亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)定

1、亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量控制亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量控制 烏魯木齊市血液中心質(zhì)量管理科烏魯木齊市血液中心質(zhì)量管理科 梅靜梅靜 2015.4 血漿病毒血漿病毒滅活的必滅活的必要性要性亞甲藍(lán)亞甲藍(lán)病病毒滅活血毒滅活血漿的制備漿的制備亞甲藍(lán)病亞甲藍(lán)病毒滅活毒滅活的的技術(shù)原理技術(shù)原理病毒滅活病毒滅活血漿的質(zhì)血漿的質(zhì)量控制量控制血漿病毒滅活的必要性 隨著血液檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和血液管理措施的完善，目前的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV的檢測(cè)在很大程度上降低了輸血導(dǎo)致病毒傳播的幾率，但由于 1 病毒變異導(dǎo)致免疫反應(yīng)性的改變； 2 免疫靜默感染； 3 檢測(cè)技術(shù)存在窗口期漏檢的局限性； 4 檢測(cè)病原體種類的局限

2、； 輸血引起艾滋病病毒（HIV、HCV、HBV）的風(fēng)險(xiǎn)尚不能完全杜絕；不常見的病毒如人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒（HTLV）、西尼羅病毒（WNV）、EB病毒等在大多數(shù)國(guó)家均未被列入血液常規(guī)檢測(cè)。現(xiàn)有的檢測(cè)手段不能完全排除血漿中可能存在的未知病毒。 血漿制品病毒去除方法：血漿制品病毒去除方法：乙醇沉淀深層過(guò)濾離子交換色譜和親和層析色譜納米膜過(guò)濾 納米膜過(guò)濾技術(shù) 單一的病毒滅活/去除方法雖然能較好的起到處理病毒效果，但是無(wú)法滅活和去除所有病毒，如細(xì)小病毒B19、VIR918、PARV4、SV40和PrPSc。主要在血漿蛋白分離工藝中應(yīng)用主要在血漿蛋白分離工藝中應(yīng)用血漿病毒滅活方法有機(jī)溶劑/去污劑（S/

3、D）法熱處理蒸汽處理法以上方法多用于從原以上方法多用于從原料血漿生產(chǎn)血漿蛋白料血漿生產(chǎn)血漿蛋白制品，均需要將大量制品，均需要將大量的不同人份的血漿混的不同人份的血漿混合處理，不但容易增合處理，不但容易增加某些不能被滅活病加某些不能被滅活病原體（如朊病毒原體（如朊病毒prion等）的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)，等）的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)，且且處理難度大，費(fèi)用高。處理難度大，費(fèi)用高。亞甲藍(lán)光化學(xué)法亞甲藍(lán)光化學(xué)法能對(duì)能對(duì)單人份血漿進(jìn)行病毒單人份血漿進(jìn)行病毒滅活滅活，適用于采供血，適用于采供血機(jī)構(gòu)對(duì)臨床用血漿的機(jī)構(gòu)對(duì)臨床用血漿的病毒滅活處理，更適病毒滅活處理，更適合于我國(guó)的國(guó)情和臨合于我國(guó)的國(guó)情和臨床實(shí)際應(yīng)用。床實(shí)際應(yīng)用。 終端干

4、熱法 低pH孵放法辛酸處理法亞甲藍(lán)病毒滅活的技術(shù)原理亞甲藍(lán)又名美藍(lán)，分子量 319185，是一種光敏劑，吩噻嗪類染料，其最大吸收峰為 670nm，臨床上常作為解毒劑，用于治療亞硝酸鹽中毒引起的高鐵血紅蛋白血癥和氰化物中毒。亞甲藍(lán)表面攜帶正電荷，與病毒核酸結(jié)合后可以嵌入DNA/RNA 中，與病毒核酸帶負(fù)電荷的 G-C 堿基對(duì)相結(jié)合。在有光照的條件下，亞甲藍(lán)分子吸收光能后可激發(fā)產(chǎn)生單態(tài)分子氧，這種單態(tài)分子氧通過(guò)修飾鳥嘌呤堿基而影響核酸，使其產(chǎn)生缺口，引起核酸鏈的斷裂或?qū)е聣A基位點(diǎn)丟失，從而阻止其復(fù)制,達(dá)到滅活病毒的目的。u 與脂膜和蛋白質(zhì)結(jié)合u對(duì)核酸有較高的親和性u(píng)亞甲藍(lán)為多靶點(diǎn)的光敏劑，光照射產(chǎn)

