數(shù)量性狀的分子標(biāo)記QTL定位的原理和方法講義

1、 數(shù)量性狀的分子標(biāo)記(QTL定位的原理和方法講義)作物中大多數(shù)重要的農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀如產(chǎn)量、品質(zhì)、生育期、抗逆性等都是數(shù)量性狀。與質(zhì)量性狀不同，數(shù)量性狀受多基因控制，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，且易受環(huán)境影響，表現(xiàn)為連續(xù)變異，表現(xiàn)型與基因型之間沒有明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，對(duì)數(shù)量性狀的遺傳研究十分困難。長(zhǎng)期以來，只能借助于數(shù)理統(tǒng)計(jì)的手段，將控制數(shù)量性狀的多基因系統(tǒng)作為一個(gè)整體來研究，用平均值和方差來反映數(shù)量性狀的遺傳特征，無法了解單個(gè)基因的位置和效應(yīng)。這種狀況制約了人們?cè)谟N中對(duì)數(shù)量性狀的遺傳操縱能力。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為深入研究數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)提供了可能。控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置稱為數(shù)量性狀基

2、因座（QTL）。利用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖分析，可以檢測(cè)出QTL，即QTL定位（QTL mapping）。借助與QTL連鎖的分子標(biāo)記，就能夠在育種中對(duì)有關(guān)的QTL的遺傳動(dòng)態(tài)進(jìn)行跟蹤，從而大大增強(qiáng)人們對(duì)數(shù)量性狀的遺傳操縱能力，提高育種中對(duì)數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的準(zhǔn)確性和預(yù)見性。因此，QTL定位是一項(xiàng)十分重要的基礎(chǔ)研究工作。1988年，Paterson等發(fā)表了第一篇應(yīng)用RFLP連鎖圖在番茄中定位QTL的論文。之后，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展以及許多物種中分子連鎖圖譜的相繼建成，全世界出現(xiàn)了研究QTL的熱潮，每年發(fā)表有關(guān)QTL研究的論文數(shù)量幾乎呈指數(shù)增長(zhǎng)（圖5.1），顯示了該研究領(lǐng)域的勃勃生機(jī)。目前，

3、 QTL定位研究已在許多重要作物中展開，并且進(jìn)展迅速。本章主要介紹QTL定位的原理和方法。圖5.119861998年期間國(guó)際上每年發(fā)表有關(guān)QTL研究的論文的數(shù)量. 數(shù)據(jù)從英國(guó)BIDS信息系統(tǒng)檢索得到第一節(jié) 數(shù)量性狀基因的初級(jí)定位QTL定位就是檢測(cè)分子標(biāo)記（下面將簡(jiǎn)稱為標(biāo)記）與QTL間的連鎖關(guān)系，同時(shí)還可估計(jì)QTL的效應(yīng)。QTL定位研究常用的群體有F2、BC、RI和DH。這些群體可稱為初級(jí)群體（primary population）。用初級(jí)群體進(jìn)行的QTL定位的精度通常不會(huì)很高，因此只是初級(jí)定位。由于數(shù)量性狀是連續(xù)變異的，無法明確分組，因此QTL定位不能完全套用孟德爾遺傳學(xué)的連鎖分析方法，而必須

4、發(fā)展特殊的統(tǒng)計(jì)分析方法。80年代末以來，這方面的研究十分活躍，已經(jīng)發(fā)展了不少Q(mào)TL定位方法。一、QTL定位的基本原理和方法孟德爾遺傳學(xué)分析非等位基因間連鎖關(guān)系的基本方法是，首先根據(jù)個(gè)體表現(xiàn)型進(jìn)行分組，然后根據(jù)各組間的比例，檢驗(yàn)非等位基因間是否存在連鎖，并估計(jì)重組率。QTL定位實(shí)質(zhì)上就是分析分子標(biāo)記與QTL之間的連鎖關(guān)系，其基本原理仍然是對(duì)個(gè)體進(jìn)行分組，但這種分組是不完全的。根據(jù)個(gè)體分組依據(jù)的不同，現(xiàn)有的QTL定位方法可以分成兩大類。一類是以標(biāo)記基因型為依據(jù)進(jìn)行分組的，稱為基于標(biāo)記的分析法（marker-based analysis； Soller and Beckmann 1990）；另一類是

5、以數(shù)量性狀表型為依據(jù)進(jìn)行分組的，稱為基于性狀的分析法（trait-based analysis；Keightley and Bulfield 1993）。（一）基于標(biāo)記的分析法如果某個(gè)標(biāo)記與某個(gè)QTL連鎖，那么在雜交后代中，該標(biāo)記與QTL之間就會(huì)發(fā)生一定程度的共分離，于是，在該標(biāo)記的不同基因型中，QTL的基因型頻率分布（分離比例）將不同（圖5.2），因而在該標(biāo)記的不同基因型之間，在數(shù)量性狀的分布、均值和方差上都存在差異?；跇?biāo)記的分析法正是通過檢驗(yàn)標(biāo)記的不同基因型之間的這些差異來推知標(biāo)記是否與QTL連鎖的。在分子標(biāo)記技術(shù)出現(xiàn)之前提出的基于標(biāo)記的分析法主要是針對(duì)單標(biāo)記分析的，即每次只分析一個(gè)標(biāo)記

