-人胰島素就面世了.基因工程的工力功能是編碼蛋白質(zhì). 細(xì)胞工程,細(xì)胞是構(gòu)成包括人類(lèi),動(dòng)物,植物和生物在內(nèi)的幾乎所有

2、生物的基本單元.細(xì)胞最顯著的特點(diǎn):環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),通過(guò)細(xì)胞內(nèi)無(wú)數(shù)個(gè)由酶催化并得到良好組織和調(diào)節(jié)的化學(xué)反應(yīng). 酶工程,是研究酶的分離,提純及利用酶作為催化劑,實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化,合成各種產(chǎn)物或達(dá)到人類(lèi)所需社會(huì)目標(biāo)的工程科學(xué).幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì),酶具有催化劑的功能.酶的來(lái)源包括動(dòng)物,植物及微生物,來(lái)源不同的酶有不同的用途.動(dòng)物來(lái)源的酶一般用于醫(yī)藥或診斷試劑.植物和部分微生物來(lái)源的酶可用于食品工業(yè),而工業(yè)用酶一般都來(lái)源于微生物. 微生物工程(發(fā)酵工程),泛指所有細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)并獲得目標(biāo)產(chǎn)物的過(guò)程.是典型的多相、多尺度問(wèn)題.采用液體深層發(fā)酵的方法. 生物分離工程.特殊性:A.目標(biāo)產(chǎn)物的濃度低.B.目

3、標(biāo)產(chǎn)生與雜質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)十分接近,而且成分非常復(fù)雜.C.目標(biāo)產(chǎn)物往往具有生物活性.D.在許多應(yīng)用領(lǐng)域,生物技術(shù)產(chǎn)品有很高的純度和安全性要求.5.酶催化反應(yīng)的特點(diǎn): 有很高的效率和專(zhuān)一性,酶催化反應(yīng)的專(zhuān)一性包括底物專(zhuān)一性,基團(tuán)專(zhuān)一性及立體專(zhuān)一性等. 6.生物工程的服務(wù)領(lǐng)域: 人類(lèi)健康,農(nóng)業(yè),資源, 資源和能源,環(huán)境保護(hù). 7.基因工程的誕生和發(fā)現(xiàn): 基因工程誕生于1973年.三大發(fā)現(xiàn):20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA20世紀(jì)50年代提出了DNA是雙螺結(jié)構(gòu)20世紀(jì)60年代確定了遺傳信息的傳遞方式. 8.基因工程技術(shù)上的三大發(fā)明: 工具酶載體逆轉(zhuǎn)錄酶 9.基因工程:也稱(chēng)基因克隆或DN

4、A分子克隆.指將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體內(nèi),使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)自制,轉(zhuǎn)錄,翻譯表達(dá)的操作過(guò)程. 10.基因工程的實(shí)施至少要四個(gè)條件: 工具酶基因載體受體細(xì)胞.11.遺傳工程,基因工程,DNA重組之間的差別: 遺傳工程是發(fā)生在遺傳過(guò)程中的自然界原本存在的導(dǎo)致變異的一種現(xiàn)象,即自然出現(xiàn)的不同DNA鏈斷裂并連接成新的DNA分子,新的DNA分子含有不同于親體的DNA片段.DNA重組是人們根據(jù)遺傳工程原理利用限制性?xún)?nèi)切酶在體外對(duì)DNA進(jìn)行的人工操作,.基因工程是遺傳重組和DNA重組的目的和結(jié)果,無(wú)論是利用自然的還是人工的方法,最終目的都是要實(shí)現(xiàn)基因重組. 12.克隆:(名詞)指從同一個(gè)祖先通

5、過(guò)無(wú)性繁殖方式產(chǎn)生的后代,或具有相同遺傳性狀的DNA分子,細(xì)胞或個(gè)體所組成的特殊的生命群體. (動(dòng)詞)指從同一祖先生產(chǎn)這類(lèi)同一的DNA分子群或細(xì)胞過(guò)程.13.基因工程的主要內(nèi)容: 帶有目的基因的DNA片段的分離或人工合成在體外,將帶有目的的基因的DNA片段連接到載體上,形成重組DNA分子重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞(也稱(chēng)宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞)帶有重組DNA分子的細(xì)胞培養(yǎng),獲得大量的細(xì)胞系列群體重組體的篩選重組體中目的基因的功能表達(dá).14.基因工程工程的理論基礎(chǔ): 是分子生物學(xué).一方面,分子生物學(xué)的快速發(fā)展促成了基因工程的建立和發(fā)展完善.另一方面,基因工程的誕生和發(fā)展不僅帶動(dòng)了現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化,而且也使

6、整個(gè)生命科學(xué)的研究產(chǎn)生了革命性的變化 ,使得生命科學(xué)成為當(dāng)今發(fā)展最快的學(xué)科之一. 15.DNA的組成: DNA是由大量的脫氧核糖苷酸組成的極長(zhǎng)的線狀或環(huán)狀大分子.DNA分子的基本單位是脫氧核糖苷酸,它由堿基,脫氧核糖和磷酸基三部分組成.在核苷酸中有4種不同的堿基,即腺嘌噙(A),鳥(niǎo)嘌呤(G),胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C). 16.1953年Watson和Crick提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,闡明了DNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu).這一理論的核心是:堿基配對(duì)互補(bǔ).堿基配對(duì)是DNA分子結(jié)構(gòu)的主要特性. 17.決定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素有: 氫鍵的形成,堿基的堆積力,磷酸基之間的靜電斥力,堿基分子內(nèi)能的作用等

7、. 18.DNA的復(fù)制: 一個(gè)DNA分子可以通過(guò)半保留復(fù)制機(jī)制精確地提制成兩個(gè)完全相同的DNA分子,并分配到兩個(gè)細(xì)胞中,從而將親代細(xì)胞所含的遺傳信息原原本本地傳到子代細(xì)胞.19.DNA復(fù)制的特點(diǎn): DNA的復(fù)制從特定的位點(diǎn)開(kāi)始,這個(gè)特定的位點(diǎn)稱(chēng)為復(fù)制起始點(diǎn),有復(fù)制起始點(diǎn)雙鏈DNA解旋,形成復(fù)制叉半保留復(fù)制DNA復(fù)制具有高度的忠實(shí)性,其復(fù)制的忠實(shí)性同DNA聚合酶所具有的自我校正功能密不可分.雖然DNA聚合酶是是DNA復(fù)制的主酶,然而DNA復(fù)制是多種酶和蛋白因子協(xié)同有序工作的結(jié)果. 20.DNA作為遺傳物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn): 信息量大,可以微縮.表面互補(bǔ),電荷互補(bǔ),雙螺旋結(jié)構(gòu)保證了精確復(fù)制的機(jī)制.核糖的2們

8、脫氧,在水溶液中穩(wěn)定性好.可以突變,以求進(jìn)化.有T無(wú)U,基因級(jí)得以增大. 21.DNA的變性:在加熱或某些試劑的作用下,DNA配對(duì)堿基之間的氫鍵結(jié)構(gòu)受到破壞,雙鏈DNA的多核苷酸鏈能完全分離的過(guò)程,也稱(chēng)熔解. 22.復(fù)性的過(guò)程:當(dāng)兩條鏈互相碰撞,一條鏈的某個(gè)區(qū)域遇到了互補(bǔ)的另一條鏈的配對(duì)時(shí),便在這個(gè)區(qū)段形成雙鏈核心,然后從核心向兩側(cè)對(duì)應(yīng)互補(bǔ)鏈擴(kuò)大互補(bǔ)配對(duì),最后完成復(fù)性過(guò)程.23.發(fā)生復(fù)性必須滿足的兩個(gè)條件: 鹽濃度必須高到足以消除兩條鏈中的磷酸基團(tuán)的靜電斥力溫度必須升高到足以破壞其隨機(jī)形成的鏈內(nèi)氫鏈,但溫度又不能太高,否則不能形成和維持穩(wěn)定的鏈間堿基配對(duì). 24.雜交:當(dāng)復(fù)性的DNA分子由不同