5、生單線態(tài)氧和羥自由基引起廣泛損傷 亞甲藍(lán)可與病毒的核酸與脂質(zhì)包膜相結(jié)合，在可見光的作用下，可使病毒的核酸斷裂，包膜破損，因而能殺滅包括艾滋病病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）等的脂質(zhì)包膜病毒和部分非脂質(zhì)包膜病毒。 對(duì)亞甲蘭光化學(xué)法病毒滅活有效性的研究顯示，血漿中指示病毒的滴度顯著下降，血漿中的病毒含量下降了6個(gè)數(shù)量級(jí)，可能殘留的病毒量低于百萬(wàn)分之一，達(dá)到了國(guó)際公認(rèn)的血漿病毒滅活有效性指標(biāo)，也符合衛(wèi)生部關(guān)于血漿制品病毒滅活的有關(guān)規(guī)定。 亞甲藍(lán)病毒滅活的技術(shù)原理 美國(guó)AABB技術(shù)手冊(cè)描述了病原體滅活血漿制品，介紹了歐盟開展的三種病毒滅活方法，其中包括亞甲藍(lán)、核黃素和補(bǔ)骨脂素。但

6、美國(guó)未開展。 歐盟指南中描述了病原體滅活的FFP制品的質(zhì)量要求，同時(shí)也介紹了三種方法。 英國(guó)指南中明確描述了亞甲藍(lán)處理和去除的FFP制品的質(zhì)量要求，質(zhì)量要求中對(duì)亞甲藍(lán)殘留量要求為0.3umol/L0.3umol/L ，與我們的國(guó)標(biāo)一致。2007年烏魯木齊市血液中心引進(jìn)該技術(shù), 截至2014年底使用亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活血漿13萬(wàn)單位以上。2004年，世界衛(wèi)生組織將亞甲藍(lán)光化學(xué)血漿病毒滅活技術(shù)列入 “人血漿制品病毒滅活或去除指南”， 歐盟和英國(guó)也納入“輸血指南”。90年代中期，上海血液中心開發(fā)以熒光照射光源和配置亞甲藍(lán)去除濾器為特點(diǎn)的亞甲藍(lán)光化學(xué)血漿病毒滅活技術(shù)，隨后該項(xiàng)技術(shù)在我國(guó)被逐步推廣。19

7、92年，德國(guó)最早將依靠該項(xiàng)技術(shù)處理的新鮮冰凍血漿應(yīng)用于臨床。一次性使用血漿病毒滅活輸血過(guò)濾器Depasse 最早提出了 “過(guò)濾器的應(yīng)用”，極大地簡(jiǎn)化和改進(jìn)了 MB-P 法的操作，為 MB-P 法由實(shí)驗(yàn)室走向臨床邁出了重要一步。目前使用的一次性使用血漿病毒滅活輸血過(guò)濾器主要由亞甲藍(lán)添加元件、光照袋、過(guò)濾器、血漿儲(chǔ)存袋和連接管路組成，是一種簡(jiǎn)便、實(shí)用的血漿滅活器材。亞甲藍(lán)作為一種外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入人體后，對(duì)人體的潛在影響尚不可知。若病毒滅活血漿中殘留過(guò)多的亞甲藍(lán)，還會(huì)造成血漿外觀和色澤的明顯改變，使病人輸注時(shí)可能產(chǎn)生心理負(fù)擔(dān)。在保證滅活所需的有效濃度下，要盡量減少其殘留量，因而對(duì)病毒滅活血漿中的亞甲藍(lán)殘

8、留量/率進(jìn)行控制很有必要。選擇合適的亞甲藍(lán)含量的測(cè)定方法很重要。醫(yī)用病毒滅活箱的應(yīng)用醫(yī)用病毒滅活箱的應(yīng)用 當(dāng)前的醫(yī)用病毒滅活箱是用于光照滅活時(shí)的專用設(shè)備，它集光源、溫控、機(jī)械擺動(dòng)等裝置于一身，可以根據(jù)需要設(shè)定照射強(qiáng)度、照射溫度、照射時(shí)間和擺動(dòng)頻率等諸多條件，使用方便。光源選擇：光源選擇：熒光燈（1）單位時(shí)間內(nèi)照射所釋放的熱量較低；（2）達(dá)到相同滅活效果的照射時(shí)間最短；（3）波長(zhǎng)接600700nm。照射方式：照射方式：有效光照強(qiáng)度范圍在 30 00040 000lx。（1）放置血袋的托盤為鋼絲結(jié)構(gòu)，有較大空隙，使血袋兩面都可以接受照射；（2）照射過(guò)程中托盤以602 次/分鐘的頻率擺動(dòng)；（3）箱內(nèi)