6、，這是因?yàn)楫?dāng)時(shí)可利用的遺傳標(biāo)記（主要是形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記）數(shù)量稀少，難以在一個(gè)試驗(yàn)群體中建立起完整的標(biāo)記連鎖圖譜。隨著高密度分子標(biāo)記連鎖圖譜的出現(xiàn)，單標(biāo)記分析方法暴露出了不能充分利用分子標(biāo)記圖譜所提供的遺傳信息的缺點(diǎn)。為了能更好地挖掘分子標(biāo)記圖譜的潛力，更多、更準(zhǔn)確地定位出QTL，科學(xué)家們相繼開發(fā)出了許多新的QTL定位方法，總的趨勢(shì)是朝著多標(biāo)記分析（即同時(shí)用多個(gè)標(biāo)記進(jìn)行分析）的方向發(fā)展。根據(jù)所采用的統(tǒng)計(jì)遺傳模型，現(xiàn)有的基于標(biāo)記的分析方法大體上可分成四類，即：均值差檢驗(yàn)法、性狀標(biāo)記回歸法、性狀QTL回歸法及性狀QTL標(biāo)記回歸法。這些方法的原理將在后面分別介紹。圖5.2DH群體中某QTL的基因型Q

7、Q和qq在連鎖標(biāo)記基因型MM和mm中的頻率分布（分離比例）. r為標(biāo)記與QTL間的重組率. 僅當(dāng)r = 0.5（亦即標(biāo)記與QTL間沒有連鎖）時(shí), QQ和qq在MM和mm中的頻率分布才相同（二）基于性狀的分析法雖然數(shù)量性狀在一個(gè)分離群體（如DH群體）中是連續(xù)變異的，但如果淘汰大多數(shù)中間類型，則高值和低值兩種極端表型的個(gè)體就可以明確地區(qū)分開來，分成兩組。對(duì)每個(gè)QTL而言，在高值表型組中應(yīng)存在較多的高值基因型（如QQ），而低值組中應(yīng)存在較多的低值基因型（如qq；圖5.3）。如果某個(gè)標(biāo)記與QTL有連鎖，那么，該標(biāo)記與QTL之間就會(huì)發(fā)生一定程度的共分離，于是其基因型分離比例（頻率分布）在兩組中都會(huì)偏離孟

8、德爾規(guī)律（圖5.3）。用卡平方測(cè)驗(yàn)方法對(duì)兩組或其中一組檢驗(yàn)這種偏離，就能推斷該標(biāo)記是否與QTL連鎖。圖5.3基于性狀的分析法和分離體分組混合分析法的原理. 在DH群體中，與QTL連鎖的遺傳標(biāo)記的兩種基因型的分離比例在高值組和低值組中都會(huì)偏離1 : 1的孟德爾分離規(guī)律，其電泳帶型在高值組DNA和低值組DNA間也會(huì)表現(xiàn)出差異, 且分別與高值親本和低值親本相似還有一種更簡(jiǎn)單的做法，就是將高值和低值兩組個(gè)體的DNA分別混合，形成兩個(gè)DNA池，然后檢驗(yàn)兩池間的遺傳多態(tài)性。在兩池間表現(xiàn)出差異的分子標(biāo)記即被認(rèn)為與QTL連鎖（圖5.3）。這種方法稱為分離體分組混合分析法（BSA法；Darvasi and So

9、ller 1994；參見第4章）?；谛誀畹姆治龇椒ǎㄌ貏e是BSA法）的突出優(yōu)點(diǎn)是，可以大幅度減少需要檢測(cè)的DNA樣品的數(shù)量，從而降低分子標(biāo)記分析的費(fèi)用。它特別適合于對(duì)一些抗性（包括抗病、抗蟲、抗逆）性狀的基因定位，這是因?yàn)?，抗性鑒定試驗(yàn)常常造成敏感個(gè)體（基因型）的死亡，只有具有抗性的個(gè)體才能夠存活，于是只能對(duì)表現(xiàn)抗的極端個(gè)體進(jìn)行分子標(biāo)記分析，這正好符合基于性狀的分析法?；谛誀畹姆治龇ǖ娜秉c(diǎn)是，它只能用于單個(gè)性狀的QTL定位，且靈敏度和精確度都較低，一般只能檢測(cè)出效應(yīng)較大的QTL。因此，基于性狀的分析法目前用得不多，主要還是采用基于標(biāo)記的分析法。下面著重對(duì)基于標(biāo)記的分析法進(jìn)行介紹。二、均值差

