癌癥診斷芯片的癌睪丸基因的寡核苷酸探針的設(shè)計

1、四JS川ich大uan學(xué)U學(xué)niv報(Med醫(yī)Sc掌E版di2009;4。(2:330一333i一。癌癥診斷芯片的癌一睪丸基因的寡核苷酸探針的設(shè)計*劉麗1,丁洪2,劉丹1,陸群1,Sophie Rousseaux3,吳芳1I.西南交通大學(xué)生物工程學(xué)院(成都610031I 2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院3.French National Institude for Health and Medleal Research(INSERM.U823。Grenoble F-38706.France【摘要】 目的 設(shè)計用于專門進行腫瘤內(nèi)睪丸特定基因癌一睪丸(cancer-testis,CT基因轉(zhuǎn)錄分析的微陣。Ol

2、igonucleotide PropertiesCalculator寡核苷酸性質(zhì)計算軟件”和。OligoAnalyzer 3.0”檢測探針的解鏈溫度(Tin、【關(guān)鍵詞】癌一睪丸基因 寡核苷酸探針探針設(shè)計微陣列【中圖分類號】Q78Design of Oligonuleotide Probesfor Cancer-testis Genes for CancerDiagnosis MicroarrayLI己,Lil.DING I-lon92,LJL,Danl,LUQunl.ROUSSEAUX Sophie3。WU Fan91. 1.College of Bioengineering,Southwes

3、t Jiaotong University.Chengdu 610031.China;2.WeSt China School of Pharmacy.SichuanIniversity.Chengdu 610041, China;3.French National lnstitude for Health and Medical Research(JNSERM,U823,Grenoble F-38706.FraneeAbstractObjectlveTo design oligonucleotide probes for Cancer-testis(CTgenes foramicroarray

4、,whichwill be dedicated tO atranscriptomic analysis of testis-specific genesin tumors and elucidation of the role of CT genesin theprocessoftumorigenesis.Methods The oligonucleotide probesfor CTgenes were designedthroughacombination of tWOprobe designing tools available online.IDT and MEDlANTE.The“O

5、ligonucleotide PropertiesCalculator”and。OligoAnalyzer 3.0”were applied tO check the probe properties.including melting temperature.Gccontentand secondarystructureforming possibilities etc.ResultsA total of 113of 50met oligonucleotide probeswere successfully designed for the 44families of CT genes.Th

6、e probes hadanarrow range of Tm values between63.2and 67.5andGC%contents between 35.3%and 51.5%.Conclusion The combinativeuseof the tWOprobe designing tools.IDT and MEDIANTE,can successfully design oligonucleotide probes for cancer-testis genes.Key wordsCancer-testisgene0ligonucleotide probes Probe

7、design Mieroarray癌一睪丸(cancer-testis,CT基因,在睪丸中能 夠正常特異性表達,在體細胞組織中受到抑制,而在 一些腫瘤中異常表達。由于大多數(shù)CT基因在癌癥 患者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫響應(yīng),因此又被命名為“癌一 睪丸(CT”抗原1。目前大約已鑒別了44個CT 抗原家族成員,但它們在腫瘤發(fā)生過程中所發(fā)揮的 作用還有待研究2。這種睪丸特異基因在腫瘤中的 異常再表達,是癌細胞中基因表達整體反常的結(jié)果, 也可被用作癌組織中整個基因組表達失調(diào)的“傳感 器”?；蛐酒?gene chip,又稱DNA微陣列,其基 本原理是通過雜交檢測DNA信息,即樣品DNA/RNA通過PCR/RTP

8、CR擴增后用熒光標(biāo)記,當(dāng)帶 有熒光標(biāo)記的樣本核酸序列與基因芯片上對應(yīng)位置法中科學(xué)及應(yīng)用基金(FFCSA20052006資助 Corresponding author-E-mail:wufangll126.C01的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時,通過確定熒光強度最 強的探針位置,獲得一組序列完全互補的探針序列, 據(jù)此可重組出表達最強的靶核酸的序列并同理獲得 樣品中與芯片探針互補的其他基因序列及表達的信 息3。利用基因芯片,可以對生物細胞或組織中大 量的基因信息進行分析,實現(xiàn)基因信息的大規(guī)模檢 測。芯片設(shè)計的主要任務(wù)是根據(jù)芯片功能的要求設(shè) 計探針,并構(gòu)建探針陣列。本研究采用IDT和 MEDIANTE軟件設(shè)