9、面為鏡面，可以將燈管直射的光源和鏡面反射的光源從 360 度全方位地照射血漿。 亞甲藍(lán)病毒滅活血漿在我國(guó)開展近十年，各種關(guān)于病毒滅活對(duì)血漿主要成分影響情況的報(bào)道可歸納為：血漿經(jīng)過(guò) MB-P 法滅活后，血漿總蛋白回收率90%以上；但部分不穩(wěn)定的凝血因子(，)和纖維蛋白原（Fg）的變化明顯，因子的回收率一般在 80%左右。血漿的免疫原性、各種電解質(zhì)、酶的穩(wěn)定性等的變化不明顯，PH 值也未受影響。 亞甲藍(lán)的濃度與血漿病毒的滅活效果有直接關(guān)系，只有達(dá)到一定的釋放量才能起作用，但亞甲藍(lán)若殘留過(guò)多會(huì)影響血漿的外觀色澤，且亞甲藍(lán)存在致突變的可能性，因而必須對(duì)滅活前后亞甲藍(lán)的含量進(jìn)行測(cè)。血漿中亞甲藍(lán)殘留量的檢

10、測(cè)固相萃取小柱將亞甲藍(lán)從血漿中提取出。分光光度計(jì)檢測(cè)。不能直接用分光光度計(jì)測(cè)定血漿中亞甲藍(lán)的含量,因?yàn)檠獫{本身為復(fù)雜的混合物,含有多種蛋白,在亞甲藍(lán)最大吸光波長(zhǎng)處血漿蛋白亦有吸光,而且血漿蛋白個(gè)體差異很大,因此無(wú)法取得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果,要想準(zhǔn)確檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量,必須排除干擾,既將亞甲藍(lán)提取出來(lái),再進(jìn)行測(cè)定。亞甲藍(lán)檢測(cè)依據(jù)檢測(cè)依據(jù)血站技術(shù)操作規(guī)程2012年版：14 附錄附錄 F 血液質(zhì)量控制檢查方法血液質(zhì)量控制檢查方法 F.19 亞甲藍(lán)殘留量。全血及成分血質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) GB18467-20125.16病毒滅活冰凍血漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，亞甲藍(lán)殘留量 0.30 mol/L。16血漿中亞甲藍(lán)殘留量的檢測(cè) 所需實(shí)

11、驗(yàn)儀器、試劑所需實(shí)驗(yàn)儀器、試劑試驗(yàn)儀器試驗(yàn)儀器: : 固相萃取富集裝置及配套的固相萃取耗材：推薦使用固相萃取富集裝置及配套的固相萃取耗材：推薦使用Waters Waters OasisOasis產(chǎn)品產(chǎn)品 （）真空泵真空泵分光光度計(jì)分光光度計(jì)試管離心機(jī)試管離心機(jī)試劑：亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品粉劑、甲醇、乙酸、蒸餾水試劑：亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品粉劑、甲醇、乙酸、蒸餾水其他耗材：容量瓶、移液器、試管等其他耗材：容量瓶、移液器、試管等亞甲藍(lán)殘留量的檢測(cè)原理固相萃取固相萃取-分光光度法分光光度法 利用固相小柱內(nèi)吸附介質(zhì)是一種大孔聚合物，利用固相小柱內(nèi)吸附介質(zhì)是一種大孔聚合物，對(duì)血漿中亞甲藍(lán)具有很強(qiáng)的對(duì)血漿中亞甲藍(lán)具有很強(qiáng)的選

12、擇性選擇性吸附，可吸附，可排除血排除血漿蛋白、脂肪和其它雜質(zhì)的干擾，漿蛋白、脂肪和其它雜質(zhì)的干擾，當(dāng)血漿標(biāo)本通過(guò)當(dāng)血漿標(biāo)本通過(guò)小柱時(shí)，血漿中血漿中亞甲藍(lán)被柱子中大孔聚合物小柱時(shí)，血漿中血漿中亞甲藍(lán)被柱子中大孔聚合物吸附，最后用洗脫液洗脫液洗脫亞甲藍(lán)，采用柱子吸附，最后用洗脫液洗脫液洗脫亞甲藍(lán)，采用柱子提取血漿中殘留亞甲藍(lán)，用含提取血漿中殘留亞甲藍(lán)，用含1%醋酸的甲醇溶液調(diào)醋酸的甲醇溶液調(diào)零，在零，在653 nm檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控、測(cè)定管，其吸光度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控、測(cè)定管，其吸光度與濃度呈正比。與濃度呈正比。Waters Oasis小柱特性小柱特性:-大孔聚合物大孔聚合物.對(duì)化合物的保留強(qiáng)對(duì)化合物的保