10、檢驗(yàn)法均值差檢驗(yàn)法的基本思想是檢驗(yàn)同一標(biāo)記座位上不同基因型間數(shù)量性狀均值的差異，若差異顯著，則表明被檢標(biāo)記與QTL連鎖。單標(biāo)記均值差檢驗(yàn)法包括t測(cè)驗(yàn)法（Simpson 1989）和方差分析法（Soller et al. 1976; 李維明等 1993）。凡是每個(gè)標(biāo)記只有兩種基因型的群體（包括BC、DH、RI）都可以使用t測(cè)驗(yàn)法。以DH群體為例，由圖5.2可知，當(dāng)某個(gè)標(biāo)記與一個(gè)QTL連鎖時(shí)，兩種標(biāo)記基因型（MM和mm）的性狀均值（mMM和mmm）分別為： (5.1) (5.2)式中，mQQ和mqq分別是QTL基因型QQ和qq的表型均值，r為標(biāo)記與QTL間的重組率。比較式(5.1)和(5.2)可以

11、看出，僅當(dāng)r = 0.5，亦即標(biāo)記與QTL沒有連鎖時(shí)，才有mMM = mmm（）；而只要r < 0.5，亦即標(biāo)記與QTL間存在連鎖，則總有mMM ¹ mmm。而且，r值越小，標(biāo)記與QTL間連鎖越緊密，則mMM與mmm之間的差異就越大。當(dāng)r = 0，亦即標(biāo)記與QTL之間完全連鎖時(shí)，標(biāo)記基因型間的均值差異達(dá)到最大，這時(shí)有mMM - mmm = mQQ - mqq。因此，用t測(cè)驗(yàn)方法檢驗(yàn)兩種標(biāo)記基因型間的數(shù)量性狀表型均值差異是否顯著，就能推斷該標(biāo)記是否與QTL連鎖。t值越大，即顯著性越高，則連鎖越緊密。如果群體中每個(gè)標(biāo)記存在3種基因型（如F2群體），或者盡管群體中每個(gè)標(biāo)記只有兩種基因

12、型（如DH、RI群體），但試驗(yàn)中設(shè)置了重復(fù)（李維明等 1993），則可以采用方差分析的方法來檢測(cè)標(biāo)記與QTL之間的連鎖關(guān)系。以F2群體為例。假設(shè)某個(gè)標(biāo)記與一個(gè)QTL連鎖，采用與圖5.2類似的推導(dǎo)方法，可以得到3種標(biāo)記基因型的性狀均值分別為： (5.3) (5.4) (5.5)式中所用符號(hào)的含義與式(5.1)和(5.2)的相似。比較式(5.3) (5.5)，可以看出，與上面DH群體的情形相似，僅當(dāng)標(biāo)記與QTL間的重組率為，亦即標(biāo)記與QTL間沒有連鎖時(shí)，才有mMM = mMm = mmm（）；而只要r < 0.5，亦即標(biāo)記與QTL間存在連鎖，則總有mMM ¹ mMm ¹

13、mmm。因此，用單因素方差分析法檢驗(yàn)3種標(biāo)記基因型間的性狀均值差異是否顯著，就能推知該標(biāo)記是否與QTL連鎖。標(biāo)記與QTL間連鎖越緊密，則標(biāo)記基因型間均值的差異就越大，方差分析中F測(cè)驗(yàn)得到的F值也越大（即顯著性越高）。單標(biāo)記均值差檢驗(yàn)法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單直觀。一般而言，標(biāo)記離QTL越近，它與QTL間的重組率就越小，則其t值或F值就越大；反之，標(biāo)記離QTL越遠(yuǎn)，它與QTL間的重組率就越大，則其t值或F值就越小。因此，根據(jù)染色體上各個(gè)標(biāo)記的t值或F值的大小，可以大致判斷出QTL的位置。但是，單標(biāo)記均值差檢驗(yàn)法不能估計(jì)QTL的具體位置和效應(yīng)，靈敏度較低，且一般不適用于一條染色體上存在多個(gè)QTL的情形。當(dāng)兩個(gè)

14、QTL呈相引連鎖（即兩增效基因連鎖在一起或兩減效基因連鎖在一起）且相距不太遠(yuǎn)時(shí)，由于兩QTL的效應(yīng)相互累加，可能會(huì)使得位于兩QTL之間的標(biāo)記表現(xiàn)出最大的t值或F值，從而導(dǎo)致無法識(shí)別那兩個(gè)真實(shí)QTL，卻錯(cuò)誤地認(rèn)為在它們之間的某個(gè)位置上存在一個(gè)QTL。這個(gè)推斷出的QTL顯然是虛假的，是一個(gè)“幻影QTL”（ghost QTL）。相反，當(dāng)兩個(gè)QTL呈相斥連鎖（即一個(gè)增效基因與一個(gè)減效基因連鎖在一起）且相距不太遠(yuǎn)時(shí)，由于兩QTL的效應(yīng)相互抵消，可能會(huì)使得兩QTL附近的標(biāo)記表現(xiàn)出很小的t值或F值，從而無法檢測(cè)出這兩個(gè)QTL。由于這些局限性，目前單標(biāo)記均值差檢驗(yàn)法僅用于對(duì)數(shù)據(jù)的初步分析。對(duì)單標(biāo)記均值差檢驗(yàn)法