9、的兩條單鏈分子形成時(shí),稱(chēng)為雜交. 25.遺傳信息的傳遞方向-中心法則: 1958年,Crick提出.DNA通過(guò)以自身為模板進(jìn)行復(fù)制而使遺傳信息代代相傳,并通過(guò)RNA最終將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子,最后蛋白質(zhì)分子表現(xiàn)出各種性狀,即DNA(基因)RNA蛋白質(zhì)(性狀). 26.轉(zhuǎn)錄:利用DNA為模板RNA的過(guò)程.轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵一步. 翻譯:以RNA為模板合成蛋白質(zhì)的過(guò)程.就是將以核苷酸形式編碼在mRNA中的信息轉(zhuǎn)變成多肽鏈中特定的氨基酸順序. 27.mRNA的合成過(guò)程: RNA合成以四種核糖核苷三磷酸為底物,即ATP,GTP,CTP,UTP.RNA聚合酶結(jié)合于DNA分子上的特定位置使DNA雙鏈

10、解旋,起始RNA合成RNA鏈的延伸RNA合成的終止和釋放. 28.基因的表達(dá):DNA分子把它所承載的遺傳信息轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟ò被犴樞驑?gòu)成的多肽或蛋白質(zhì)分子的過(guò)程. 29.基因的分類(lèi): 基因根據(jù)功能的不同可分為:結(jié)構(gòu)基因,調(diào)節(jié)基因和操縱基因. 作為一個(gè)能轉(zhuǎn)錄和翻譯的基因必須包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子,基因編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子. 30.原核生物中基因轉(zhuǎn)錄有兩種情況: 一種是組成型的,另一種是基因的轉(zhuǎn)錄是受到調(diào)控的. 原核生物中最早開(kāi)始研究的基因調(diào)控體系是大腸桿菌乳糖操縱子. 31.真核生物翻譯后修飾主要體現(xiàn)在: 形成正確的二硫鍵切割前體蛋白質(zhì)糖基化對(duì)氨基酸的修飾. 32.工具酶:一般把切割DNA分子,進(jìn)行DNA片段

11、修飾和DNA片段連接等所需的酶稱(chēng)為工具酶. 33.工具酶按用途分類(lèi): 限制性?xún)?nèi)切酶,指識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特殊核苷酸順序的酶的統(tǒng)稱(chēng).連接酶,指將兩段乃至數(shù)段DNA片段拼接起來(lái)的酶.修飾酶. 其它基因工程的工具酶:DNA聚合酶,逆轉(zhuǎn)錄酶,T4多核苷酸酶和堿性磷酸酶等. 逆轉(zhuǎn)錄酶：是從mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成互補(bǔ)DNA（cDNA）的酶，亦稱(chēng)為依賴(lài)于RNA的DNA聚合酶。 34.基因工程載體: 外源基因必須先同某種傳遞者結(jié)合后才能進(jìn)入細(xì)菌和動(dòng)植物受體細(xì)胞,這種能承載外源DNA片段并帶入受體細(xì)胞的傳遞者稱(chēng)為基因工程載體. 目前已構(gòu)建應(yīng)用的基因工程載體有:質(zhì)粒載體,噬菌體載體,病毒載體以及由它們互相組合

12、或與其他基因級(jí)DNA組合成的載體.這些載體可分為克隆載體和表達(dá)載體. 35.用于原核生物宿主的載體: 質(zhì)粒載體：A質(zhì)粒載體pBR322（原核質(zhì)粒常見(jiàn)）B.pUC19. 質(zhì)粒廣泛存在于細(xì)菌中，某些藍(lán)藻、綠藻和真菌細(xì)胞中也存在質(zhì)粒。質(zhì)粒,是能自主復(fù)制雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子,它們?cè)诩?xì)菌中以獨(dú)立于染色體外的方式存在.噬菌體載體柯斯質(zhì)粒. 用于真核生物宿主的人工載體大多具有大腸桿菌質(zhì)粒的耐藥性或噬菌體的強(qiáng)感染力，同時(shí)還應(yīng)滿足攜帶真核生物目的基因大片段 DNA的要求。 36.用于真核生物宿主的載體: YIP載體,YRP載體YAC載體是人工染色體的縮寫(xiě)其他載體. BAC是以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)組建的細(xì)菌克隆體系

13、。 都是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段組成. 37.用于植物宿主的載體:Tr質(zhì)粒.A.整合型法B.雙載體系統(tǒng)法植物DNA病毒和植物轉(zhuǎn)座子. 38.用于動(dòng)物宿主的載體:用于昆蟲(chóng)細(xì)胞的載體用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體. 39.基因工程載體的必備條件和簡(jiǎn)單分類(lèi): 條件:能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞.載體可以在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制要有篩選標(biāo)記對(duì)多種限制酶有單一或較少的切點(diǎn),最好是單一切點(diǎn). 分類(lèi):克隆載體. 是以繁殖DNA片段為目的的載體。穿梭載體. 用于真核生物DNA片段在原核生物中增殖，然后再轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞宿主表達(dá)。表達(dá)載體. 用于目的基因的表達(dá)。 40. 蛋白質(zhì)工程：通過(guò)定位突變的方法使所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功

14、能發(fā)生變化，根據(jù)需要設(shè)計(jì)新的氨基酸序列，已經(jīng)發(fā)展成為一門(mén)新的交叉學(xué)科。 41、基因庫(kù)：也叫基因組文庫(kù)，是指用克隆的方法將一種生物的全部基因組長(zhǎng)期以重組體方式保持在適當(dāng)?shù)乃拗髦小?42、基因文庫(kù)：也叫cDNA文庫(kù)。首先獲得mRNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，經(jīng)克隆后形成文庫(kù)。cDNA文庫(kù)和基因庫(kù)的不同之處在于，cDNA文庫(kù)在mRNA拼接過(guò)程中已經(jīng)除去了內(nèi)含子等成分，便于DNA重組時(shí)直接使用。 43、基因組文庫(kù)的篩選：DNA雜交法。雙鏈DNA分子可以通過(guò)熱處理或堿變性的方法變性成單鏈DNA分子。加熱后緩慢冷卻的過(guò)程稱(chēng)為退火。退火后有的DNA分子的兩條鏈分別來(lái)自于不同的DNA分子，即形成了雜合DNA分子。免

15、疫反應(yīng)法：若一個(gè)目的基因DNA序列可以轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)、那么只要出現(xiàn)這種蛋白質(zhì)，甚至只需要該蛋白質(zhì)的一部分，就可以用免疫的方法檢測(cè)。酶活性法：如果目的基因編碼一種酶，而這種酶又是宿主細(xì)胞所不能編碼的，那么就可以通過(guò)檢查酶活性來(lái)篩選目的基因的重組子。 44.基因工程中一般都使用松弛型質(zhì)粒載體。兩種常用的質(zhì)粒載體為pBR322和pUC19. 在基因組工程研究中，采用的載體是人工染色體。 45.1982年，第一基因工程藥物人胰島素就在美國(guó)的Eli Lilly公司研究成功并投放市場(chǎng)。第一類(lèi)基因工程藥物主要針對(duì)因缺乏天然內(nèi)源性蛋白所引起的疾病。第二類(lèi)基因生物工程藥物屬于酶類(lèi)。第三類(lèi)基因工程藥物屬于疫苗

16、。第四類(lèi)產(chǎn)物單克隆抗體既能用于疾病診斷，又能用于治療。 46、1989年我國(guó)第一個(gè)基因工程藥物干擾素-alb上市，標(biāo)志著我國(guó)基因工程制藥實(shí)現(xiàn)了零的突破。 47、1970年Baltimore等人和Temin等人同時(shí)在各自的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。 48、1953年Watson和Crick提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，闡明了DNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 49、決定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)因素有：氫鍵的形成、堿基的堆積力、磷酸基之間的靜電斥力，堿基分子內(nèi)能的作用力。 50.真核生物目的基因的獲得： cDNA方法。DNA的化學(xué)合成法。PCR法。1983年美國(guó)Cetus公司的M