13、留強(qiáng) - 是一種通用性的吸附劑（是一種通用性的吸附劑（pH范圍較寬范圍較寬1-14）- 30%甲醇清洗甲醇清洗,可完全去除血漿中的蛋白、脂質(zhì)和其它雜可完全去除血漿中的蛋白、脂質(zhì)和其它雜質(zhì)質(zhì) - 亞甲藍(lán)在不同溶劑中亞甲藍(lán)在不同溶劑中,最大吸收峰不同：最大吸收峰不同： 甲醇溶液為甲醇溶液為653nm ,故本法選故本法選653nm 為測(cè)試波長(zhǎng)為測(cè)試波長(zhǎng). - 可用可用1乙酸的甲醇溶液乙酸的甲醇溶液,迅速將柱床頂?shù)膩喖姿{(lán)洗脫迅速將柱床頂?shù)膩喖姿{(lán)洗脫.亞甲藍(lán)酸性染料，（亞甲藍(lán)酸性染料，（pH3.5 1乙酸的甲醇溶液）乙酸的甲醇溶液）19主要檢測(cè)設(shè)備：固相萃取富集裝置亞甲藍(lán)殘留量檢測(cè)方法u使用Waters

14、 Oasis小柱萃取血漿中的亞甲藍(lán)使用前的Waters小柱1、用6ml甲醇活化Waters小柱2、加入6ml供試血漿亞甲藍(lán)殘留量檢測(cè)方法u將萃取出的亞甲藍(lán)洗脫后進(jìn)行比色 Waters小柱萃取出血漿中的亞甲藍(lán)3、萃取亞甲藍(lán)4、用30甲醇6mL清洗 5、用含1乙酸的甲醇溶液2ml洗脫 6、洗脫液離心（3500rpm/10min） 7、用含1乙酸的甲醇溶液作試劑空白，在6542nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度注：用同樣的方法萃取檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品 成品試劑盒的組成小柱小柱R1： 活化液活化液R2： 清洗液清洗液 R3： 洗脫液洗脫液亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液：（亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液：（100mol/L) )質(zhì)控液：（質(zhì)控液：（0.300mo

15、l/L）操作方法（詳讀說(shuō)明書、按說(shuō)明書操作）操作方法（詳讀說(shuō)明書、按說(shuō)明書操作）1、柱預(yù)處理柱預(yù)處理 取小柱三支表明測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控，分別插入固相萃取裝置過(guò)濾柱子取小柱三支表明測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控，分別插入固相萃取裝置過(guò)濾柱子中，加入中，加入3ml活化液活化小柱?；罨夯罨≈?。2、加標(biāo)準(zhǔn)液（加標(biāo)準(zhǔn)液（ 10mol/L）：（取血漿）：（取血漿0.36ml,加加100mol/L標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液0.04ml混勻）于標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)的小柱內(nèi)加混勻）于標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)的小柱內(nèi)加0.3ml標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液3、加質(zhì)控液（加質(zhì)控液（0.300mol/L）：）： （取血漿（取血漿0.36ml,加質(zhì)控液加質(zhì)控液0.04ml混勻）混勻）于標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)的小柱內(nèi)加于標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)的小柱內(nèi)加0.3ml質(zhì)控液質(zhì)控液4、加樣：于標(biāo)明測(cè)定的小柱內(nèi)加加樣：于標(biāo)明測(cè)定的小柱內(nèi)加6.0ml血漿血漿5、清洗清洗 待血漿完全進(jìn)入小柱后，用待血漿完全進(jìn)入小柱后，用3ml清洗液清洗小柱，去血漿中的蛋白清洗液清洗小柱，去血漿中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他雜質(zhì)，血漿中亞甲藍(lán)被吸附于吸附劑上。質(zhì)、脂質(zhì)和其他雜質(zhì)，血漿中亞甲藍(lán)被吸附于吸附劑上。6、洗脫洗脫換干凈的試管，加換干凈的試管，加2ml洗脫液洗脫小柱上的亞甲藍(lán)洗脫液洗脫小柱上的亞甲藍(lán)。7、檢測(cè)檢測(cè) 將洗脫液離心將洗脫液離心3000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)