初級(jí)檢驗(yàn)技師臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)2017年講義第三章免疫原和抗血清的制備

1、第三章免疫原和抗血清的制備第一節(jié)免疫原的制備免疫原指能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能在體內(nèi)外與抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。一、顆粒性抗原的制備細(xì)胞、細(xì)菌、寄生蟲等皆為顆粒性抗原。細(xì)胞抗原（如綿羊紅細(xì)胞）一般情況下經(jīng)生理鹽水或其他溶液洗凈，配制一定濃度即可。細(xì)菌抗原多用液體或固體培養(yǎng)物，經(jīng)集菌后處理。顆粒性抗原大多用靜脈內(nèi)注射免疫法。二、可溶性抗原的制備和純化（一）組織和可溶性抗原的粗提蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶、補(bǔ)體、細(xì)菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆為良好的可溶性抗原。1.組織勻漿的制備通常需要先將來(lái)源于人和動(dòng)物的組織和細(xì)胞破碎，再經(jīng)一定的方法純化，才能獲得所需的抗原。細(xì)胞

2、破碎方法有：（1）高速組織搗碎機(jī)法；（2）研磨法：組織勻漿液要離心沉淀，沉淀物為組織和細(xì)胞碎片，上清液為提取可溶性抗原的材料。2.細(xì)胞的破碎除上述機(jī)械搗碎獲取外，尚有酶處理法，常用胃蛋白酶或胰酶，可獲得游離的單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞抗原分膜蛋白抗原、細(xì)胞質(zhì)抗原（主要為細(xì)胞器）、細(xì)胞核與核膜抗原，制備這些抗原前均需將細(xì)胞破碎，方法有：（1）反復(fù)凍融法：-20冷凍，3037融化（2）超聲破碎法（3）自溶法（4）酶處理法：胃蛋白酶或胰酶（5）表面活性劑處理法：十二烷基硫酸鈉3.免疫球蛋白片段的制備五種免疫球蛋白都具抗原性，皆可提取及純化，但如分解成片段（如Fab片段、Fc片段、輕鏈片段等）作為免疫原可制備出分

3、辨力更高的特異性抗血清。制備方法有：（1）非共價(jià)鍵解離法：改變pH環(huán)境或用變性劑（2）共價(jià)鍵解離法（3）溴化氰裂解法（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶.木瓜酶可將IgG裂解成2個(gè)Fab片段及1個(gè)Fc片段；胃蛋白酶可將IgG裂解成F（ab）2個(gè)片段及數(shù)個(gè)小片段；胰蛋白酶可將IgG切成不規(guī)則的肽鏈。（二）可溶性抗原的提純和純化1.超速離心法：適用于少數(shù)大分子抗原或比重較輕的抗原，不適用于大多數(shù)中小分子抗原。2.選擇性沉淀法：選擇沉淀法是采用各種沉淀劑或某些條件使抗原成分沉淀的方法。核酸去除法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、聚合物沉淀法。其中鹽析法是最常被采用，通過(guò)硫酸銨使蛋白抗原進(jìn)行初篩，提取

4、丙種球蛋白及進(jìn)行抗原濃縮。3.凝膠過(guò)濾法：根據(jù)分子大小進(jìn)行分離純化。4.離子交換層析法：根據(jù)所帶電荷不同進(jìn)行純化分離。5.親和層析法：與生物分子間不同的親和性進(jìn)行分離。6.電泳法：蛋白質(zhì)在同一pH環(huán)境中，分子量和電荷不同，在電場(chǎng)中遷移速率不同進(jìn)行分離。（三）純化抗原的鑒定1.蛋白質(zhì)含量測(cè)定：常用的是紫外光吸收法，該法測(cè)定280nm和260nm的吸光度（A）值。2.分子量測(cè)定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法、凝膠過(guò)濾法等。3.純度鑒定采用醋酸纖維膜電泳、SDS-PAGE、毛細(xì)管電泳、等電聚焦、高效液相層析法等。4.免疫活性鑒定采用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法或ELISA法等。三、半抗原