17、ullis等人建立起了一套大量快速地?cái)U(kuò)增特異DNA片段的系統(tǒng)，即聚合酶反應(yīng)系統(tǒng)。 PCR法要求反應(yīng)體系具有以下條件:要有與被分離的目的基因兩條鏈各一端序列互補(bǔ)DNA引物。具有熱穩(wěn)定性的酶，如TaqDNA聚合酶。dNTP。作為模板的目的DNA序列。 PCR反應(yīng)過(guò)程包括以下三個(gè)方面：變性，將模板DNA置于95的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開(kāi)變成單鏈DNA。退火，將反應(yīng)體系的溫度降低到55左右，使得一對(duì)引物能分別與變性后的兩條模板鏈相配對(duì)。延伸，將反應(yīng)體系溫度調(diào)整到TaqDNA聚合酶作用的最適溫度72，以目的基因?yàn)槟０?，合成新的DNA鏈。51.（名）DNA重排的基本原理： 是首先將同源基因（單一基因

18、或基因家族）切成隨機(jī)DNA片段，然后進(jìn)行PCR重聚。那些帶有同源性但核苷酸序列有差異的隨機(jī)DNA片段，在每一輪PCR循環(huán)中互為引物和模板，經(jīng)多次PCR循環(huán)后能迅速產(chǎn)生大量的重組DNA，創(chuàng)造出新基因。 基因組重排技術(shù)可以用來(lái)改造細(xì)菌的基因組，實(shí)現(xiàn)表型的改良。經(jīng)典雜交育種在每一代只有兩個(gè)親本進(jìn)行重組，而重排技術(shù)則具有多親本雜交的優(yōu)勢(shì)。對(duì)細(xì)菌群體進(jìn)行重復(fù)的基因組重排可以有效構(gòu)建新菌株的組合文庫(kù)。 52.基因組文庫(kù)篩選的鑒定方法: 一是標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行DNA雜交,二是用抗體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫雜交.三是對(duì)蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行鑒定. 53.PCR技術(shù)具有的特點(diǎn): 能夠指導(dǎo)DNA序列的合成,因?yàn)樾潞铣傻腄NA

19、鏈的起點(diǎn),是由加入在反應(yīng)混合物中一對(duì)寡核苷酸引物,在模板DNA鏈兩端的退火位點(diǎn)決定.能夠使特定的DNA區(qū)段得到迅速大量的擴(kuò)增. 54.目的基因與載體DNA的連接分類(lèi): 按是否形成黏性末端可分為:黏性末端DNA片段的連接.方法:插入法(單酶切)和取代式(雙酶切)非互補(bǔ)黏性末端或平端DNA片段的連接(方法:同聚物加尾法,銜接物連接法及接頭連接法). 55.提高連接反應(yīng)的效率的方法: 采用堿性磷酸酶處理,同聚物加尾連接技術(shù)或采用柯斯質(zhì)粒等手段防止未重組載體的再環(huán)化減少非重組體克隆的出現(xiàn)合理正確地配比DNA的總濃度以及載體DNA和外源DNA之間的比例根據(jù)不同的反應(yīng)類(lèi)型控制合理的反應(yīng)溫度和時(shí)間. 可以大

20、幅度提高轉(zhuǎn)化子數(shù)量. 56.受體細(xì)胞,DNA重組使用的受體細(xì)胞,也稱(chēng)宿主細(xì)胞或基因表達(dá)系統(tǒng).受體細(xì)胞為基因的復(fù)制,轉(zhuǎn)錄,翻譯,后加工及分泌等提供了條件,以便實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá).目前用做基因克隆受體的原核生物主要是大腸桿菌和枯草桿菌.酵母和霉菌等也已經(jīng)廣泛用做基因工程的宿主細(xì)胞. 57.受體細(xì)胞選擇的一般原則: 根據(jù)所用的載體體系及各種受體細(xì)胞的基因型進(jìn)行選擇,使重組體的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染效率高,能穩(wěn)定傳代,受體細(xì)胞基因型與載體所含的選擇標(biāo)記匹配,易于篩選重組體及外源基因可以高效表達(dá)和穩(wěn)定積累等. 58.重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法: 轉(zhuǎn)化,就是一個(gè)攜帶基因的外源DNA分子與膜結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞,并在

21、胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的過(guò)程.轉(zhuǎn)導(dǎo),指通過(guò)噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑將外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程.顯微注射高壓電穿孔法.多聚物介導(dǎo)法磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導(dǎo)法粒子轟擊法. 59.重組體的篩選的方法: 重組體篩選的方法很多，在核酸水平或蛋白質(zhì)水平上篩選。從核酸水平篩選克隆子可以通過(guò)核酸交雜的方法。這類(lèi)方法根據(jù)DNA-DNA、DNA-RNA堿基配對(duì)的原理，以使用基因探針技術(shù)為核心，發(fā)展了原位交雜、Southern交雜、Northern交雜等方法。從蛋白質(zhì)水平上篩選克隆子的方法主要有：檢測(cè)抗生素抗性及營(yíng)養(yǎng)缺陷型、觀測(cè)噬菌斑的形成、檢測(cè)目標(biāo)酶的活性、目標(biāo)蛋白的免疫特性和生物活

22、性等。 利用抗生素抗性基因營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)法核酸雜交法通過(guò)免疫反應(yīng)篩選通過(guò)酶活性篩選. 60.目的基因的高效表達(dá)： 影響目的基因表達(dá)的基本基因：從基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和目的基因表達(dá)過(guò)程這兩個(gè)方面分析，目的基因的表達(dá)效率不僅取決于宿主菌體特性和表達(dá)載體的構(gòu)建，而且還取決于重組菌的培養(yǎng)工程。從表達(dá)系統(tǒng)來(lái)看，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平上。目的基因的不溶性高效表達(dá)。對(duì)于不需要翻譯后修飾的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，利用生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)基簡(jiǎn)單的大腸桿菌為宿主細(xì)胞，采用不溶性融合蛋白表達(dá)策略仍是一種提高目的基因表達(dá)效率的很好選擇。（通過(guò)采用目的蛋白與帶純化標(biāo)簽的細(xì)菌蛋白融合的新策略，所得到的融合蛋白不僅能夠抵抗蛋白酶的進(jìn)攻，而

23、且可以利用帶純化標(biāo)簽的蛋白與相應(yīng)的抗體之間的親和反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高效親和分離。）目的基因的高效可溶性表達(dá)。對(duì)于不少目的蛋白，可通過(guò)降低啟動(dòng)子強(qiáng)度和減少培養(yǎng)溫度的手段成功的實(shí)現(xiàn)高水平的可溶性表達(dá)。目的基因的高效分泌型表達(dá)。當(dāng)采用大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，如果在質(zhì)粒設(shè)計(jì)時(shí)就加上一段信號(hào)肽基因，就有可能實(shí)現(xiàn)目的蛋白質(zhì)的分泌型表達(dá)。構(gòu)建分泌型、特別是胞外分泌型的表達(dá)載體是實(shí)現(xiàn)目的基因高效表達(dá)的重要發(fā)展方向之一。61.如何減少乙酸等抑制性副產(chǎn)物的形成: 降低比生長(zhǎng)速率降低培養(yǎng)溫度限制性流加葡萄糖基因工程菌培養(yǎng)和乙酸分離耦合過(guò)程. 62.基因工程制藥的基本內(nèi)容: 第一類(lèi)基因工程藥物主要針對(duì)因缺乏天然內(nèi)源

