細(xì)胞培養(yǎng)2014.3

1、組織培養(yǎng)和組化技術(shù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心1/93組組 織織 培培 養(yǎng)養(yǎng) 概念:指的是從活體內(nèi)取出組織在體外模擬其生長(zhǎng) 生理環(huán)境即無(wú)菌、適當(dāng)?shù)臏囟?，pH值和合適 營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu) 和功能的方法。分類： 細(xì)胞培養(yǎng) (Cell Culture) 組織培養(yǎng) (Tissue Culture) 器官培養(yǎng) (Organ Culture)細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)：將活細(xì)胞（尤其是分散的細(xì)胞）在體 外培養(yǎng)的方法。組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)：從生物體內(nèi)取出活的組織塊，大小在（O.5 1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)：使用器官原基或器官的一部分或整個(gè)器官 (一般指胚胎器官

2、)在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) primary culture : : 指從供體取得組織，分離所得到的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶,進(jìn)行首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）。 傳傳 代代 passage : : 細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶過(guò)程稱之為傳代，進(jìn)行一次分離培養(yǎng)稱之為傳一代。 原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期: : 從體內(nèi)取出組織細(xì)胞開(kāi)始培養(yǎng)到第一次進(jìn)行傳代之前的這一段時(shí)期。傳傳 代代 期期: : 一旦原代培養(yǎng)經(jīng)過(guò)分割,重新接種到兩個(gè)或兩個(gè)以上的器皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)標(biāo)志進(jìn)入傳代培養(yǎng)期。衰衰 退退 期期: : 傳代培養(yǎng)到一定代數(shù)時(shí),細(xì)胞生命活動(dòng)明顯減弱, 生長(zhǎng)

3、緩慢,很少或不再分裂,給更多的營(yíng)養(yǎng)也無(wú)濟(jì)于事,表明培養(yǎng)物進(jìn)入衰退期。細(xì)胞系細(xì)胞系 cell linecell line：是指原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代培養(yǎng)后得到的一群 不均一的細(xì)胞,可以長(zhǎng)期連續(xù)傳代。細(xì)胞株細(xì)胞株cell straincell strain：通過(guò)選擇或克隆化培養(yǎng),從原代培養(yǎng)物或 細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化 性質(zhì)或特異標(biāo)志的細(xì)胞群。有限細(xì)胞系：有限細(xì)胞系：在在體外的生存期有限的細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系：無(wú)限細(xì)胞系：在體外可以持續(xù)生存,具有無(wú)限的繁殖能力的細(xì)胞 系(永生細(xì)胞系)。正常細(xì)胞、永生細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的性狀區(qū)別正常細(xì)胞、永生細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的性狀區(qū)別正常細(xì)胞正常細(xì)胞永生細(xì)胞永生細(xì)胞腫瘤細(xì)

4、胞腫瘤細(xì)胞接觸抑制接觸抑制有有有有無(wú)無(wú)永生性永生性無(wú)無(wú)有有有有克隆形成率克隆形成率無(wú)無(wú)弱弱強(qiáng)強(qiáng)核型改變核型改變無(wú)無(wú)常有常有有有（二倍體）（二倍體）（非整倍體）（非整倍體） （非整倍體）（非整倍體）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)：貼附生長(zhǎng)： 必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種實(shí)體瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等懸浮生長(zhǎng)懸浮生長(zhǎng)： 于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。 見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)成纖維型細(xì)胞：起源中胚層間充質(zhì)的組織，如心肌、平滑肌、 成骨細(xì)胞。上皮型細(xì)胞：起源內(nèi)、外胚層的組織，如皮膚、消化管上皮, 肝、胰、肺上皮。游走型細(xì)胞：細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽

5、足和突起，呈游走或變形運(yùn)動(dòng)。多型性細(xì)胞：一般神經(jīng)組織的細(xì)胞。成成纖纖維維型型上上皮皮型型游游走走型型多多形形型型相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞懸浮的脂肪細(xì)胞懸浮的脂肪細(xì)胞細(xì)胞核的熒光染色細(xì)胞核的熒光染色細(xì)胞骨架的熒光染色細(xì)胞骨架的熒光染色培養(yǎng)細(xì)胞雙熒光染色培養(yǎng)細(xì)胞雙熒光染色原代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)1.機(jī)械解離細(xì)胞法：運(yùn)用各種物理學(xué)處理手段解離組織成為單個(gè)細(xì)胞。 2.酶學(xué)解離細(xì)胞法：用蛋白消化酶解離組織，成為單個(gè)細(xì)胞是體外培養(yǎng)分散組織的基本方法。主要有胰酶蛋白、膠原酶、鏈霉蛋白酶。3 螯合劑解離細(xì)胞法：通過(guò)結(jié)合（螯合）細(xì)胞間質(zhì)中二價(jià)陽(yáng)離子而破壞細(xì)胞的連接。如乙二胺四乙酸鈉（EDTA