5、性免疫原的制備半抗原指只具有抗原性而無(wú)免疫原性的物質(zhì)。多見于分子量小于4000的有機(jī)物質(zhì)。半抗原與載體相結(jié)合具有免疫原性。（一）載體1.蛋白質(zhì)：以牛血白蛋白最常見2.多肽聚合物：常用多聚賴氨酸3.大分子聚合物和某些顆粒聚乙烯吡咯烷酮、藥用炭、羧甲基纖維素等皆常用。（二）半抗原與載體的連接方法1.物理方法：通過(guò)電荷和微孔吸附半抗原。2.化學(xué)方法：通過(guò)功能基團(tuán)將半抗原與載體連接。（三）半抗原性免疫原的鑒定20個(gè)以上半抗原連接在一個(gè)載體分子上，才能有效刺激免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體。第二節(jié)免疫佐劑一、佐劑的種類1.化合物：包括氫氧化鋁、礦物油、吐溫-80、弗氏不完全佐劑（羊毛脂與液狀石蠟的混合物）以及人工合成

6、的多聚肌苷酸：胞苷酸、脂質(zhì)體等。2.生物制劑：經(jīng)處理改造的細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物，如卡介苗、脂多糖（LPS）和類脂A、源于分枝桿菌的胞壁酰二肽等；細(xì)胞因子及熱休克蛋白等。最常用于免疫動(dòng)物的佐劑是弗氏佐劑，弗氏佐劑分為弗氏完全佐劑（弗氏不完全佐劑加卡介苗）和弗氏不完全佐劑兩種。使用時(shí)加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原與佐劑形成油包水乳劑。佐劑和抗原的比例為1:1。乳化的方法有兩種：研磨法。攪拌混合法：本法優(yōu)點(diǎn)是無(wú)菌操作，節(jié)省抗原或佐劑，且可用此注射器直接注射。缺點(diǎn)是不易乳化完全。二、佐劑的作用機(jī)制1.改變抗原的物理性狀，延緩抗原降解和排除，從而更有效地刺激免疫系統(tǒng)；2.刺激單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)其處理

7、和提呈抗原的能力；3.刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化；4.改變抗體的產(chǎn)生類型和誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。第三節(jié)抗血清的制備抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動(dòng)物，該動(dòng)物在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對(duì)某一抗原多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體。采集動(dòng)物血液，分離含有抗體的血清，即為抗血清。一、免疫動(dòng)物的選擇常用的有家兔、綿羊、豚鼠、雞、山羊和馬。1.抗原來(lái)源與動(dòng)物種屬差異越大，免疫原性越強(qiáng)，免疫效果越好。2.抗體需求量大時(shí)，可選用馬、綿羊等大動(dòng)物?？寡逍枨罅可贂r(shí)，可選用家兔、豚鼠和雞等小動(dòng)物。3.抗血清分為R型和H型抗血清來(lái)源合適范圍用途

8、R型家兔等小動(dòng)物較寬診斷試劑H型馬等大動(dòng)物較窄免疫治療4.對(duì)于蛋白質(zhì)抗原大部分動(dòng)物皆適合，常用的是山羊和家兔。在某些動(dòng)物體內(nèi)有類似物質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)抗原對(duì)這些動(dòng)物免疫原性極差，如IgE對(duì)綿羊、胰島素對(duì)家兔、多種酶類對(duì)山羊，免疫后均不易產(chǎn)生抗體。二、免疫程序1.免疫原的劑量：由免疫原性的強(qiáng)弱、動(dòng)物的個(gè)體狀態(tài)和免疫時(shí)間確定。免疫原劑量過(guò)大或過(guò)小都可使動(dòng)物產(chǎn)生免疫耐受，在一定劑量范圍內(nèi)，免疫原劑量越大，產(chǎn)生的抗體效價(jià)越高。2.免疫途徑：有皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等途徑。皮內(nèi)或皮下免疫時(shí)一般采用多點(diǎn)注射。初次免疫一般選擇皮內(nèi)接種，加強(qiáng)免疫和顆粒性抗原一般選擇靜脈注射。寶貴抗原可選擇淋巴結(jié)內(nèi)微量

9、注射法。3.間隔時(shí)間：第1次與第2次免疫間隔時(shí)間以1020天為好，第3次及以后的間隔一般為710天。三、動(dòng)物采血法動(dòng)物經(jīng)免疫35次后，如抗血清鑒定合格，應(yīng)在末次免疫后57天及時(shí)采血。目前較常用的動(dòng)物采血方法有3種：頸動(dòng)脈采血法；心臟采血法；靜脈采血法。動(dòng)物采血后，應(yīng)盡快分離血清，分離血清的方法常采用室溫自然凝固，然后置37或4使血塊收縮后，收集血清。第四節(jié)抗血清的鑒定和保存一、抗血清的鑒定1.抗體特異性的鑒定 常用雙向免疫擴(kuò)散法。觀察沉淀線，若粗抗原及純抗原之間皆出現(xiàn)一條沉淀線，且兩者互相融合，則證明動(dòng)物已產(chǎn)生單價(jià)特異性抗體；若純化抗原出現(xiàn)一條，而粗抗原出現(xiàn)多條線，且其中一條沉淀線與純抗原沉淀