24、性蛋白所引起的疾病.這類(lèi)蛋白主要以激素類(lèi)為代表.第二類(lèi)基因工程藥物屬于酶類(lèi),第三類(lèi)基因工程藥物屬于疫苗,用于防治病毒引起的人或動(dòng)物的傳染性疾病.第四類(lèi)產(chǎn)物單克隆抗體既能用于疾病診斷,又能用于治療,單克隆抗體已成為研究和開(kāi)發(fā)的新熱點(diǎn). 63.基因工程與基因組工程的對(duì)比: 操作的基因和載體.兩者都是對(duì)基因進(jìn)行工程性的遺傳操作.但基因工程常用的載體是質(zhì)粒和病毒載體,克隆基因的容量有限.面基因組工程研究中,采用的載體是人工染色體,容納的基因?qū)儆诨蛞蛉后w的表達(dá), 克隆和擴(kuò)增的宿主.用于基因工程的研究的克隆和擴(kuò)增的宿主有細(xì)菌,真菌,動(dòng)植物細(xì)胞,但大多是以大腸桿菌為主.用于基因組工程研究的克隆和擴(kuò)增的宿主

25、也可以是細(xì)菌,真菌,動(dòng)植物細(xì)胞,但主要以酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞為主. 工程操作手段.重組DNA技術(shù)是基因工程研究的基礎(chǔ),它依賴(lài)于質(zhì)?；虿《据d體,限制性?xún)?nèi)切酶,DNA連接酶和大腸桿菌宿主等,基因?qū)胨拗鞯氖侄瓮ǔＳ修D(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)染和顯微注射等,基因組工程在重組DNA技術(shù)應(yīng)用上,發(fā)展人工染色體作為載體,建立遺傳同源重組技術(shù)作為Mb級(jí)的DNA大片段切割和整合的基礎(chǔ),需要完善酵母和培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和融合技術(shù),開(kāi)拓干細(xì)胞和體細(xì)胞克隆個(gè)體的方法. 產(chǎn)物檢測(cè).在基因工程研究中,利用限制性?xún)?nèi)切酶圖譜,Southern印跡,Northern印跡,PCR,序列分析等手段分析基因表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物可以用蛋白質(zhì)分析,酶學(xué)分析

26、,抗體或底物結(jié)合等手段來(lái)研究.在基因組工程研究中,操作的基因數(shù)量大,產(chǎn)物非常復(fù)雜,除了用深遠(yuǎn)手段檢測(cè)基因表達(dá)之外,還需用高通量的研究手段來(lái)檢測(cè)基因群體,表達(dá)圖譜及產(chǎn)物群. 64.基因組工程學(xué)的研究展望: 遺傳語(yǔ)文遺傳,發(fā)育,分化的操作指令和程序細(xì)胞生命活動(dòng)的網(wǎng)絡(luò)(整合生物學(xué))人類(lèi)社會(huì)21世紀(jì)主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)的希望之星基因組工程產(chǎn)業(yè). 65.提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性: 要從質(zhì)粒構(gòu)建和培養(yǎng)方法改進(jìn)兩條途徑進(jìn)行研究.在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí),一般都插入了抗生素抗性基因,可以抑制不含質(zhì)粒細(xì)胞的生長(zhǎng),另外加入稱(chēng)為par和cer的位點(diǎn),能從源頭上提高質(zhì)粒穩(wěn)定性.在工程菌的培養(yǎng)過(guò)程中,適當(dāng)降低菌體的生長(zhǎng)速率,采用細(xì)胞生長(zhǎng)期和誘導(dǎo)

27、表達(dá)時(shí)期分開(kāi)的分段培養(yǎng)策略,也有人提出采用培養(yǎng)條件循環(huán)控制策略,還可以受用固定化細(xì)胞培養(yǎng)也有利于提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性. 66.重組菌的高密度培養(yǎng): 不僅取決于上游重組系統(tǒng)的構(gòu)建,而且還取決于重組菌的培養(yǎng)工程策略.宿主菌和培養(yǎng)菌.流加發(fā)酵實(shí)現(xiàn)高密度重組菌培養(yǎng). 67.目的蛋白表達(dá)的質(zhì)量: 在重組細(xì)胞的產(chǎn)物表達(dá)后,目的蛋白常常會(huì)受到各種修飾,而且經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)與目的蛋白質(zhì)的性質(zhì)十分接近,所以宿主細(xì)胞選擇是一個(gè)很重要的因素.在培養(yǎng)方法上,通過(guò)將菌體生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)時(shí)期分開(kāi),可以降低目的蛋白的暴露時(shí)間,從而減少目的蛋白被修飾的機(jī)會(huì).另外,降低培養(yǎng)溫度可以降低修飾酶活性,也有利于提高目的蛋白的質(zhì)量. 68、

28、干細(xì)胞及其特點(diǎn)： 干細(xì)胞：即未分化的細(xì)胞，是一類(lèi)具有自我更新和分化發(fā)育潛能的原始細(xì)胞。機(jī)體的各種細(xì)胞、組織和器官、甚至完整的生物都是通過(guò)干細(xì)胞分化發(fā)育而成的。干細(xì)胞分胚胎干細(xì)胞和組織干細(xì)胞兩類(lèi)。 特點(diǎn):是一類(lèi)極特殊的來(lái)自胚胎或成體的未分化細(xì)胞，同時(shí)具有不斷增長(zhǎng)繁殖的功能以及向多種功能細(xì)胞分化的潛能。(脫分化增殖和定向分化) 69、原代細(xì)胞：是直接從組織器官中分離得到的，原代細(xì)胞培養(yǎng)一般由組織器官解剖分離、解聚和離體細(xì)胞培養(yǎng)三個(gè)步驟組成。 70、細(xì)胞系：一旦原代細(xì)胞進(jìn)行了傳代培養(yǎng)（亦稱(chēng)轉(zhuǎn)種），便被稱(chēng)為細(xì)胞系。 71、細(xì)胞株：細(xì)胞系中往往存在若干表型相似或相異的細(xì)胞世系，若其中一世系，經(jīng)過(guò)選殖克隆

29、、物理性細(xì)胞分離，或其他選擇技術(shù)，而培養(yǎng)的細(xì)胞群體中辨識(shí)出其特殊表型性質(zhì)，該細(xì)胞系便稱(chēng)為細(xì)胞株。 72、植物細(xì)胞具有“全能性”，即單一的離體細(xì)胞在一定環(huán)境下能分化成不同的細(xì)胞組織乃至整個(gè)植株。 73.植物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生理特性： 植物細(xì)胞尺寸較大。植物細(xì)胞對(duì)剪切力非常敏感。易沉降。植物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。植物細(xì)胞生長(zhǎng)與次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。易染菌。 74.干細(xì)胞的研究進(jìn)展： 胚胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞。造血干細(xì)胞分布于骨髓、外周血和臍血中。尤其臍血中含有豐富的造血干細(xì)胞。造血干細(xì)胞是造血細(xì)胞的“種子”，體內(nèi)所有血細(xì)胞，包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等，都由它分化發(fā)育而來(lái)，也是人們認(rèn)識(shí)最早的干細(xì)胞之一。

30、間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞是分化發(fā)展成為骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌肉細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞，在成年后主要存在于骨髓下和骨髓腔中，也分布于肌肉、胸腺和皮膚中。神經(jīng)及其他干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞存在于成體神經(jīng)組織中，具有再生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突狀細(xì)胞的潛在能力。 75、胚胎干細(xì)胞： 具有形成所有組織和器官的能力，具有“全能性”。胚胎干細(xì)胞逐漸定向分化，朝著特定的組織器官發(fā)展，失去全能性而變得比較專(zhuān)一，它們只能發(fā)育分化成一個(gè)系統(tǒng)中的幾種細(xì)胞，但不能生成其他系統(tǒng)的細(xì)胞，因?yàn)檫@些干細(xì)胞稱(chēng)為“多能”干細(xì)胞。“多能”干細(xì)胞繼續(xù)分化發(fā)育，將生成更加專(zhuān)門(mén)化的細(xì)胞，即“專(zhuān)能”干細(xì)胞，它們只能再增殖分化