15、的一種改進(jìn)方法，是將同一條染色體上各標(biāo)記的t測(cè)驗(yàn)或方差分析聯(lián)合于一個(gè)回歸分析之中，稱為聯(lián)合定位法（joint mapping；Wu and Li 1994, 1996a, b）。下面以DH群體為例來說明聯(lián)合定位法的原理，它也適用于BC和RI群體。至于F2群體的聯(lián)合定位法，讀者可參閱Wu 和 Li (1996b)。從式(5.1)和(5.2)可以得到： (5.6)令y = mMM - mmm，x = 1 2r，b = mQQ - mqq，則式(5.6)可寫成 (5.7)可以看出，式(5.7)形式上恰好是一個(gè)截距為零的一元線性回歸方程。假設(shè)Haldane作圖函數(shù)成立（參見第三章），則有 (5.8)或

16、 (5.9)式中，zM和zQ分別是標(biāo)記和QTL在染色體上的位置，以厘摩（cM）為單位。在完整的標(biāo)記連鎖圖上，每個(gè)標(biāo)記的位置都是已知的。因此，在式(5.9)中，只有QTL的位置zQ是未知的。當(dāng)zQ值給定時(shí)，也就確定了。如果一條染色體上有個(gè)標(biāo)記，那么在zQ值給定的情況下，就有對(duì)觀察值：(yi, xi), i = 1, 2, , n。這樣，就能應(yīng)用最小二乘法配合方程(5.7)。沿著整條染色體以一定步長(zhǎng)（如1 cM）改變zQ的值，必能找到某一點(diǎn)（），使方程(5.7)配合得最好（即剩余平方和RSS達(dá)到最??；圖5.4）。那么，該點(diǎn)（）即為QTL位置的估計(jì)值，而得到的回歸系數(shù)即為QTL效應(yīng)的估計(jì)值。需要指出

17、的是，由于同一條染色體上的標(biāo)記互相連鎖，因而不同觀察值yi (i = 1, 2, , n)之間不是相互獨(dú)立的。因此，應(yīng)使用廣義最小二乘法來配合方程(5.7)，才能獲得最小估計(jì)誤差。方程(5.7)可以推廣到一條染色體上存在多個(gè)（如個(gè)）QTL的情形（圖5.4），這時(shí)方程的形式為： (5.10)式中，bj為第j個(gè)QTL的效應(yīng)值；xj取決于標(biāo)記與第j個(gè)QTL的之間的圖距。只要染色體上有足夠多的標(biāo)記，用方程(5.10)原則上可以定位任意多個(gè)QTL。圖5.4QTL聯(lián)合定位的一個(gè)模擬例子. 連鎖圖上每隔10cM有一個(gè)標(biāo)記, 黑色三角形示QTL的真實(shí)位置, 剩余平方和曲線最低點(diǎn)為QTL的估計(jì)位置, 水平點(diǎn)線示

18、, 它與每個(gè)QTL的剩余平方和曲線的兩個(gè)交點(diǎn)確定了該QTL位置的95%置信區(qū)間（引自Wu and Li 1996a）聯(lián)合定位法的優(yōu)點(diǎn)是綜合利用了一條染色體上所有標(biāo)記的遺傳信息，所以提高了靈敏度和精確度，并可同時(shí)估計(jì)多個(gè)QTL的位置和效應(yīng)，而且與性狀分布無關(guān)，適用范圍廣，計(jì)算簡(jiǎn)單。不足之處是使用矩量（均值）而非原始觀察數(shù)據(jù)，因而要求有較大的實(shí)驗(yàn)群體。另外，聯(lián)合定位法對(duì)分子標(biāo)記圖譜質(zhì)量的要求較高，這是它在實(shí)際應(yīng)用中的主要限制因素。三、性狀-標(biāo)記回歸法性狀-標(biāo)記回歸法是將個(gè)體的數(shù)量性狀表型值對(duì)單個(gè)標(biāo)記（Soller et al. 1976）或多個(gè)標(biāo)記（Rodolphe and Lefort 1993

19、）的基因型進(jìn)行回歸分析。前者屬于單標(biāo)記分析的方法，可以看作是后者的一種特例，目前已很少使用。所以下面我們只需介紹性狀對(duì)多標(biāo)記回歸分析的方法。仍以DH群體為例。這時(shí)的多標(biāo)記的性狀-標(biāo)記回歸模型為： (5.11)式中，yi為第i個(gè)體的性狀值；m為模型均值；bj為第j標(biāo)記的偏回歸系數(shù)；xij為第i個(gè)體第j標(biāo)記基因型的指示變量，依標(biāo)記基因型為MM或mm而取值1或0；m為標(biāo)記個(gè)數(shù)；ei為隨機(jī)誤差。式(5.11)是一個(gè)多元線性回歸模型，可以用最小二乘法來配合。偏回歸系數(shù)的大小反映了各個(gè)標(biāo)記與數(shù)量性狀的相關(guān)程度。一般而言，如果某標(biāo)記的偏回歸達(dá)到顯著水平，則說明在該標(biāo)記附近可能存在QTL。但是，性狀-標(biāo)記回歸