6、-2Na)。原代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)取鼠胚組織取鼠胚組織1、脊椎脫臼法、脊椎脫臼法機(jī)械解離細(xì)胞法機(jī)械解離細(xì)胞法制成細(xì)胞懸液消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞貼壁過(guò)程培養(yǎng)細(xì)胞貼壁過(guò)程血清中有促使細(xì)胞貼壁的纖維連接素血清中有促使細(xì)胞貼壁的纖維連接素LETS、膠、膠原、糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)）等，這些帶正電荷的糖原、糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)）等，這些帶正電荷的糖蛋白是促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞的蛋白是促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞的表面蛋白參與貼附過(guò)程。表面蛋白參與貼附過(guò)程。 游離期：游離期： 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。狀態(tài)也稱懸浮期。 此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球

7、此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球 形。形。1010分鐘分鐘 4 4小時(shí)小時(shí) 貼壁期：貼壁期： 細(xì)胞附著于底物上，游離期細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。結(jié)束。 細(xì)胞株平均在細(xì)胞株平均在1010分鐘分鐘 4 4小時(shí)貼壁。小時(shí)貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等。 潛伏期潛伏期 此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。 原代細(xì)胞持續(xù)約原代細(xì)胞持續(xù)約24-96h24-96h； 腫瘤細(xì)胞或永生細(xì)胞約腫瘤細(xì)胞或永生細(xì)胞約6-24h6-24h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期： 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)， 活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研

8、究?；盍ψ罴?，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）：停止期（平臺(tái)期）： 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性、營(yíng)養(yǎng)液成份。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性、營(yíng)養(yǎng)液成份。每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施和基本條件 常用儀器設(shè)備和耗材常用儀器設(shè)備和耗材 無(wú)菌室無(wú)菌室超凈工作臺(tái)，超凈工作臺(tái)，COCO2 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱倒置顯微鏡倒置顯微鏡消毒設(shè)備：壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，消毒設(shè)備：壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，液氮液氮罐罐酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀，濾器，酸缸自動(dòng)

9、雙重純水蒸餾器，純水儀，濾器，酸缸耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板，耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管凍存管無(wú)無(wú) 菌菌 室室無(wú)菌室使用規(guī)則無(wú)菌室使用規(guī)則操作操作前將紫外線燈打開(kāi)前將紫外線燈打開(kāi)3030分鐘對(duì)無(wú)菌室消分鐘對(duì)無(wú)菌室消毒，然后關(guān)閉紫外線燈。毒，然后關(guān)閉紫外線燈。進(jìn)入無(wú)菌室必須帶好口罩，更換工作服，進(jìn)入無(wú)菌室必須帶好口罩，更換工作服，鞋帽。鞋帽。無(wú)菌室的無(wú)菌室的設(shè)備，物品不得攜出室外。設(shè)備，物品不得攜出室外。操作完畢后，認(rèn)真整理室內(nèi)物品，搞好清操作完畢后，認(rèn)真整理室內(nèi)物品，搞好清潔衛(wèi)生。潔衛(wèi)生。檢查好電源、煤氣閥方可離去。檢查好電源、煤氣閥方可離去。無(wú)菌操作無(wú)菌操作

10、超超 凈凈 臺(tái)臺(tái) 超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。 CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件：培養(yǎng)箱設(shè)定的條件： 37 5CO2 作用作用：維持培養(yǎng)液的：維持培養(yǎng)液的 PH值值 7.27.4范圍范圍 NaHCO3+H2O Na+ + OH - - + H2O + CO2COCO2 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱COCO2 2培養(yǎng)箱使用時(shí)注意的問(wèn)題培養(yǎng)箱使用時(shí)注意的問(wèn)題用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。為了保持箱內(nèi)濕度為了保持箱內(nèi)濕度, ,需放置需放置30003