31、為一種類(lèi)型的“終端”細(xì)胞，如紅細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。終端細(xì)胞失去了分裂增殖能力，只能完成專(zhuān)門(mén)的生理機(jī)能，如輸送氧氣、肌肉收縮、傳遞信息等。 76.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng): 離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞主要有哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞兩種. 離體培養(yǎng)環(huán)境可分為貼壁(絕大部分動(dòng)物細(xì)胞)和懸浮生長(zhǎng)兩種方式.通氣攪拌罐懸浮培養(yǎng)是目前最為理想的培養(yǎng)方式.動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方法主要有間歇培養(yǎng),流加培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)等.動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁,對(duì)剪切力非常敏感,因此動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不僅要求氧氣的及時(shí)供給,還要求攪拌適宜,避免引起的流體剪切力造成對(duì)細(xì)胞的破壞,因此動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器需要滿足特殊的要求.(旋轉(zhuǎn)瓶和中空纖維反應(yīng)器是比較常見(jiàn)的動(dòng)

32、物細(xì)胞大規(guī)模貼壁培養(yǎng)的反應(yīng)器) 77.哺乳動(dòng)物細(xì)胞種類(lèi): 從具有特定功能的組織器官中分離得到的,可分為非致死和致死的兩大類(lèi). 78.原代細(xì)胞:一般,將從特定功能組織器官中分離后無(wú)法增殖或處于未穩(wěn)定傳代培養(yǎng)前的動(dòng)物細(xì)胞. 是直接從組織器官中分離得到的,原代細(xì)胞培養(yǎng)一般由組織器官解剖分離,解聚和離體細(xì)胞培養(yǎng)三個(gè)步驟組成. 79、酶法分離：是目前應(yīng)用最廣的動(dòng)物細(xì)胞分離法，最常使用的酶有胰蛋白酶、膠原酶、彈性蛋白酶等，它們可以單獨(dú)使用或混合使用。屬被淋濾到地下水或通過(guò)空氣擴(kuò)散到環(huán)境的植物固化。 80.連續(xù)化細(xì)胞:將能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)并能連續(xù)生長(zhǎng)系列的細(xì)胞. 81.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生物特性: 動(dòng)物細(xì)胞一般呈圓

33、形,直徑為720 m,與微生物細(xì)胞不同,動(dòng)物細(xì)胞非常復(fù)雜,具有許多精密分工,職能專(zhuān)一的各種細(xì)胞,保證其生命活動(dòng)的高度程序化與高度自控性. 82.哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求: 通過(guò)血液或其他體液循環(huán)來(lái)吸收血液基其他體液中的營(yíng)養(yǎng).仿效體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)供給模式,動(dòng)物細(xì)胞的離體培養(yǎng)最初采用天然體液培養(yǎng)基,由于細(xì)胞繁殖對(duì)投師穩(wěn)定的培養(yǎng)基的大量需求,逐漸形成仿照天然體液的化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基配方.同時(shí)還需要不同程度地少量補(bǔ)充血清,蛋白質(zhì)水解物或胚胎萃取物后,這此培養(yǎng)基就能滿足絕大多數(shù)連續(xù)細(xì)胞株的營(yíng)養(yǎng)需要. 83.血清的添加造成下述致命缺陷: 生理變異性難于控制的保存期限和質(zhì)量血清不能采用加熱方法滅菌,只能應(yīng)用過(guò)濾

34、方法,使含血清培養(yǎng)基很容易被雜菌污染昂貴的下游處理成本動(dòng)物血清可能存在各種病毒,使動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物有潛在的病毒交叉感染危險(xiǎn)血清的價(jià)格昂貴. 84.天然產(chǎn)物(次生代謝物): 從植物中提取得到的植物性藥物,信用香料或化妝品都是植物體內(nèi)細(xì)胞積累的上些中間代謝物,與植物的生長(zhǎng)無(wú)關(guān) 85.植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器: 攪拌罐是最早用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器.目前,鼓泡床反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器最常用于植物細(xì)胞培養(yǎng). 86.植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用: 生產(chǎn)有用物質(zhì)(次級(jí)代謝產(chǎn)物),快速繁殖植物無(wú)性系以及深入研究植物細(xì)胞遺傳,生理,生化病毒感染等. 87.利用植物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行藥物生產(chǎn): 太平洋紫杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌藥物

35、紫杉醇人參細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人參皂苷和人參多糖毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化毛地黃毒苷. 88.目前最為成功的應(yīng)用植物細(xì)胞 大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)色素的是利用紫草細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧.89.植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展趨勢(shì): 建立和選擇高產(chǎn)植物細(xì)胞系植物組織化培養(yǎng)固定化細(xì)胞技術(shù)產(chǎn)物促進(jìn)釋放技術(shù)產(chǎn)物合成與分離耦合過(guò)程. 90.常用的建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方法: 顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法胚胎干細(xì)胞精子載體法體細(xì)胞核移植法. 91.轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法: 農(nóng)桿菌導(dǎo)入法基因槍法花粉管通道法原生質(zhì)體融合法. 92.轉(zhuǎn)基因植物疫苗的優(yōu)點(diǎn): 易于形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模價(jià)格便宜,易于栽培和管理,生產(chǎn)成本很低安全,植物病毒不會(huì)感染人類(lèi)和家畜使用方便. 93.造血

36、干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞 前者分布于骨骼,外周血和臍血中.后者是分化發(fā)展為成骨細(xì)胞,成軟骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞,成肌肉細(xì)胞和骨骼基質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞.成年后主要存在于骨膜下和骨髓腔中,也分布于肌肉,胸腺和皮膚中. 94.組織工程的研究 幾乎遍及人體所有的器官和組織。一些組織工程產(chǎn)品如生物人工肝等已進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)。組織工程以組織為核心，借助工程學(xué)方法由細(xì)胞重新構(gòu)筑人體組織。組織工程按組織器官構(gòu)筑方式可分為兩個(gè)部分：組織再生工程和組織替代工程。組織再生工程：采用自體細(xì)胞，借助人工細(xì)胞外基質(zhì)，在各種生長(zhǎng)因子的促進(jìn)下使細(xì)胞分裂、增殖、分化，以重新構(gòu)筑患者自己的組織。 95.組織工程的三種基本要素： 細(xì)胞、支架材料

37、與調(diào)節(jié)因子。理想的種子細(xì)胞應(yīng)具備的特點(diǎn):以取材容易而且對(duì)肌體損傷小,體外培養(yǎng)增殖能力強(qiáng),易穩(wěn)定表達(dá)原有功能特性,植入體內(nèi)后能耐受肌體免疫,無(wú)致瘤性等. 細(xì)胞支架材料需要考慮的指標(biāo)：有良好的生物相容性和細(xì)胞親和性、能阻擋外來(lái)組織的侵襲、通暢的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)給、可以控制釋放生長(zhǎng)因子、能滅菌消毒、有利于細(xì)胞大量分泌各種蛋白質(zhì)等，還應(yīng)該具有良好的力學(xué)性能。用于組織工程細(xì)胞支架的生物材料主要有無(wú)機(jī)材料、天然高分子材料和合成高分子材料三大類(lèi). 96、酶的修飾方法: 通過(guò)酶分子的改造或修飾就有可能克服酶在應(yīng)用中的缺點(diǎn)，使酶能發(fā)揮最大的催化效能。分子水平上對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾，如金屬離子置換修飾、大分子結(jié)合修飾、肽鏈