10、線相連接，也是成功的免疫，待取血后將雜抗體吸收去除，可以成為單價(jià)特異性抗體。若不出現(xiàn)沉淀線，表示免疫失敗。2.抗體效價(jià)的測(cè)定 顆粒性抗原采用凝集試驗(yàn)，可溶性抗原采用雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA等方法。測(cè)定抗體效價(jià)有兩種稀釋方法，一種是將經(jīng)過(guò)系列稀釋的血清分別與一個(gè)濃度的抗原反應(yīng)；另一種是同時(shí)稀釋抗原和抗血清，分別與不同濃度的抗血清進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（稱為棋盤滴定）。3.抗體純度的鑒定 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳等。4.抗體親和力的鑒定二、抗血清的保存1.28保存：用于短期保存；2.冷凍保存：是常用的抗體保存方法。將抗體分為小包裝，在-80-

11、20保存，一般可保存5年，效價(jià)不會(huì)明顯下降，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；3.真空干燥保存：用真空凍干機(jī)進(jìn)行干燥，封裝后可長(zhǎng)期保存，一般在冰箱中可保存510年。第五節(jié)抗血清的純化抗血清純化的目的是除去不相關(guān)成分，防止抗血清中的其他雜抗體干擾試驗(yàn)結(jié)果。最常見的是提取抗血清中的特異性IgG或單價(jià)抗體。一、特異性IgG抗體1.鹽析法多采用硫酸銨鹽析法或硫酸鈉鹽析法。2.凝膠過(guò)濾法血清蛋白的分級(jí)分離常用凝膠過(guò)濾法，該法過(guò)濾條件溫和，不影響IgG活性。常結(jié)合鹽析法提取IgG，鹽析法可以去除大部分雜蛋白，提高凝膠過(guò)濾法的分離效果。3.離子交換層析法4.親和層析法二、單價(jià)特異性抗血清單價(jià)特異性是指血清只與其特異性抗原發(fā)

12、生反應(yīng)。免疫得到的抗血清總是有抗白蛋白等雜抗體存在。雜抗體的去除有兩種方法：1.親和層析法2.吸附劑方法制備蛋白質(zhì)抗原時(shí)破碎組織細(xì)胞最簡(jiǎn)便的是A.反復(fù)凍融法B.超聲破碎法C.表面活性劑處理法D.自溶法E.酶處理法  正確答案A答案解析制備蛋白質(zhì)抗原時(shí)破碎組織細(xì)胞最簡(jiǎn)便的是反復(fù)凍融法。需制備10ml抗血清，應(yīng)選擇何種動(dòng)物A.家兔B.小白鼠C.馬D.綿羊E.猴  正確答案A答案解析抗體需求量大時(shí)，可選用馬、綿羊等大動(dòng)物。抗血清需求量少時(shí)，可選用家兔、豚鼠和雞等小動(dòng)物。下列佐劑中具有免疫原性的是A.脂多糖B.氫氧化鋁C.石蠟油D.羊毛脂E.多聚核苷酸 

13、; 正確答案A答案解析生物制劑具有免疫原性，所以具有免疫原性的是脂多糖。廠家生產(chǎn)的抗IgG制劑一般的保存方法為A.液體4保存B.液體-10保存C.真空干燥保存D.25保存E.加疊氮鈉保存  正確答案C答案解析抗血清的保存：28保存：用于短期保存；冷凍保存：是常用的抗體保存方法。將抗體分為小包裝，在-80-20保存，一般可保存5年，效價(jià)不會(huì)明顯下降，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；真空干燥保存：用真空凍干機(jī)進(jìn)行干燥，封裝后可長(zhǎng)期保存，一般在冰箱中可保存510年。最常用的半抗原載體是A.牛血清白蛋白B.牛甲狀腺球蛋白C.人血清白蛋白D.人甲狀腺球蛋白E.球蛋白  正確答案A答案解析半抗原載體常用的有人血白蛋白、牛血白蛋白、血藍(lán)蛋白、牛甲狀腺球蛋白等。以牛血白蛋白最常用。A.鹽析沉淀法B.有機(jī)溶劑