生物技術(shù)的免疫原性和免疫毒性

1、生物技術(shù)藥物的免疫毒性和免疫原性研究Kaiyong LIU 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)藥物 生物技術(shù)藥物 包括體內(nèi)診斷、治療與預(yù)防用途； 來源于細(xì)菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 蛋白質(zhì)、多肽及其衍生物、核酸 如細(xì)胞因子、生長因子、融合蛋白、酶、激素、單抗、載體等 特殊性 結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)工藝、保存條件、同源性、作用靶點(diǎn)明確等固有的特點(diǎn)免疫毒性/免疫原性 免疫毒性 是指受試品引起免疫抑制或增強(qiáng)、過敏反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)，可能與藥理活性相關(guān)（如抗排斥藥物）或不相關(guān)（如部分抗腫瘤藥物）。 免疫原性 指藥物刺激機(jī)體形成特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的性質(zhì)。 研究意義 意義重大：如 免疫抑制，感染，腫瘤 免疫增強(qiáng)，放大

2、自身免疫反應(yīng)或過敏反應(yīng)。 免疫原性，是藥物本身具有的性質(zhì)，有免疫原性不一定導(dǎo)致毒性，但可以影響對藥物毒性、毒代或藥效的客觀評價(jià)。 但在規(guī)范及指導(dǎo)原則方面，缺乏共識，實(shí)驗(yàn)方法也不統(tǒng)一免疫毒性研究內(nèi)容一 常規(guī)的免疫毒性指標(biāo)包括： 白細(xì)胞總數(shù)及其分類計(jì)數(shù) 球蛋白和白/球比值 補(bǔ)體水平 淋巴器官/組織的大體解剖 胸腺和脾臟的器官重量 免疫病理：胸腺、脾臟、引流淋巴組織免疫毒性研究內(nèi)容二 額外的免疫毒性試驗(yàn)（additional studies），如 (1) 常規(guī)免疫毒性檢測結(jié)果提示免疫毒性，感染 (2) 受試品的結(jié)構(gòu)，與已知免疫調(diào)節(jié)劑相似 (3) 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果:原型藥或代謝產(chǎn)物在免疫組織 蓄積 (4

3、) 適應(yīng)癥:如用于抗HIV藥物 (5) 藥理作用：常對免疫系統(tǒng)有影響常規(guī)的免疫毒性檢測結(jié)果 引流淋巴組織檢查圖猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后回腸粘膜下集合淋巴小結(jié)：對照組，：高劑量組常規(guī)的免疫毒性檢測 免疫抑制/增強(qiáng) 全血細(xì)胞變化、白細(xì)胞變化或淋巴細(xì)胞變化等。 免疫器官重量改變或組織學(xué)檢查顯示相關(guān)器官或組織細(xì)胞密度變化 血清免疫球蛋白變化 用藥組感染發(fā)生率升高 用藥組腫瘤發(fā)生率增多(除遺傳毒性、激素效應(yīng)或肝酶誘導(dǎo)外)額外的免疫毒性試驗(yàn)內(nèi)容 免疫功能檢測 如T細(xì)胞依賴的抗體反應(yīng)、NK細(xì)胞活性、CTL活性、細(xì)胞因子表達(dá)、巨噬細(xì)胞/中性粒細(xì)胞功能、皮膚超敏反應(yīng)、宿主抵抗力研究） 免疫表型檢測 依

4、據(jù)免疫學(xué)理論和具體靶分子種類額外的免疫毒性試驗(yàn)方案 增設(shè)衛(wèi)星組、增加免疫學(xué)指標(biāo)或改變給藥方案等。 發(fā)育免疫毒性：在成年動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)免疫抑制作用后，需要評價(jià)發(fā)育免疫毒性作用，如觀察母代暴露于藥物后仔代的淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、細(xì)胞因子等，兩種以上功能檢測等。不僅是免疫抑制！ 常規(guī)階梯或分層或標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合不一定合理，需個(gè)體化額外的免疫毒性試驗(yàn)方法 免疫功能檢測 Macrophage/Neutrophil熒光標(biāo)記的膠珠觀察phagocytosis等 NK反映天然免疫功能TDARSRBC or 鑰孔血藍(lán)蛋白 (KLH），用ELISA等CTL51Cr釋放法，ELISPOT法CytokinesELISA法及胞內(nèi)