38、有限水解修飾、酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾、氨基酸置換修飾以及物理修飾等。 金屬離子置換修飾是通過(guò)改變酶分子所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法，簡(jiǎn)稱(chēng)離子置換法。 大分子結(jié)合修飾利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能，簡(jiǎn)稱(chēng)為大分子結(jié)合法。 蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)修飾可以改變蛋白質(zhì)表面電荷和疏水性，從而影響其催化活性和穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)修飾的酶可顯著提高酶活力、增加穩(wěn)定性或降低抗原性、顯著提高酶的使用范圍和應(yīng)用價(jià)值。 化學(xué)修飾法是改造酶分子的有效方法，化學(xué)修飾法并不適用于所有的酶，同時(shí)也不是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后，酶所有性質(zhì)都有改善。97.非水系統(tǒng)中的酶催化特點(diǎn)： 絕大多數(shù)

39、有機(jī)化合物在非水系統(tǒng)中進(jìn)行。根據(jù)熱力學(xué)原理，一些在水中不可能進(jìn)行的反應(yīng)，有可能在非水系統(tǒng)中進(jìn)行。與水相比，酶在非水系統(tǒng)中的穩(wěn)定性比較高。從非水系統(tǒng)中回收反應(yīng)產(chǎn)物比從水相中容易。在非水系統(tǒng)中酶很容易回收和反復(fù)使用。 98.影響酶催化反應(yīng)速率的因素: 底物濃度、PH值、酶濃度、溫度,激活劑和抑制劑等.99.酶的來(lái)源和生產(chǎn)： 酶作為生物催化劑普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中。早期酶的生產(chǎn)多以動(dòng)植物為主要來(lái)源。直接從生物體組織經(jīng)過(guò)分離、純化而獲得。微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶，主要有兩種方式：固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵。固體發(fā)酵技術(shù)也稱(chēng)為表面培養(yǎng)或曲式培養(yǎng)。 100.酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)： 反應(yīng)條件溫和極高的催化效率高

40、度專(zhuān)一性(底物專(zhuān)一性。反應(yīng)專(zhuān)一性。立體化學(xué)專(zhuān)一性)。輔酶和輔酶因子。許多酶只有在某些非蛋白質(zhì)成分存在時(shí)才表現(xiàn)出催化作用，人們將這些非蛋白成分稱(chēng)為輔助因子。其中能通過(guò)透析除去的稱(chēng)為輔酶，而不能通過(guò)透析除去的叫做輔基或輔因子。酶催化活性的調(diào)控機(jī)制。 101.為什么要進(jìn)行酶的固定化？ 為了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，人們模仿生物體中酶的作用方式，通過(guò)固定化技術(shù)將酶加以改造固定，使固定化酶具有酶的催化性能，又具有一般化學(xué)催化劑能回收、反復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，并在生產(chǎn)過(guò)程中可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和自動(dòng)化。 102.固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn): 酶固定化的最大特點(diǎn)是既具有生物催化劑的功能,又具有結(jié)合在菌體或細(xì)胞碎片上的酶或酶片. 固定化

41、酶具有以下優(yōu)點(diǎn)：可以重復(fù)多次使用，而且在大多數(shù)情況下，酶的穩(wěn)定性也有明顯改善。催化反應(yīng)后，酶與底物以及產(chǎn)物容易分開(kāi)，產(chǎn)物中沒(méi)有殘留酶，易于分離純化，使產(chǎn)品的質(zhì)量有大的提高。反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)生物催化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)化控制。酶的利用效率高，單位酶量催化的底物量增加，而用酶量則大為減少。比水溶性酶更適合于多酶催化反應(yīng)。 固定化酶也帶來(lái)了一些問(wèn)題和缺點(diǎn)：在固定化過(guò)程中，總是有一部分酶會(huì)失活，其中以共價(jià)鍵法固定時(shí)造成的酶活損失最為嚴(yán)重。酶的固定化將消耗固定化材料，增加酶的成本。酶被固定到載體后將增加底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力。 103.抗體酶：是指通過(guò)一系列化學(xué)與生物方法制備的具有催化活性的抗體。

42、104.酶的活力：是指酶催化特定底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速率，酶活力還常常是制訂酶制劑價(jià)格的最重要的參考指標(biāo)。 酶活力是在規(guī)定的環(huán)境條件下、化學(xué)因素和生物因素下，根據(jù)酶所催化反應(yīng)的初速度而測(cè)定的。酶活力的單位一般是：?jiǎn)挝粫r(shí)間、單位質(zhì)量酶蛋白所催化的底物反應(yīng)或產(chǎn)物生成的物質(zhì)的量（或質(zhì)量）。 105.靶酶：每一種酶都有一些特定的抑制劑，通常將這種酶稱(chēng)為該抑制劑的靶酶。 106.人工合成酶或模擬酶：根據(jù)酶的作用原理，用人工方法合成具有活性中心和催化作用的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物稱(chēng)為人工合成酶或人工模擬酶。 107.核酸酶：具有催化功能的核酸就是核酸酶。可分為:剪切型核酸酶(異體催化剪切型和自身催化剪切)剪接型核

43、酸酶. 108.酶工程主要研究?jī)?nèi)容: 酶的大量生產(chǎn)和分離純化及它們?cè)诩?xì)胞外的應(yīng)用新穎酶的發(fā)現(xiàn),研究和應(yīng)用酶的固定化技術(shù)和固定化酶反應(yīng)器基因工程技術(shù)應(yīng)用于酶制劑的生產(chǎn)及遺傳修飾酶的研究酶分子改造與化學(xué)修飾以及酶的結(jié)構(gòu)功能之間的研究有機(jī)介質(zhì)中酶反應(yīng)的研究酶的抵制劑,激活劑的開(kāi)發(fā)和研究抗體酶,核酸酶的研究模擬酶,合成酶以及酶分子的人工設(shè)計(jì),合成的研究. 109.酶的分類(lèi): 氧化還原酶類(lèi)轉(zhuǎn)移酶類(lèi)水解酶類(lèi)裂合酶類(lèi)異構(gòu)酶類(lèi)合成酶或連接酶. 110.酶的存在類(lèi)型: 酶是具有催化功能的蛋白質(zhì).以單體酶,寡聚酶,多酶復(fù)合體,多酶整合體等. 全酶:指包含輔基的酶. 單體酶:一般由一條肽鏈組成,分子質(zhì)量通常在35K

44、D以下,不含四級(jí)結(jié)構(gòu). 多酶復(fù)合體:由兩個(gè)或兩個(gè)以上的酶靠共價(jià)鍵連接而成. 多酶融合體:是指一條多肽鏈上含有兩種或兩種以上催化活性的酶. 寡聚酶是由兩個(gè)或兩個(gè)以上亞基組成的酶。 111.利用微生物生產(chǎn)酶制劑的突出優(yōu)點(diǎn): 微生物種類(lèi)繁多,制備出的酶種類(lèi)齊全微生物繁殖快,生產(chǎn)周期短,培養(yǎng)簡(jiǎn)便微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力. 微生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶可分為:結(jié)構(gòu)酶和誘導(dǎo)酶. 112.一個(gè)優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的要求: 繁殖快,產(chǎn)酶量高,酶的性質(zhì)應(yīng)符合使用要求菌種不易變異退化,產(chǎn)酶性能穩(wěn)定,不易受噬菌體感染侵襲易于培養(yǎng),能夠利用廉價(jià)的原料進(jìn)行酶的生產(chǎn),且發(fā)酵周期短菌種不是致病菌除了目標(biāo)產(chǎn)物是蛋白酶外,生產(chǎn)其