9、計了CT基因的50mers左右 的寡核苷酸探針,這些探針可用于制備CT基因微 陣列,專一性探測腫瘤細胞或腫瘤組織樣本中CT 基因的表達,進而用于癌癥診斷。1資料與方法1.1資料CT基因數(shù)據(jù)庫通過CT基因數(shù)據(jù)庫|及其鏈接網(wǎng)頁如NCBI,Ensembl,SwissProt,癌免疫萬方數(shù)據(jù)人們常常把腫瘤與 混為一談,認(rèn)為腫瘤就是癌癥,癌癥就是腫 瘤,其實兩者有根本的不同。腫瘤包括良性腫瘤和惡性腫瘤兩類,惡性 程度介于兩者之間的又稱為 “ 交界瘤 ” ,所以腫瘤不等于癌癥。生長于上皮組織的惡性腫瘤稱為 “ 癌 ” 。所謂上皮組織,是指分布在 人體表面和人體內(nèi)所有的空腔臟器,如空腔、食管、胃、腸管等 “

10、 的細 胞,這些器官如有惡性腫瘤生長,則分別稱為口腔癌、食管癌、胃癌、 腸癌等。凡是人體結(jié)締組織如脂肪、肌肉、骨骼、淋巴、造血組織等發(fā)生的 惡性腫瘤,統(tǒng)稱為 “ 肉瘤 “ ,如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、骨肉瘤、淋巴肉 瘤等。人們常易把良性腫瘤和惡性的肉瘤的稱呼相混淆,如脂肪瘤、平滑 肌瘤等都是良性腫瘤。可是一旦在它們的名字間加上一個 “ 肉 ” 字,如脂 肪肉瘤、纖維肉瘤等就是惡性腫瘤,別看是一字之差,卻謬之千里, 是 良惡之分。所以,把肉瘤當(dāng)成良性腫瘤就大錯特錯了。另有一類來源于多種組織成分的惡性腫瘤,既不稱癌也不叫肉瘤, 而是在前面加上 “ 惡性 ” 兩字,如惡性混合瘤等。凡是來自胚胎細胞或未

11、成熟組織的惡性腫瘤,均稱為 “ 母細胞瘤 ” ,如肝母細胞瘤及髓母細胞瘤 等。此外,還有少數(shù)惡性腫瘤仍然沿用習(xí)慣名稱,如霍奇金病、非霍奇 金病、白血病及黑色素瘤等。因此,惡性 腫瘤 也不都叫 “ 癌 ” 。醫(yī)學(xué)對良性腫瘤的命名原則是在發(fā)生部位名稱后面加上一個 “ 瘤 ” 字,如發(fā)生在膀胱的腫瘤形狀像乳頭,就取名為 “ 膀胱乳頭狀瘤 ” 。若腫 瘤來源于結(jié)締組織就直接在組織名稱后面加上 “ 瘤 ” 字,如纖維瘤、脂肪 瘤及血管瘤等。正所謂良惡有別,不可混稱。另外,處于良惡性之間的腫瘤難以確定是真正的良性還是惡性, 這 第三種腫瘤, 人們稱之為 “ 中間性腫瘤 ” , “ 交界性腫瘤 ” 、 “

12、境界瘤 ” 、 “ 潛 在惡性瘤 ” 、 “ 半惡性腫瘤 ” 等,較多稱之為 “ 交界瘤 ” 。交界瘤的特點:1 腫瘤細胞的形態(tài)介于良性、 惡性之間, 因此在病理學(xué)的診斷上存在分歧, 臨床上也形成兩派,這正是它分化不典型的特性所在。 2生長方式上 有局部擴散的傾向,常規(guī)按良性腫瘤做局部切除后往往容易局部復(fù)發(fā), 但卻不發(fā)生轉(zhuǎn)移, 或極少有轉(zhuǎn)移, 或即使出現(xiàn)局部轉(zhuǎn)移, 仍然進展緩慢, 對病人威脅不大。實際表現(xiàn)有局部擴散或偶有轉(zhuǎn)移,或者細胞形態(tài)符合 惡性,但沒有明顯的擴散轉(zhuǎn)移等惡性表現(xiàn)。惡性腫瘤通常生長迅速,呈浸潤性生長,可破壞周圍組織,無包膜 或僅有假包膜,腫瘤分化差,組織及細胞形態(tài)與其相應(yīng)的正常