11、000毫升蒸毫升蒸 餾餾 水于槽中水于槽中, , 以避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。以避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（ 90 90 ，14 h)14 h)。 倒置光顯微鏡顯顯微微鏡鏡各各部部分分名名稱稱目鏡筒目鏡筒熒光燈室熒光燈室透射燈室透射燈室熒光光源熒光光源熒光濾片選擇熒光濾片選擇熒光濾片盒熒光濾片盒調(diào)焦（粗調(diào)焦（粗/ /細(xì)）細(xì)）X X方向平臺(tái)移動(dòng)方向平臺(tái)移動(dòng)Y Y方向平臺(tái)移動(dòng)方向平臺(tái)移動(dòng)光路轉(zhuǎn)換光路轉(zhuǎn)換透射光源透射光源聚光鏡聚光鏡熒光組件熒光組件集光鏡集光鏡 物鏡物鏡物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡轉(zhuǎn)換器透射濾片透射濾片目鏡目鏡物物 鏡鏡相差標(biāo)識(shí)相差標(biāo)識(shí)相差標(biāo)識(shí)相差標(biāo)識(shí)ph

12、1相差顯微鏡 由于細(xì)胞各部細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，光波由于細(xì)胞各部細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，光波 通過(guò)時(shí)，波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化通過(guò)時(shí)，波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化 且人眼無(wú)法觀察。而相差顯微鏡通過(guò)改變這種相位差，且人眼無(wú)法觀察。而相差顯微鏡通過(guò)改變這種相位差， 并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成以明暗并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成以明暗顯現(xiàn)顯現(xiàn) 的的振幅差來(lái)觀察無(wú)色活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本。振幅差來(lái)觀察無(wú)色活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本。 相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是: :用環(huán)狀光闌代替可用環(huán)狀光闌代替可變光闌，變光闌， 用帶相板

13、的物鏡代替普通物鏡。用帶相板的物鏡代替普通物鏡。高壓蒸汽滅菌器高壓蒸汽滅菌器 濕熱消毒：適用于培養(yǎng)用液、橡膠制品、布類、玻璃濕熱消毒：適用于培養(yǎng)用液、橡膠制品、布類、玻璃 制品和金屬器械。制品和金屬器械。高壓蒸汽消毒高壓蒸汽消毒要求：要求：培養(yǎng)用液、橡膠制品培養(yǎng)用液、橡膠制品 10磅磅10分鐘分鐘布類、玻璃制品和金屬器械。布類、玻璃制品和金屬器械。 15磅磅20分鐘分鐘注意：注意：1.使用高壓蒸汽滅器前仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，使用高壓蒸汽滅器前仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)， 經(jīng)相關(guān)人員培訓(xùn)后方能使用，以免發(fā)生意外。經(jīng)相關(guān)人員培訓(xùn)后方能使用，以免發(fā)生意外。 2.消毒完畢后，待壓力表讀數(shù)降為零，才能消毒完畢后，

14、待壓力表讀數(shù)降為零，才能 開(kāi)蓋，小心操作，防止?fàn)C傷。開(kāi)蓋，小心操作，防止?fàn)C傷。干干熱熱滅滅菌菌器器干熱滅菌器干熱滅菌器干熱消毒：適用于玻璃器皿的消毒。干熱消毒：適用于玻璃器皿的消毒。要求：要求：160160保持保持9090120120分鐘。分鐘。注意：注意：1.1.使用干熱滅菌器前仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，經(jīng)使用干熱滅菌器前仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，經(jīng) 相關(guān)人員培訓(xùn)后方能使用，以免發(fā)生意外。相關(guān)人員培訓(xùn)后方能使用，以免發(fā)生意外。 2. 2.消毒完畢后，不要立刻打開(kāi)箱門，防止消毒完畢后，不要立刻打開(kāi)箱門，防止 損壞玻璃器皿和影響消毒效果。損壞玻璃器皿和影響消毒效果。電離輻射滅菌放射性核素產(chǎn)生的射線（由60C