45、他酶的微生物應(yīng)不產(chǎn)或盡量少產(chǎn)蛋白酶. 113.酶的分離提純: 酶的濃度往往很低細(xì)胞破碎或發(fā)酵液的組成都非常復(fù)雜酶是具有生物活性的蛋白質(zhì),對(duì)環(huán)境條件非常敏感.因此,酶的分離提純一般都在低溫,緩沖中進(jìn)行,無(wú)疑將增加分離成本. 114對(duì)酶催化反應(yīng)速率做出貢獻(xiàn)的主要因素: 鄰近和定向效應(yīng)酸堿催化張變和扭曲效應(yīng)共價(jià)催化多元催化與協(xié)同效應(yīng). 115.固定化酶反應(yīng)器: 根據(jù)進(jìn)料和出料的方式不同,可分為間歇式和連續(xù)式.在研究和生產(chǎn)中必須根據(jù)固定化酶的形狀,底物的物理和化學(xué)性質(zhì),固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué),固定化酶的穩(wěn)定性,操作要求,反應(yīng)器的費(fèi)用等因素為選擇具體的固定化酶反應(yīng)器形式. 116.酶工程的應(yīng)用: 酶法生產(chǎn)高

46、果糖漿酶法合成丙烯酰胺酶法生產(chǎn)L-氨基酸和有機(jī)酸酶法合成半合成抗生素生產(chǎn)的重要中間體酶用于光學(xué)活性化合物的制備酶用于疾病診斷和治療生物傳感器和蛋白質(zhì)芯片酶在基因工程中的應(yīng)用. 117. 酶的固定化方法或技術(shù)： 按所用載體和操作方法的差異，可分為載體結(jié)合法、包埋法和交聯(lián)法等三類(lèi)。載體結(jié)合法包括了物理吸附法、離子結(jié)合法、螯合法和共價(jià)結(jié)合法等，包埋法又包括了聚合物包埋法、疏水相互作用法、微膠囊包埋法、脂質(zhì)體包埋法等。 118.生物傳感器: 是用生物活性物質(zhì)做敏感器件、配以適當(dāng)?shù)膿Q能器所構(gòu)成的分析工具，大致可分為酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、免疫傳感器和?chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器等四大類(lèi)。其中利用酶的催化作用制

47、成的酶?jìng)鞲衅魇菃?wèn)世最早、成熟度最高的一類(lèi)生物傳感器。 119.微生物工程的發(fā)展史： 大約在9000年前就已經(jīng)開(kāi)始了原始的啤酒生產(chǎn)。公元前6000年左右，在黑海與里海間的外高加索地區(qū)，就已經(jīng)開(kāi)始種植葡萄和釀制葡糖酒。在公元前2400年左右，在埃及第五王朝的墓葬壁畫(huà)上，就有烤制面包和釀酒的大幅浮雕。從19世紀(jì)末20世紀(jì)30年代，相繼出現(xiàn)了乳酸。乙醇、丙酮丁醇、甘油、面包酵母等工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品，特別是丙酮丁醇發(fā)酵和甘油發(fā)酵的出現(xiàn)。近30年來(lái)，隨著人類(lèi)在基因水平上改造微生物技術(shù)基因工程、代謝工程、組合生物合成等技術(shù)的突飛猛進(jìn)，發(fā)酵工業(yè)的應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)展，發(fā)酵工程的研究?jī)?nèi)容也日益豐富。 120.微生

48、物純種培養(yǎng)技術(shù)： 在自然環(huán)境中，一種微生物常常和其他微生物相互混雜在一起生活。不同微生物的發(fā)酵或引起的疾病是不同的。所以，要研究某種疾病或者某種發(fā)酵過(guò)程，必須把混雜在一起生活的微生物按種類(lèi)分開(kāi)，并分別進(jìn)行培養(yǎng)，即純種培養(yǎng)。我們今天的所有基礎(chǔ)和應(yīng)用微生物學(xué)研究，都離不開(kāi)培養(yǎng)基、無(wú)菌和純種培養(yǎng)技術(shù)。 德國(guó)醫(yī)生和微生物學(xué)家科赫發(fā)明了固體培養(yǎng)基。采用科赫的劃線分離方法，很容易就能把一個(gè)個(gè)單獨(dú)的菌落挑出來(lái)，得到純種微生物。 英國(guó)醫(yī)生李斯特是第一個(gè)成功地分離出純種細(xì)菌的科學(xué)家. 最早確定發(fā)酵與微生物關(guān)系的著名的微生物學(xué)家巴斯德. 121.常見(jiàn)的工業(yè)微生物： 它們的個(gè)體雖然微小，但由于其群體數(shù)量驚人地龐大，

49、因而具有極強(qiáng)的代謝能力。物體的表面積與體積之比稱(chēng)為比表面積。個(gè)體越小，則比表面積越大，也就是說(shuō)單位體積物體與環(huán)境的接觸面積越大。 比表面積大非常有利于微生物通過(guò)它們的身體表面吸收營(yíng)養(yǎng)和排泄廢物，這就使它們的代謝能力特別強(qiáng)。 由于微生物個(gè)體小、繁殖快、數(shù)量多，使微生物具有分布廣、種類(lèi)多、容易變異、適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)。 微生物代謝能力強(qiáng)、生長(zhǎng)繁殖快的特點(diǎn)使其非常適合于工業(yè)和其他領(lǐng)域。 122.隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃完成及對(duì)疾病引發(fā)機(jī)理的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)許多疾病的發(fā)生都是由于基因突變引起的酶蛋白表達(dá)水平的變化引起的。這樣一來(lái)，只要對(duì)這些酶蛋白的活性水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，就可能治愈疾病。這種對(duì)疾病具有關(guān)鍵作用的酶

50、就是靶酶，篩選得到的能影響和調(diào)節(jié)靶酶活性并能治療疾病的藥物就稱(chēng)為酶標(biāo)藥物。 123.細(xì)菌是單細(xì)胞原核生物，個(gè)體極小，沒(méi)有成型的細(xì)胞核，一般以典型的“一分為二”的繁殖方式繁殖。細(xì)菌根據(jù)外形可以分為球菌、桿菌和螺旋菌(主要是致病菌)三個(gè)大類(lèi)。球菌按其細(xì)胞排列方式又可進(jìn)一步分為單球菌、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌和鏈球菌等。 124.有些細(xì)菌除了具有一般的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物外，還具有一些特殊的結(jié)構(gòu)，如莢膜、芽孢、鞭毛、線毛等。芽孢是細(xì)菌的休眠體。有些桿菌和弧菌還能長(zhǎng)出細(xì)長(zhǎng)的絲狀物，稱(chēng)為鞭毛，主要成分是蛋白質(zhì)。鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官。球菌通常沒(méi)有鞭毛，桿菌中有的有，有的沒(méi)有。弧菌和螺旋菌一般

51、都有鞭毛。除了染色體DNA外，很多細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)還存在染色體外的遺傳物質(zhì)，稱(chēng)為質(zhì)粒。 125.霉菌,比酵母更高級(jí)更復(fù)雜的小型絲狀真菌.有菌絲。霉菌的無(wú)性孢子直接由生殖菌絲分化而形成，常見(jiàn)的有節(jié)孢子、厚垣孢子、孢囊孢子和分生孢子。最后形成一些厚壁的休眠孢子，稱(chēng)為厚垣孢子。 126.霉菌有性孢子是指經(jīng)過(guò)兩性細(xì)胞結(jié)合而形成的孢子。霉菌有性孢子的產(chǎn)生不及無(wú)性孢子那么頻繁和豐富。常見(jiàn)的有卵孢子、接合孢子、子囊孢子和擔(dān)孢子，分別由鞭毛菌亞門(mén)、接合菌亞門(mén)和擔(dān)子菌亞門(mén)的霉菌產(chǎn)生。 127.放線菌是最主要的抗生素產(chǎn)生菌，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的約6000種抗生素中，有4000多種是由放線菌產(chǎn)生的。放線菌也是原核生物，細(xì)胞構(gòu)造