5、細(xì)胞因子檢測額外的免疫毒性試驗(yàn)方法 免疫功能檢測hypersensitivity目前預(yù)測IV型變態(tài)反應(yīng) Buehler試驗(yàn)、豚鼠最大化試驗(yàn)（GPMT）、小鼠耳腫脹試驗(yàn)、小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)autoimmunity PLNA（報(bào)告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin） host resistance 抗感染或抗腫瘤發(fā)生（整體，必要時(shí)）注：GPMT與人一致性約70%，LLNA約72% 額外的免疫毒性試驗(yàn)方法 免疫表型檢測 常用流式細(xì)胞儀檢測，檢測表達(dá)水平和比例 SurfacemarkersIg+PanB cellsThy 1.2+ or CD3+ Pan T cells、

6、CD4+CD8-T Helper/delayed-type hypersensitivity cellsCD8+CD4-T Suppressor-cytotoxic cellsCD8+CD4+ Immature T cells免疫功能檢測 分泌IFN細(xì)胞圖猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后外周血p24特異性的分泌IFN的淋巴細(xì)胞數(shù)量 免疫細(xì)胞表型檢測 CD22陽性比例圖 食蟹猴靜脈注射SM03嵌合抗體后CD22標(biāo)記陽性細(xì)胞率的變化 CD22陽性細(xì)胞比例（%）免疫細(xì)胞表型檢測 CD4/CD8比例CD4/CD8比例圖 獼猴iv 4周 LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例免疫毒性試驗(yàn)結(jié)果分

7、析 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與生物學(xué)意義（尤其單一指標(biāo)） 變化程度 與劑量/暴露關(guān)系 與擬用臨床劑量的關(guān)系 療程關(guān)系 涉及動(dòng)物種屬數(shù)量和受影響的終點(diǎn) 可能繼發(fā)于其他因素 (e.g., stress,） 可能的細(xì)胞靶點(diǎn)和（或）作用機(jī)制 引起這些變化的劑量與產(chǎn)生其他毒性的劑量關(guān)系 可逆性免疫毒性靶器官的分析線索 靶分子在免疫器官或組織的分布 受試品或其代謝產(chǎn)物的分布 相關(guān)指標(biāo)的變化 常規(guī)免疫指標(biāo)、細(xì)胞因子變化等。免疫毒性機(jī)制推測 受體或藥靶直接引起的毒性反應(yīng)（on-target) 如干擾素引起骨髓抑制 受體或藥靶介導(dǎo)的間接毒性反應(yīng) 如rhIL-12能誘導(dǎo)干擾素的分泌 非特異機(jī)制 如rhTNK-tPA引起肝細(xì)胞劑

8、量依賴性的脂肪變性。免疫原性研究內(nèi)容 免疫原性(immunogenicity) 指誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原(immunogen）。產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞能力。 影響因素 分子大小，10 000，5 00010 000，1000 5000 分子結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)多糖核酸類脂 宿主因素、免疫方式免疫原性研究意義 免疫原性影響重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果的分析：中和藥物活性、改變藥物的清除、半衰期和組織分布 （neutralize drug activity and alter drug clearance, plasma half-life, and tissue dist

9、ribution） 建立免疫分析方法，供臨床試驗(yàn)應(yīng)用免疫原性研究內(nèi)容 抗體檢測方法學(xué)驗(yàn)證 免疫反應(yīng)檢測 抗體滴度、抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化、抗體的中和活性、。 抗體與藥代/藥效和安全關(guān)系的評價(jià) 同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應(yīng)的變化、補(bǔ)體激活與否、免疫復(fù)合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等抗體檢測方法 ELISA-橋法 包被藥物，用標(biāo)記的藥物檢測。 ELISA-直接法 包被藥物，用標(biāo)記抗體檢測。 （缺點(diǎn)：包被時(shí)可能會(huì)掩蓋或改變藥物的表位，僅檢測單一亞型，有種屬特異性，多次洗滌時(shí)丟失低親和力抗體，參考品與樣本之間試劑可能不同）抗體檢測方法 間

10、接法 包被單抗或生物素，再加藥物。 放射免疫沉淀法（RIP） 液相法，中等或高通量水平 表面等離子體共振 液相法，不需結(jié)合物（酶標(biāo)記抗體），能檢測到不同親和力的抗體和各亞型抗體 電化學(xué)發(fā)光法 液相法，可檢測各種抗體亞型抗體檢測方法考察 方法學(xué)考察靈敏度：500-1000ng/ml，低滴度抗體檢出受試物干擾：如有文獻(xiàn)報(bào)道，如血清中受試物濃度大于0.15g/ml，則難以檢測到抗受試物抗體。一般從1：10開始稀釋或?qū)悠愤M(jìn)行處理。長效?精確度：利用陽性對照品重復(fù)測量 陰性對照血清一般需從15只動(dòng)物或50人中抽取免疫復(fù)合物在肝腎的沉積：溶劑對照組猴腎組織：重組葡激酶大劑量組腎組織圖獼猴圖獼猴iviv重