15、o產(chǎn)生）或電子加速器產(chǎn)生的加速粒子照射物品以殺滅微生物的方法優(yōu)點(diǎn)：照射時(shí)不會(huì)升溫，適合不耐熱物品的消毒。 穿透力強(qiáng)可以對(duì)密封包裝的物品進(jìn)行消毒。缺點(diǎn)：誘變作用很強(qiáng)不適合消毒活得生物材料。 液氮罐內(nèi)部結(jié)構(gòu)內(nèi)部結(jié)構(gòu)濾濾 器器正壓式濾器正壓式濾器負(fù)壓式濾器電電 子子 天天 平平電子天平電子天平電子精密天平電子精密天平 使用前的準(zhǔn)備工作使用前的準(zhǔn)備工作 請(qǐng)將電子秤置于穩(wěn)固平坦之桌面或臺(tái)架使用，勿置請(qǐng)將電子秤置于穩(wěn)固平坦之桌面或臺(tái)架使用，勿置于震動(dòng)不穩(wěn)的桌面或臺(tái)架上于震動(dòng)不穩(wěn)的桌面或臺(tái)架上 避免置放于溫度變化過(guò)大或空氣流動(dòng)劇烈之場(chǎng)所，避免置放于溫度變化過(guò)大或空氣流動(dòng)劇烈之場(chǎng)所，如日光直射或冷氣出風(fēng)口處如

16、日光直射或冷氣出風(fēng)口處使用獨(dú)立電源插座以免其它電器干擾使用獨(dú)立電源插座以免其它電器干擾調(diào)整電子秤的調(diào)整腳，使秤平穩(wěn)且水平儀內(nèi)氣泡居調(diào)整電子秤的調(diào)整腳，使秤平穩(wěn)且水平儀內(nèi)氣泡居圓圈中央圓圈中央當(dāng)電源開(kāi)啟時(shí)，請(qǐng)勿將物品置放在秤盤上，使用前當(dāng)電源開(kāi)啟時(shí)，請(qǐng)勿將物品置放在秤盤上，使用前先熱機(jī)先熱機(jī)1515分鐘以上分鐘以上( (高精度秤必須更長(zhǎng)時(shí)間高精度秤必須更長(zhǎng)時(shí)間) ) 首先檢查電源是否連接好。稱重時(shí)輕拿輕放，被稱首先檢查電源是否連接好。稱重時(shí)輕拿輕放，被稱物品小心加減，不允許散在天平內(nèi)。物品小心加減，不允許散在天平內(nèi)。將開(kāi)關(guān)打開(kāi)后，當(dāng)屏幕上出現(xiàn)將開(kāi)關(guān)打開(kāi)后，當(dāng)屏幕上出現(xiàn)0.0000時(shí)，才可將被時(shí)，

17、才可將被 稱物品放上，關(guān)好拉門，當(dāng)屏幕左上角的稱物品放上，關(guān)好拉門，當(dāng)屏幕左上角的“0”消失消失時(shí)，即為本品的重量。時(shí)，即為本品的重量。稱重完后將物品取出，關(guān)好拉門，關(guān)閉開(kāi)關(guān)，搞好稱重完后將物品取出，關(guān)好拉門，關(guān)閉開(kāi)關(guān)，搞好清潔衛(wèi)生，方可離開(kāi)。清潔衛(wèi)生，方可離開(kāi)。電子天平使用規(guī)則電子天平使用規(guī)則石英玻璃蒸餾器蒸蒸 餾餾 水水去離子水去離子水用樹(shù)脂離子交換柱可去掉用樹(shù)脂離子交換柱可去掉水中的無(wú)機(jī)離子，不能有水中的無(wú)機(jī)離子，不能有效去除有機(jī)物。效去除有機(jī)物。用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，去離子用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，去離子水必須再蒸餾一次，方能水必須再蒸餾一次，方能配制體外培養(yǎng)的各種液體配制體外培養(yǎng)的各種液體過(guò)濾層去處

18、粗雜質(zhì)過(guò)濾層去處粗雜質(zhì)去有機(jī)層去有機(jī)層去離子層去離子層去熱源層去熱源層過(guò)濾除菌層過(guò)濾除菌層 超超 純純 水水純水儀培 養(yǎng) 板培培 養(yǎng)養(yǎng) 瓶瓶常用玻璃器皿清洗常用玻璃器皿清洗浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉，洗潔精）、浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉，洗潔精）、流水沖洗、流水沖洗、 干燥、泡酸（干燥、泡酸（24小時(shí)）、流水沖洗、小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干、包裝、滅菌。烘干、包裝、滅菌。清潔液的配制清潔液的配制細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制一緩沖液一緩沖液1.平衡鹽溶液平衡鹽溶液( BSS) 2. Hanks: 適用于適用于密封培養(yǎng)環(huán)境，能起緩沖密封培養(yǎng)環(huán)境，能起