20、法通常不能給出QTL位置和效應(yīng)的估計(jì)值，除非QTL正好位于標(biāo)記座位上，這時(shí)的偏回歸系數(shù)就是QTL的效應(yīng)值。不過，根據(jù)各標(biāo)記回歸系數(shù)的顯著性，能夠大致判斷出可能存在QTL的染色體區(qū)域。值得提到的是，性狀-標(biāo)記回歸有一個(gè)有趣的統(tǒng)計(jì)特性。這就是，在回歸中，一個(gè)QTL的效應(yīng)只被其兩側(cè)相鄰標(biāo)記的偏回歸系數(shù)所吸收，而不會(huì)影響到該標(biāo)記區(qū)間之外的標(biāo)記。這一特性非常重要。后面我們將看到，這一特性對(duì)提高QTL定位的準(zhǔn)確性很有幫助。四、性狀-QTL回歸法性狀-QTL回歸法是將個(gè)體的數(shù)量性狀表型值對(duì)假設(shè)存在的某個(gè)或某些QTL的基因型進(jìn)行回歸分析。以DH群體為例，單個(gè)QTL的回歸模型為： (5.12)式中，yi為第i個(gè)

21、體的表型值；m為模型均值；b為QTL的效應(yīng)；xi為第i個(gè)體的QTL基因型的指示變量，依QTL基因型為QQ或qq而取值1或0；ei為隨機(jī)誤差。由于被檢QTL的基因型是未知的，因而xi的值實(shí)際上是不確定的，或者說是“缺失”的。在這種情況下，只能根據(jù)與QTL連鎖的標(biāo)記的基因型來推斷xi為1或0的概率，并用似然比檢驗(yàn)法來估計(jì)參數(shù)和檢驗(yàn)回歸顯著性，即 (5.13)或 (5.14)其中L(b = 0)和L(b ¹ 0)分別表示b = 0和b ¹ 0時(shí)的最大似然值（注：LR與LOD之間存在轉(zhuǎn)換關(guān)系：LOD » 0.217LR）。當(dāng)似然比統(tǒng)計(jì)量LR或LOD的值大于給定的顯著閾值時(shí)

22、，則認(rèn)為，即假定的QTL的效應(yīng)不為零，因而可推斷QTL存在。早期的性狀-QTL回歸分析是利用單個(gè)連鎖標(biāo)記來推斷xi取值概率的，亦即屬于單標(biāo)記分析的方法（Simpson 1989），目前已很少使用。分子標(biāo)記技術(shù)出現(xiàn)之后，Lander和Botstein（1989）提出了更為準(zhǔn)確的方法，即用被檢QTL兩側(cè)相鄰的連鎖標(biāo)記來推斷xi取值的概率（表5.1），稱為區(qū)間定位法（interval mapping）。由表5.1可以看出，xi取值的概率取決于QTL與兩側(cè)相鄰標(biāo)記間的重組率或圖距。因此，以一定的步長(zhǎng)（如1 cM），沿整條染色體逐步改變假設(shè)存在的QTL的位置，就能得到LOD（或LR）值沿染色體變化的曲線

23、。大于顯著臨界值的LOD曲線高峰所對(duì)應(yīng)的染色體位置就是存在QTL可能性最大的位置（圖5.5）。表5.1在DH群體中用兩側(cè)相鄰標(biāo)記推斷QTL基因型概率及其指示變量的期望值標(biāo)記基因型QQQq期望值M1M1M2M2M1M1m2m2m1m1M2M2m1m1m2m2注：M1-m1和M2-m2分別為QTL左側(cè)和右側(cè)的相鄰標(biāo)記；、和分別為QTL與左側(cè)標(biāo)記和右側(cè)標(biāo)記之間及左、右兩標(biāo)記之間的重組率；，其中為符合系數(shù)圖5.5番茄第10號(hào)染色體上果實(shí)性狀QTL區(qū)間定位的一個(gè)例子. LOD曲線超過顯著閾值（水平線表示）的峰頂為QTL的估計(jì)位置. 虛線為果實(shí)pH值的LOD曲線，其高峰顯示了在染色體端部和中部各存在一個(gè)Q