13、組織差甚 遠, 顯示異形性, 排列擾亂, 細胞核形狀不規(guī)則, 常有不同程度的深染, 核仁增大增多,并出現(xiàn)病理性核分裂像;腫瘤內(nèi)多出現(xiàn)繼發(fā)性改變, 如 出血、壞死、囊性變及感染等。手術(shù)切除后常復(fù)發(fā),并容易轉(zhuǎn)移,對周 圍組織造成廣泛破壞。如不及時治療,常導(dǎo)致死亡。組數(shù)據(jù)庫Cancer Immunome Database(CID或者 LICR轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得一系列信息,如基因結(jié)構(gòu), 染色體定位,蛋白質(zhì),癌癥患者的免疫反應(yīng)性和 mRNA表達等。CT基因的44個家族成員信息均 包含在該基因數(shù)據(jù)庫中,見表l。裹1CT基因的“個家族成員(部分 Table 144families of CT genes(in

14、 partCT基因的RefSeq號,我們在NCBI基因庫53中選 擇性地獲取了CT基因的一些用于探針設(shè)計的重要 特性參數(shù),如C丁基因在染色體上的定位,mRNA 的長度,編碼區(qū)的范圍等,見表2。并獲得了CT基 因編碼序列信息(CDS且以FASTA文本文件格式 保存該序列用于探針設(shè)計。表2四基因的部分特征參數(shù)Table 2Some characteristic parameters of CT genes(in part1.2探針設(shè)計工具與方法采用MEDIANTE進行寡核苷酸探針的設(shè)計, 以C丁基因SAGE為例,首先,從CT基因庫中獲得 sAGE的編碼NM 018666后輸入MEDIANTE, 從

15、MEDIANTE可以獲得9個候選的設(shè)計探針及其 性能,包括Tm,5端的位置等等,見表3。從 MEDIANTE我們還可以直接獲得每個候選探針 BLAST結(jié)果的柱狀圖以進行同源性分析。根據(jù)1. 2.1的設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)并同時避免具有顯著同源性的序列 后,我們發(fā)現(xiàn)候選探針6是9個候選探針中特異性 最高的探針,即它可以高度識別靶基因,而對其他非 靶基因的錯配程度低,在柱狀圖中表現(xiàn)為BLAST 匹配期望值(except value=10的欄較高,而其他萬方數(shù)據(jù) 四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）年第卷第期 值（， ）欄較低的探針。探針 離端位置，位于編碼區(qū)（的 長度為 ，編碼區(qū)位于 ），為。如將探針與 探針比較， 由獲得的

16、 匹配期望值比對圖譜在期望值一的欄更 高，見附圖，與其他探針比較依然如此（圖略）。另 衷 外，還可以用在線生物信息學(xué)工具”寡核苷酸性質(zhì)計 算 軟件” （ ），檢測探針的其他性質(zhì)，如含量和 可能的發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，確定最佳的寡核苷酸探針。候 選探針的含量是，在范圍 內(nèi)，潛在的發(fā)卡形成結(jié)構(gòu)只有 ，少于 ，因此 選擇候選探針作為優(yōu)化的設(shè)計探針。 由設(shè)計的基因候選寡核苷酸探針殛其性質(zhì) 附圈 由設(shè)計的基因候選寡核苷醴探針殛的趼匹置期望值比對田譜 探針設(shè)計工具 探針設(shè)計工具 工具進行同源性分析，最佳探針的非靶基 因互補性應(yīng)少于。 用于提供寡核苷酸序列上的信息查詢以 及探針的設(shè)計。同樣以基因為例，根 據(jù)輸入的序列

17、，可以利用設(shè)計工具獲 得一個寡核苷酸探針，（ 網(wǎng)站的工具 用網(wǎng)站 中的程序可以對設(shè)計的寡核苷酸探針進行 同源性檢索。一般情況下從數(shù)據(jù)庫中可檢 索到一批與待分析序列同源的序列。對于 基因，如果該探針檢測出的同源序列為癌癥或睪丸 相關(guān)基因序列，則可認(rèn)為其為較好的探針，如果與其 他非靶基因的互補性高于，且連續(xù)互補片段長 度超過 ，則可認(rèn)為該探針設(shè)計不合適，需要重 ），其端位置在，含量為 ，值為。然后，公司提供的“ ”檢測二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)等其他性質(zhì)。 然后將所有設(shè)計的探針都通過網(wǎng)站的 萬方數(shù)據(jù) （ ） 新設(shè)計探針。 設(shè)計。最后成功設(shè)計了個寡核苷酸探針，探針 序列的長度在個核苷酸之間，他們具有狹窄 的值