19、緩沖 pH的作用。的作用。 3. D-Hanks: 無(wú)無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液的緩沖液 4.PBS: 最最常用的常用的BSS (根據(jù)需要根據(jù)需要,選擇不選擇不 同的同的BSS)HanksHanks液的配方（液的配方（ g/L)g/L)NaCLNaCL 8.0 8.0KCL 0.4KCL 0.4CaClCaCl2 2 0.140.14MgSOMgSO4 4 7H 7H2 2O 0.2O 0.2NaNa2 2HPOHPO4 4HH2 2O 0.06O 0.06KHKH2 2POPO4 4 0.060.06NaHNaH CO CO3 3 0.350.35葡萄糖葡萄糖 1.001.00酚紅酚紅 0

20、.020.02D-HanksD-Hanks液的配方（液的配方（g/Lg/L）NaCLNaCL 8.0 8.0KCL 0.4KCL 0.4NaNa2 2HPOHPO4 4HH2 2O 0.06O 0.06KHKH2 2POPO4 4 0.060.06NaHCONaHCO3 3 0.350.35酚紅酚紅 0.020.02PBSPBS的配方的配方NaClNaCl 8.0 8.0 g g KClKCl 0.2 0.2 g g NaNa2 2HPOHPO4 4.H.H2 2O 1.56 O 1.56 g g KHKH2 2POPO4 4 0.20 0.20 g g 加加新鮮制成雙蒸水至新鮮制成雙蒸水至1

21、000 ml1000 ml二二. .消化液消化液1.胰蛋白酶胰蛋白酶2.乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸二鈉（二鈉（EDTA-2Na）3.膠原酶膠原酶胰蛋白酶胰蛋白酶：胰蛋白酶胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。架，從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)Ca2+、Mg2+的的BSS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是是0.25 ,0.125%。用濾器過(guò)濾除菌。用濾器過(guò)濾除菌。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，

22、但超過(guò)一胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶液消化時(shí)間：定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2 10分鐘。分鐘。含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用膠原酶膠原酶 膠原酶分膠原酶分、型及肝細(xì)胞專用型型及肝細(xì)胞專用型 活性：活性：125125200u200umgmg，u u代表膠原釋放代表膠原釋放umolumol亮亮 氨酸活性，常用上皮類細(xì)胞和原代細(xì)胞培養(yǎng)，不同組氨酸活性，常用上皮類細(xì)胞和原代細(xì)胞培養(yǎng)，不同組 織需選擇不同類型的膠原酶織需選擇不同類型的膠原酶 型膠原酶型膠原酶 : :可用于肝、骨、甲狀腺、心臟、脂肪組織可用于肝、骨、甲狀

23、腺、心臟、脂肪組織型膠原酶型膠原酶: :對(duì)組織有廣譜的消化作用對(duì)組織有廣譜的消化作用 型膠原酶型膠原酶: :用于分離胰島細(xì)胞用于分離胰島細(xì)胞三培養(yǎng)基三培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，培養(yǎng)基：是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液， 由由天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基和和合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基組成。組成。.天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基： 血清血清、血漿、和組織提取、血漿、和組織提取液（如液（如雞胚和牛胚浸液雞胚和牛胚浸液） 優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點(diǎn)缺點(diǎn): 成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取 和和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體等污染實(shí)驗(yàn)結(jié)

24、果的分析。易發(fā)生支原體等污染 血清優(yōu)點(diǎn)：1)1)提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2)2)提供貼壁和擴(kuò)展因子提供貼壁和擴(kuò)展因子（纖連蛋白，層粘連蛋白等）纖連蛋白，層粘連蛋白等）3)3)含有含有激素激素及各種生長(zhǎng)因子（及各種生長(zhǎng)因子（FGFFGF，EGFEGF， PDGF PDGF）4)4)提供結(jié)合蛋白提供結(jié)合蛋白5)5)對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起保護(hù)作用對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起保護(hù)作用u血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。u常用血清有胎牛血清（常用血清有胎牛血清（FBS),小牛血清小牛血清(CS), ,兔兔血清血清, ,馬血清等馬血清等, ,其中以胎牛血清質(zhì)量最好。其中以胎牛血清質(zhì)量最好。