24、TL. 下方兩條分別為果實(shí)重量和果實(shí)可溶固形物濃度的LOD曲線, 均沒顯示QTL的存在（引自Lynch and Walsh 1998）對(duì)模型(5.12)的最大似然估計(jì)需要進(jìn)行迭代運(yùn)算，所以計(jì)算上比較繁瑣費(fèi)時(shí)。如果讓自變量xi取其期望值（表5.1），亦即使xi有個(gè)確定值，則模型(5.12)就可用最小二乘法進(jìn)行配合（Haley and Knott 1992），從而使計(jì)算大為簡(jiǎn)化、速度大為提高。為了便于與原來基于最大似然估計(jì)的區(qū)間定位法進(jìn)行比較，在最小二乘估計(jì)中也可以用似然比來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn)。這時(shí)的似然比統(tǒng)計(jì)量為： (5.15)其中n為樣本大?。▊€(gè)體數(shù)）。研究表明，基于最小二乘估計(jì)的區(qū)間定位法與

25、基于最大似然估計(jì)的區(qū)間定位法所得的結(jié)果非常接近（Haley and Knott 1992）。區(qū)間定位法提出后，得到了廣泛應(yīng)用，對(duì)QTL定位研究的發(fā)展起到了重要的推動(dòng)作用。但區(qū)間定位法也存在明顯的缺點(diǎn)。當(dāng)一條染色體上同時(shí)存在一個(gè)以上的QTL時(shí)，區(qū)間定位法也會(huì)出現(xiàn)與前述單標(biāo)記均值差檢驗(yàn)法相似的問題，或者檢測(cè)到“幻影QTL”（當(dāng)兩個(gè)QTL相引連鎖時(shí)），或者檢測(cè)QTL的靈敏度（統(tǒng)計(jì)功效）降低（當(dāng)兩個(gè)QTL為相斥連鎖時(shí)），這是因?yàn)樗鼰o法排除被檢區(qū)間之外的QTL對(duì)被檢區(qū)間的影響。為克服區(qū)間定位法的缺點(diǎn)，不少學(xué)者提出了改進(jìn)意見。Haley和Knott（1992）建議同時(shí)對(duì)多個(gè)可能存在的QTL（標(biāo)記區(qū)間）進(jìn)行

26、回歸分析，這時(shí)的回歸模型形式上與(5.11)相同，但其自變量是QTL而非標(biāo)記，其基因型指示變量xij也取期望值。該方法的缺點(diǎn)是，必須確定染色體上到底有多少個(gè)可能存在的QTL，這往往并不容易，因而在回歸模型的選擇上帶有較大的任意性。另外，配合包含多個(gè)QTL的回歸模型需要進(jìn)行多維搜索，這也增加了計(jì)算上的難度。Moreno-Gonzalez（1992）提出了另一種方法，先假定所有標(biāo)記區(qū)間都包含一個(gè)QTL，且位于區(qū)間的中點(diǎn)，然后通過逐步回歸分析篩選出偏回歸顯著的標(biāo)記區(qū)間（QTL）。顯然，僅當(dāng)分子標(biāo)記圖譜較密且標(biāo)記在染色體上分布較均勻時(shí)，這種方法才可能是有效的。五、性狀-QTL-標(biāo)記回歸法對(duì)區(qū)間定位法最

27、有效的改進(jìn)方法是將它與多標(biāo)記的性狀-標(biāo)記回歸法相結(jié)合。根據(jù)性狀-標(biāo)記回歸中每個(gè)QTL的效應(yīng)只被其兩側(cè)相鄰標(biāo)記所吸收的統(tǒng)計(jì)特性，可以用被檢區(qū)間以外的部分（Jansen 1993; Zeng 1994）或全部（Zeng 1994）標(biāo)記作為回歸模型中的余因子（cofactor）來消除其它QTL或遺傳背景對(duì)被檢區(qū)間的影響。根據(jù)這一思想，Jansen（1993）和Zeng（1994）分別提出了多QTL模型（multiple-QTL model）和復(fù)合區(qū)間定位法（composite interval mapping），其中復(fù)合區(qū)間定位法由于直觀性較好、計(jì)算上易于自動(dòng)化而被普遍接受和廣泛應(yīng)用，已逐步取代區(qū)間

28、定位法。這里仍以DH群體為例，其復(fù)合區(qū)間定位的統(tǒng)計(jì)模型為： (5.16)式中，和分別為被檢QTL的效應(yīng)和基因型指示變量相當(dāng)于式(5.12)中的b和xi，其它符號(hào)的含義與式(5.11)相同。必須注意的是，模型(5.16)中不一定要包含全部的標(biāo)記。根據(jù)前面提到的性狀-標(biāo)記回歸的統(tǒng)計(jì)特性，理論上只需將可能與QTL相鄰因而擁有信息的標(biāo)記納入模型中就可以了，這樣可增加回歸分析的自由度，提高參數(shù)估值的準(zhǔn)確性。這些作為余因子的標(biāo)記可以通過用模型(5.11)進(jìn)行逐步回歸分析或其它方法獲得的先驗(yàn)知識(shí)來選擇。不難看出，模型(5.16)實(shí)際上是模型(5.11)和(5.12)混合而成的，所以復(fù)合區(qū)間定位的模型配合和顯