18、范圍（）和含量 （）。設(shè)計的部分寡核苷酸探針序列 和所設(shè)計探針的部分性質(zhì)，包括和含量，見 表。 結(jié)果與討論 首先用為基因的個家族成員設(shè)計 了 左右的探針。對于不能設(shè)計候選 探針的一些基因，用另一種工具 裹為基因的“個家族成員設(shè)計的部份寡核苷酸探針 （ ） 微陣列技術(shù)對于在一個小的玻片上同步 分析多個基因提供了一個有力的工具，也可以在一 個陣列中同步檢測許多不同的靶序列。因 此，設(shè)計一個微陣列，對于在腫瘤中同步分析 基因的表達是非常重要的。探針的選擇決定了 微陣列數(shù)據(jù)的質(zhì)量。數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度也隨著被測基因 所選的寡核苷酸序列的特異性增加而增加。因此保 證探針的高特異性非常重要。 為微陣列設(shè)計的寡核苷

19、酸探針，其原序列位于 丁基因的編碼區(qū)。由個探針 組成的探針系列，靶向、 等已知基因。由于提高探針的靈敏度和 提高特異性經(jīng)常是兩個相矛盾的目標(biāo)，所以探針的 設(shè)計是一個組合優(yōu)化問題。在我們的探針設(shè)計中。 有時必須作出折衷處理，尤其應(yīng)用的 時候，我們需要選取一種最佳探針，首選位于 編碼區(qū)，且通過柱狀圖選擇可以高度識別靶基因，而 對其他非靶基因錯配程度低的、特異性程度高的探 針。當(dāng)考慮特異性的時候，探針的第二佳選擇是與 相關(guān)的非靶基因的錯配盡可能地位于中心，而不能 位于分子的兩端，這是因為位于短的雙鏈末 端的錯配將很難再打開?？紤]到靈敏度問題，我 們還應(yīng)用寡核苷酸性質(zhì)計算軟件或提供的 軟件，研究了其二

20、級結(jié)構(gòu)的形 成。具有強的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體、凹環(huán)或凸環(huán)結(jié)構(gòu)的 寡核苷酸探針不夠理想，若其他探針能夠被設(shè)計的 話，將不予考慮。適宜的標(biāo)準(zhǔn)是：寡核苷酸探針中可 能的發(fā)夾或二聚體形成結(jié)構(gòu)小于 。而且由于 微陣列上所有的寡核苷酸都要在相同雜交條件下完 成，所以它應(yīng)該與其他探針擁有幾乎相同的值， 本研究中設(shè)計的探針序列的長度在個核苷 酸之間，他們具有的相對狹窄的 范圍。 與探針設(shè)計軟件比較，用軟 件設(shè)計探針的優(yōu)點是該軟件提供了 軟件，可以在線分析寡核苷酸探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、 二聚體、凹環(huán)或凸環(huán)結(jié)構(gòu)的形成情況。但其缺點是 步驟較繁瑣，需要申請帳號查詢設(shè)計的探針且最后 獲得的探針需要到的網(wǎng)站檢測同源 性，對于一些

21、對非靶基因錯配程度高的探針還需要 用借助其他軟件或數(shù)據(jù)庫如進行補充 設(shè)計。而的優(yōu)點是綜合了功 能，能進行在線和本地數(shù)據(jù)庫序列比對，通過考慮 結(jié)果，在設(shè)計探針時避免了交叉同源性，得 到的探針具有很強的特異性。該工具速度快，可在 幾秒鐘內(nèi)設(shè)計出合適的探針，因此可以大大節(jié)省探 針設(shè)計的時間和工作量。但其缺點是無法在該網(wǎng)站 上分析寡核苷酸探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二（下轉(zhuǎn)第頁） 萬方數(shù)據(jù) 四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）年第卷第期 在或多或少的一些差異，只要不是存在酶活性全或無的差 異活性的高低是可以通過豬到人肝臟移植術(shù)后的藥物濃度 監(jiān)測、調(diào)整給藥方案予以彌補的。另外也要考慮到藥物在體 內(nèi)的代謝除與肝內(nèi)藥物代謝酶活性有關(guān)外，還與肝臟器系 數(shù)、肝血流量及藥物在體內(nèi)的儲存形式有關(guān)。已知豬的肝臟 器系數(shù)為人為體質(zhì)量相近的豬與人肝血流 分別為、 。當(dāng)豬肝臟移植到人其血流量也 可能發(fā)生相應(yīng)的變化，這些因素均會影響到藥物的代謝速 莫崗，錢元恕，王其南等培氟沙星對大鼠肝微粒體酶的抑 制作用新藥與臨床，（）， ， 一 ， ， （） 張芳芳，鄭一凡，?；劬甑壬侥畏雍烷纹に貙Υ笫蠹毎?酶活性的影響浙江大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），（） 度，因此還有待進一步的研究來揭示