52、和細(xì)胞壁的化學(xué)組成都與細(xì)菌類(lèi)似，因其菌落呈放射狀而得名。 128.酵母的生長(zhǎng)特性：絕大多數(shù)酵母菌都是單細(xì)胞，但是體積比細(xì)菌要大得多，一般呈球形、卵形或檸檬行。出芽生殖是酵母菌中常見(jiàn)的生殖方式之一。有些酵母細(xì)胞也能以與細(xì)菌類(lèi)似的裂殖方式來(lái)產(chǎn)生后代。這兩種生殖方式都是無(wú)性繁殖。很多酵母還能通過(guò)產(chǎn)生囊孢子的形式進(jìn)行有性繁殖。酵母在自然界中分布很廣，尤其喜歡在偏酸性且含糖較多的環(huán)境中生長(zhǎng)。酵母與我們的生活密切相關(guān)，很多人幾乎天天都在享受著酵母的勞動(dòng)成果。每天吃的面包或饅頭，常喝的啤酒、葡萄酒等各種酒類(lèi)飲料，都是由酵母菌參與制造的。酵母還可以用來(lái)生產(chǎn)維生素、甘油和酶制劑。 129.真菌和細(xì)菌,放線菌最根

53、本的區(qū)別,是真菌已經(jīng)有了真正的細(xì)胞核.因此人們把真菌的細(xì)胞叫真核細(xì)胞. 130.誘變育種 誘變育種是最常見(jiàn)的微生物育種技術(shù)，在發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展過(guò)程中做出了重大的貢獻(xiàn)，而且至今仍被廣泛使用。誘變育種的基本原理是利用一些物理或化學(xué)的因素處理微生物細(xì)胞，使其遺傳性狀發(fā)生隨機(jī)的突變，得到大量性狀各異的突變株，然后再?gòu)谋姸嗤蛔冎曛幸砸欢ǖ姆椒êY選出生產(chǎn)性能改善的個(gè)體。用于處理微生物以使其發(fā)生突變的物理或化學(xué)因素稱(chēng)為誘變劑。常用的誘變劑可以分為物理誘變劑和化學(xué)誘變劑兩大類(lèi)。紫外線是最常用的,最安全的誘變劑之一. （物理誘變劑: 紫外輻射。電離輻射。化學(xué)誘變劑：堿基類(lèi)似物。羥化劑。脫氨劑。烷化劑。誘發(fā)移碼突變

54、的誘變劑。P141）紫外線是最常用的，也是最安全的誘變劑之一。需要特別強(qiáng)調(diào)的是，可以引起微生物DNA發(fā)生突變的誘變劑往往也能造成人和動(dòng)物的DNA發(fā)生變異。經(jīng)過(guò)誘變處理后，變異細(xì)胞一般只占存活細(xì)胞的百分之幾甚至更低。 131.代謝工程：又稱(chēng)代謝途徑工程或途徑工程，是基于代謝流分析和基因重組技術(shù)改善菌株遺傳性狀的一種先進(jìn)的工程技術(shù)。 132.DNA重排:是20世紀(jì)90年代后期發(fā)展起來(lái)的一種體外定向進(jìn)化技術(shù).基本原理:是首先將同源基因切成隨機(jī)DNA片段,然后進(jìn)行PCR重聚. 133.基因組重排育種 在DNA重排的基礎(chǔ)上,21世紀(jì)初又出現(xiàn)了基因組重排技術(shù).基因組重排技術(shù)可以用來(lái)改造細(xì)菌的基因組,實(shí)現(xiàn)表

55、型的改良.經(jīng)典雜交育種在每一代只有兩個(gè)親本進(jìn)行重組,而重排技術(shù)則具有多親本雜交的優(yōu)勢(shì). 134.工業(yè)發(fā)酵過(guò)程: 原料預(yù)處理培養(yǎng)基配制發(fā)酵設(shè)備和培養(yǎng)基的滅菌無(wú)菌空氣的制備菌種的制備和擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)品的分離和純化.135.發(fā)酵過(guò)程的操作方式 可以將工業(yè)發(fā)酵分為三種模式，即間歇發(fā)酵(也稱(chēng)分批發(fā)酵或批式發(fā)酵)、連續(xù)發(fā)酵和流加發(fā)酵。 間歇發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、不容易染菌、投資低。缺點(diǎn):是生產(chǎn)能力和效率低,勞動(dòng)強(qiáng)度大,而且每批發(fā)酵的結(jié)果都不完全一樣,對(duì)后續(xù)的產(chǎn)物分離將造成一定的困難. 微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線:遲滯期,指數(shù)特長(zhǎng)期,過(guò)渡期,穩(wěn)定期,死亡期. 當(dāng)微生物從種子罐接種到發(fā)酵罐后，位了適應(yīng)新的環(huán)境需

56、要一段緩沖期，稱(chēng)為遲滯期. 連續(xù)發(fā)酵:指在發(fā)酵過(guò)程中向生物反應(yīng)器連續(xù)地提供新鮮培養(yǎng)基并排出發(fā)酵液的操作方式. 優(yōu)點(diǎn):可以長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)行,生產(chǎn)能力可以達(dá)到間歇發(fā)酵的數(shù)倍.缺點(diǎn):長(zhǎng)期連續(xù)操作時(shí)雜菌污染的控制和微生物菌種的變異. 流加發(fā)酵是介于間歇發(fā)酵與連續(xù)發(fā)酵之間的一種操作方式。流加發(fā)酵的特點(diǎn)：在流加階段按一定的規(guī)律向發(fā)酵罐中連續(xù)地補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物和或前體，由于發(fā)酵罐不向外排放產(chǎn)物，罐中的發(fā)酵液體積將不斷增加，直到規(guī)定體積后放罐。流加發(fā)酵適合于細(xì)胞高密度培養(yǎng)。 136.發(fā)酵產(chǎn)品的特點(diǎn): 分類(lèi):能量代謝或初級(jí)代謝產(chǎn)物及次級(jí)代謝產(chǎn)物. 特點(diǎn):產(chǎn)物濃度低,組成復(fù)雜,許多具有生物活性的產(chǎn)物對(duì)溫度,PH值,離子強(qiáng)度

57、及剪切力等敏感,對(duì)最終產(chǎn)物的純度和安全性要求高,特別是用于醫(yī)藥及食品的產(chǎn)品. 137.生物反應(yīng)器: 指用以進(jìn)行生物催化反應(yīng)的反應(yīng)器.按生物催化劑的不同,分為細(xì)胞反應(yīng)器和酶反應(yīng)器.細(xì)胞作為生物催化劑的最大特點(diǎn)是細(xì)胞能夠不斷生長(zhǎng),處于不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞具有不同的性質(zhì)和功能. 138.發(fā)酵工業(yè)用的生物反應(yīng)器滿足的基本要求: 反應(yīng)器內(nèi)混合均勻,流體剪切適宜;為了給細(xì)胞生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物合成提供最佳的環(huán)境條件,需要能夠?qū)Πl(fā)酵罐中的PH值,溫度,溶氧,氧化還原勢(shì),攪拌槳轉(zhuǎn)速及液位等參數(shù)進(jìn)行測(cè)量和控制;必須防止雜菌污染發(fā)酵液,維持純種培養(yǎng);能夠適應(yīng)市場(chǎng)變化的需要,適合于多種發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn);盡能提高機(jī)械化和自動(dòng)化水平,減輕按勞動(dòng)強(qiáng)度. 139.生物反應(yīng)器的類(lèi)型： 攪拌罐鼓泡塔氣升式反應(yīng)器流化床反應(yīng)器和填充床反應(yīng)器。 140.發(fā)酵過(guò)程的檢測(cè)和控制： 過(guò)程參數(shù)的測(cè)量與操作變量的調(diào)節(jié).過(guò)程的模型化與控制策略.環(huán)境參數(shù)方面，PH值、溫度、溶氧值、出口CO2濃度和部分底物或產(chǎn)物的在線測(cè)量技術(shù)也已基本成熟，有望在短期內(nèi)應(yīng)用。操作變量方面，攪拌速度、通氣量、冷卻水流量、罐壓、酸堿泵流速、流加速率等