29、著性測(cè)驗(yàn)與區(qū)間定位是基本相似的，其似然比檢驗(yàn)為 (5.17)式中符號(hào)含義與(5.13)相似。圖5.6給出了一個(gè)應(yīng)用復(fù)合區(qū)間定位法定位QTL的例子?？梢钥闯觯c區(qū)間定位法相比，復(fù)合區(qū)間定位法大大提高了QTL定位的精確度，這是復(fù)合區(qū)間定位方法的突出優(yōu)點(diǎn)。然而，復(fù)合區(qū)間定位法對(duì)QTL定位精確度的提高是以降低靈敏度（統(tǒng)計(jì)功效）為代價(jià)的，這是因?yàn)榕c被檢標(biāo)記區(qū)間相鄰的作為余因子的標(biāo)記會(huì)部分吸收被檢區(qū)間中QTL的效應(yīng)。因此，與被檢區(qū)間靠得太近的標(biāo)記不宜作為余因子。為了解決這個(gè)問題，可以在被檢區(qū)間的兩側(cè)各開設(shè)一個(gè)“窗口”，只有在該窗口之外的標(biāo)記才能選作余因子。由于不同的被檢區(qū)間所要求的合適的窗口寬度可能是不同

30、的，因此在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)嘗試使用多種窗口寬度，以尋找各個(gè)被檢區(qū)間所適合的窗口寬度。圖5.6老鼠X染色體上體重QTL定位的一個(gè)例子. 區(qū)間定位的LOD曲線（虛線）表現(xiàn)為一個(gè)很寬的峰, 而復(fù)合區(qū)間定位的LOD曲線（實(shí)線）則顯示兩個(gè)單獨(dú)的峰. Bw1和Bw2表示兩個(gè)可能存在的QTL, 染色體上的黑點(diǎn)示標(biāo)記的位置（引自Lynch and Walsh 1998）由于復(fù)合區(qū)間定位的回歸模型的參數(shù)較多，其計(jì)算量比區(qū)間定位大大增加。為了簡(jiǎn)化復(fù)合區(qū)間定位的計(jì)算，可以采取與區(qū)間定位法相似的做法，令被檢QTL的基因型指示變量取其期望值，這樣就可以應(yīng)用最小二乘法來配合回歸模型（Wu et al. 1996b）?；谧?/p>

31、小二乘的復(fù)合區(qū)間定位的似然比統(tǒng)計(jì)量為： (5.18)其中m為余因子標(biāo)記的數(shù)量，其它符號(hào)含義與(5.15)相似。復(fù)合區(qū)間定位法最初是針對(duì)大樣本情況提出來的。但在實(shí)際研究中，所用的實(shí)驗(yàn)群體往往都不很大。在小樣本（特別是個(gè)體數(shù)少于標(biāo)記數(shù)）的情況下，復(fù)合區(qū)間定位所需的余因子的選擇會(huì)發(fā)生困難，為了保證足夠大的回歸自由度，選用的余因子不能太多，而余因子選擇的不同又會(huì)影響QTL定位的結(jié)果。因此，在小樣本情況下如何進(jìn)行復(fù)合區(qū)間定位是一個(gè)需要解決的問題。一種比較可行的策略是（Wu et al. 1999），考慮到各條染色體在遺傳上（因而在統(tǒng)計(jì)上）是相互獨(dú)立的，因而可以對(duì)每條染色體（而非整個(gè)基因組）分別進(jìn)行復(fù)合區(qū)

32、間定位。不過，在小樣本中，由于抽樣誤差，不同染色體之間還是可能存在相關(guān)性的。因此，在完成復(fù)合區(qū)間定位之后，最好再用逐步回歸分析的方法對(duì)所有檢測(cè)出的QTL進(jìn)行重新評(píng)估，以排除假陽性（Wu et al. 1999）。復(fù)合區(qū)間定位法可以推廣到多性狀分析的情形（Jiang and Zeng 1995），稱為多性狀復(fù)合區(qū)間定位法（multiple-trait composite interval mapping）。多性狀復(fù)合區(qū)間定位法利用了不同性狀間相關(guān)的遺傳信息，因而具有比（單性狀的）復(fù)合區(qū)間定位法更多的優(yōu)點(diǎn)：（1）可以提高QTL定位的靈敏度和精確度；（2）可以用來鑒別QTL的緊密連鎖和多效性；（3）

33、可以用來分析多年多點(diǎn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，檢測(cè)QTL與環(huán)境間的相互作用。為了提高計(jì)算速度，與（單性狀的）復(fù)合區(qū)間定位法的情況相似，多性狀復(fù)合區(qū)間定位模型也可以用最小二乘法來配合（Wu et al. 1999）。新近還提出了基于混合線性模型（即同時(shí)包含固定效應(yīng)和隨機(jī)效應(yīng)的線性模型）的復(fù)合區(qū)間定位方法（mixed-model-based composite interval mapping；Zhu and Weir 1998）。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是減少了回歸自由度對(duì)復(fù)合區(qū)間定位的限制，能夠用來估計(jì)QTL的上位性效應(yīng)（即不同等位基因間的互作效應(yīng)）和QTL與環(huán)境的互作效應(yīng)，從而拓展了復(fù)合區(qū)間定位法的應(yīng)用范圍。不過，這