25、u優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。u血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 56 ，30 30 分鐘分鐘u血清的消毒：過(guò)濾除菌血清的消毒：過(guò)濾除菌一般說(shuō)來(lái)含一般說(shuō)來(lái)含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加需加 10血清血清血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)

26、基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Serum-free medium)能支持動(dòng)物細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的不含血清的培養(yǎng)基通常由基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加已知成份(粘附因子，生長(zhǎng)因子，激素,酶抑制劑，微量元素等）。無(wú)血清培養(yǎng)基克服了含血清培養(yǎng)基中血清的各種成分含量不確定克服批次間質(zhì)量差異大，常污染病毒或支原體，給培養(yǎng)物的后加工和提純帶來(lái)困難合成培養(yǎng)基合

27、成培養(yǎng)基： 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如養(yǎng)基，如Hams/F12, MEM、RPMI-1640,DMEM等。等。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定成本低。標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定成本低。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞, 生長(zhǎng)需要。生長(zhǎng)需要。 主要成分主要成分：1)氨基酸氨基酸：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料，有，有12種種 必需氨基酸必需氨基酸，此外谷，此外

28、谷 氨酰胺起到氨酰胺起到很很 重要作用重要作用.2)單糖單糖：細(xì)胞有氧酵解和無(wú)氧：細(xì)胞有氧酵解和無(wú)氧酵解，六酵解，六碳糖碳糖是是 主要能源主要能源.3)維生素維生素：扮演輔酶，輔基的角色，必不可少：扮演輔酶，輔基的角色，必不可少。 如生物素如生物素、葉酸、泛酸等葉酸、泛酸等.4)無(wú)機(jī)無(wú)機(jī)離子和微量元素離子和微量元素：鈉、鉀、鈣、鎂、硒等：鈉、鉀、鈣、鎂、硒等. 合成培養(yǎng)基種類199,109199,109培養(yǎng)基培養(yǎng)基：19501950年研制成功，是為培養(yǎng)雞胚組織而年研制成功，是為培養(yǎng)雞胚組織而設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)的. .HamF10,HamF12HamF10,HamF12培養(yǎng)基培養(yǎng)基：19631963年研

29、制成功，是為培養(yǎng)小鼠年研制成功，是為培養(yǎng)小鼠二倍體細(xì)胞設(shè)計(jì)，同時(shí)也適合人類二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)二倍體細(xì)胞設(shè)計(jì)，同時(shí)也適合人類二倍體細(xì)胞的培養(yǎng). .RPIM1640RPIM1640培養(yǎng)基培養(yǎng)基：最初為培養(yǎng)小鼠白血病細(xì)胞而設(shè)計(jì)的，：最初為培養(yǎng)小鼠白血病細(xì)胞而設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞培養(yǎng). .MEMMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基：最限量：最限量EagleEagle培養(yǎng)基，僅有培養(yǎng)基，僅有1212種必需氨基酸，種必需氨基酸，適合特殊細(xì)胞培養(yǎng)。適合特殊細(xì)胞培養(yǎng)。DMEMDMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是在：是在MEMMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的，分為高糖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的，分為

30、高糖型和低糖型。高糖型有利于細(xì)胞貼壁。型和低糖型。高糖型有利于細(xì)胞貼壁。IMDMIMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是對(duì)：是對(duì)DMEMDMEM的改良，有的改良，有4242種成分，增加氨基酸種成分，增加氨基酸和維生素，并有和維生素，并有HEPESHEPES，適合于培養(yǎng)低密度，生長(zhǎng)困難細(xì)，適合于培養(yǎng)低密度，生長(zhǎng)困難細(xì)胞。胞。四抗菌素的使用：四抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、最終使用濃度為每毫升青霉素、最終使用濃度

31、為每毫升100單位，單位，鏈霉素每毫升鏈霉素每毫升100微克。微克。慶大霉素：每毫升慶大霉素：每毫升100單位，使用方便、廣單位，使用方便、廣譜、穩(wěn)定。譜、穩(wěn)定。五. . pHpH調(diào)整液1.碳酸氫鈉 :每升培養(yǎng)液中必需加2克,以保 證培養(yǎng)基在5%CO2環(huán)境下pH穩(wěn)定.2.HEPES:是一種弱酸,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,當(dāng)培 養(yǎng)基脫離5%CO2環(huán)境,能維持pH在 7左右,能配成100倍濃縮液,使用 時(shí)添加,終濃度在0.01-0.05mol/L.合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 8095血清血清 520碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素青、鏈霉素 100u（或或ug）/ml六六完全培養(yǎng)基的組成完全培養(yǎng)基的組成細(xì)