11、組葡激酶周后腎組織的免疫組織化學(xué)染色重組葡激酶周后腎組織的免疫組織化學(xué)染色抗體檢測結(jié)果描述 抗體滴度結(jié)果表示 數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，取對數(shù)后達(dá)正態(tài)分布，需用幾何均數(shù)表示 抗體檢測結(jié)果 抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化抗體中和活性檢測 常用依賴細(xì)胞株 抗病毒致細(xì)胞病變（CPE） 克隆細(xì)胞株 靶基因檢測等。 游離或與抗體結(jié)合的受試品對中和活檢測的干擾（偶聯(lián)抗體的瓊脂糖凝膠珠吸附）抗體中和活性的檢測 CPE法圖 猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后血清對 HIV-1 HN 024的中和活性抗體中和活性檢測方法 靶基因表達(dá)抗體產(chǎn)生對藥效相關(guān)指標(biāo)的影響圖 注射表達(dá)EPO基因裸質(zhì)粒

12、8周后貧血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的檢測抗體產(chǎn)生對藥代的影響 臨床上連續(xù)應(yīng)用重組水蛭素5以上可使74%的患者產(chǎn)生抗水蛭素抗體（AHAb）?？贵w產(chǎn)生對藥代的影響0481317210.010.1110TPO ( ng / mL）-)時(shí)間時(shí)間 (天天 )圖 猴皮下連續(xù)注射rhTPO 2 g.kg-1.d-120 d后血清rhTPO濃度(實(shí)測值和抗體滴度(, 血清稀釋倍數(shù)的倒數(shù)）抗體產(chǎn)生對毒性反應(yīng)的影響對照組10ug/kg30ug/kg90ug/kg02468101214161820指標(biāo)組別 WBC（ x109) Ab titer ED50(IU/ml) 圖 食蟹猴sc 2周和4周PEG-IF

13、N后白細(xì)胞計(jì)數(shù)、抗體滴度和血清中和活性 對照組10ug/kg30ug/kg90ug/kg024681012141618707274指標(biāo)組別 WBC（ x109) Ab titer ED50(IU/ml) *中和抗體產(chǎn)生對給藥方案的意義 中和抗體影響了大多數(shù)動(dòng)物的藥理和（或）毒性反應(yīng)，則可以考慮終止給藥。 中和抗體水平，在體外能中和安全劑量達(dá)到的血藥濃度的作用時(shí)，可以考慮終止給藥。需結(jié)合藥動(dòng)學(xué)資料?？?結(jié) 生物技術(shù)藥物免疫毒性評價(jià) 重視，個(gè)體化原則，采用新方法 生物技術(shù)藥物免疫原性評價(jià) 強(qiáng)調(diào)規(guī)范，分析與毒性反應(yīng)等關(guān)系CD28激動(dòng)劑TGN1412的期臨床試驗(yàn)事件 德 國 公 司 研 制 的 抗 C

14、 D 2 8 超 級 激 動(dòng) 劑TGN1412（人源化單抗）用于治療白血病等，在1期臨床試驗(yàn)中，單次靜脈注射12-16h，6例均出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)（多器官衰竭）。CD28激動(dòng)劑TGN1412的期臨床試驗(yàn)事件 研究發(fā)現(xiàn)注射受試品后很快導(dǎo)致前炎癥因子釋放（細(xì)胞因子風(fēng)暴），心肺功能衰竭。 猴長毒：CD4+ 和CD8+ T細(xì)胞一過性升高,血清IL-2、IL-5、IL-6中度升高，但沒有出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征。CD28激動(dòng)劑TGN1412的期臨床試驗(yàn)事件的教訓(xùn) 期臨床試驗(yàn)方案的教訓(xùn)：僅10min間隔 免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評價(jià)和分析的重要性（Toxicol in Vitr）。 猴并非一定是相關(guān)動(dòng)物，

15、動(dòng)物記憶T細(xì)胞少。主要參考文獻(xiàn) EMEA. Guideline on Comparability of Medicinal Products Containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substance: Nonclinical and Clinical Issues ICH. preclinical safety evaluation ofbiotechnology-derived pharmaceuticalss6 ICH. immunotoxicity studies for human pharmaceuticals s8 FDA.Immunotoxicology Evaluation of In