32、胞傳代方法細(xì)胞傳代方法懸浮懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法離心法傳代：離心（傳代：離心（1000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分）去上清，沉）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除培養(yǎng)液去除 l/22/3，然后用吸管直接吹打形成，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。細(xì)胞懸液再傳代。 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）細(xì)胞） 此此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落

33、下來(lái)，進(jìn)行傳代。行傳代。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用采用酶消化法傳代。常用的消化液有酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法：貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法：1 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2 加入加入12 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)） 靜靜置置210 分鐘（顯微分鐘（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。3 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4 用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。形成細(xì)胞懸液。5

34、 吸取吸取1/21/4細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。6 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。7 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)細(xì) 胞胞 計(jì)計(jì) 數(shù)數(shù) 培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。術(shù)手段之一。任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。 1 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn) 單個(gè)單個(gè)細(xì)

35、胞在體外增殖細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)代以上，其后代所組成的細(xì)胞群形成肉眼可見(jiàn)的克?。ò盒纬扇庋劭梢?jiàn)的克?。?0個(gè)細(xì)胞以上）?？寺⌒蝹€(gè)細(xì)胞以上）?？寺⌒纬陕视脕?lái)表示細(xì)胞的增殖能力成率用來(lái)表示細(xì)胞的增殖能力 克隆克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)數(shù)100% 缺點(diǎn)：操作繁瑣缺點(diǎn)：操作繁瑣 優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠?jī)?yōu)點(diǎn)：精確、可靠2 2、臺(tái)、臺(tái) 盼盼 藍(lán)藍(lán) 法法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞恬力胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞恬力 優(yōu)點(diǎn)：比較實(shí)用優(yōu)點(diǎn)：比較實(shí)用 缺點(diǎn)：精確度不夠缺點(diǎn)：精確度不夠3 3 四

36、唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法四唑鹽（四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)）商品名為噻唑藍(lán)四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中線粒體脫氫酶四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中線粒體脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值值MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、

37、法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒細(xì)胞毒性性試驗(yàn)試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。操作步驟操作步驟（1 1）單細(xì)胞懸液接種于）單細(xì)胞懸液接種于9696孔培養(yǎng)板；孔培養(yǎng)板；2-32-3萬(wàn)細(xì)胞萬(wàn)細(xì)胞/ /孔，每孔培養(yǎng)基總量孔，每孔培養(yǎng)基總量100ul100ul（9696孔培養(yǎng)板每孔培養(yǎng)板每孔容積孔容積370370微升），微升），3737、5 5COCO2 2培養(yǎng)箱中培培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）（2 2）加入）加入5mg5mg毫升的毫升的MTTMTT液（液（20ul20ul孔）；繼孔）；繼續(xù)培養(yǎng)續(xù)培養(yǎng)4 4小時(shí)。

38、小時(shí)。（3 3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSODMSO液（液（150ul150ul孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩1010分鐘，使結(jié)晶物溶解。分鐘，使結(jié)晶物溶解。（4 4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔ODOD值（檢測(cè)波長(zhǎng)為值（檢測(cè)波長(zhǎng)為570 570 nmnm）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以

39、下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。重結(jié)晶。慢慢 凍凍 程程 序序標(biāo)準(zhǔn)程序：標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在當(dāng)溫度在-25 -25 以上時(shí)，以上時(shí)， 1 12 /min2 /min 當(dāng)溫度達(dá)當(dāng)溫度達(dá)-25 -25 以下時(shí)，以下時(shí)， 5 510 /min10 /min 當(dāng)溫度達(dá)當(dāng)溫度達(dá)-100-100時(shí)，可迅速放入液氮中時(shí)，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存器細(xì)胞凍存器簡(jiǎn)易程序簡(jiǎn)易程序： 將凍存管置將凍存管置4 4冷藏室冷藏室2 2小時(shí)，小時(shí)， 移置移置-20-20 冷凍室冷