34、種方法在檢測(cè)QTL上位性效應(yīng)時(shí)，必須在基因組上進(jìn)行二維搜索，因而計(jì)算上比較復(fù)雜。六、基于性狀-標(biāo)記回歸的區(qū)間定位前面已提到，在性狀-標(biāo)記回歸中，每個(gè)QTL的效應(yīng)只被其兩側(cè)相鄰標(biāo)記所吸收。Whittaker等（1996）證明，在只有加性效應(yīng)的情況下，性狀-標(biāo)記回歸與基于最小二乘的復(fù)合區(qū)間定位法具有等價(jià)性，當(dāng)兩個(gè)相鄰標(biāo)記的回歸系數(shù)同號(hào)（即同為正或負(fù)）時(shí)，能夠計(jì)算出位于它們之間的QTL的位置和效應(yīng)。以DH群體為例，從模型(5.11)出發(fā)，當(dāng)某個(gè)標(biāo)記區(qū)間（k, k+1）中存在一個(gè)QTL時(shí)，則區(qū)間兩端標(biāo)記的偏回歸系數(shù)（bk和bk+1）將同號(hào)，并且有 (5.19) (5.20)式中，rk為第k（即區(qū)間左端

35、）標(biāo)記與QTL間的重組率，r為兩標(biāo)記間的重組率，a為QTL的加性效應(yīng)?？梢?，從相鄰標(biāo)記的偏回歸系數(shù)就足以求出標(biāo)記區(qū)間內(nèi)QTL的位置和效應(yīng)。但是，僅根據(jù)標(biāo)記的偏回歸系數(shù)還不足以確定某個(gè)標(biāo)記區(qū)間中是否存在QTL。為此，我們可以采取與復(fù)合區(qū)間定位法相似的方法，用似然比統(tǒng)計(jì)量來檢驗(yàn)?zāi)硞€(gè)標(biāo)記區(qū)間中QTL是否存在（吳為人等2000），其似然比統(tǒng)計(jì)量為：(5.21)式中符號(hào)含義與(5.18)相似。利用式(5.21)可以計(jì)算出每個(gè)標(biāo)記區(qū)間的似然比值，從而可以非常直觀地判斷出哪個(gè)區(qū)間內(nèi)可能存在QTL。研究表明，這種性狀-標(biāo)記回歸區(qū)間定位法的QTL定位結(jié)果與基于最小二乘的復(fù)合區(qū)間定位法完全相同，但它無需進(jìn)行全基因

36、組逐點(diǎn)掃描，因而其計(jì)算速度極快。因此，在只有加性效應(yīng)的情況下，完全可以用性狀-標(biāo)記回歸區(qū)間定位法來代替復(fù)合區(qū)間定位，以節(jié)約大量的計(jì)算時(shí)間。七、QTL定位的計(jì)算機(jī)軟件從上面的介紹可以看出，QTL定位涉及到相當(dāng)復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)計(jì)算，并需要處理大量的數(shù)據(jù)，這些工作都必須靠計(jì)算機(jī)來完成。因此，為了便于從事實(shí)際QTL定位研究的遺傳育種學(xué)家分析他們的試驗(yàn)結(jié)果，將各種QTL定位方法編制成通用的計(jì)算機(jī)軟件是十分必要的。第一個(gè)推廣發(fā)行的QTL分析通用軟件是Mapmaker/QTL，它是針對(duì)區(qū)間定位法而設(shè)計(jì)的。該軟件的發(fā)行，大大促進(jìn)了區(qū)間定位方法的實(shí)際應(yīng)用。此后，陸續(xù)開發(fā)出了許多QTL分析軟件，如QTL Cartogr

37、apher、PLABQTL、Map Manager、QGene、MapQTL等。許多QTL分析軟件都可以從因特網(wǎng)上查尋到并免費(fèi)下載。通過由美國(guó)Wisconsin-Madison大學(xué)建立的一個(gè)WWW連接網(wǎng)站（）可以很方便地連接到許多QTL定位分析軟件包。但到目前為止，還沒有推出一套中文版的QTL分析軟件。為了促進(jìn)我國(guó)的作物QTL定位研究的發(fā)展，“九五”期間，863計(jì)劃作物分子標(biāo)記輔助育種專題項(xiàng)目開展了中文版的QTL分析通用軟件編制工作。該軟件稱為“QTL工具箱”（QTL KIT），目前已完成第一版，可以提供給我國(guó)廣大從事QTL定位工作的研究人員試用，并還將不斷補(bǔ)充和完善。八、QTL定位的可靠性隨

38、著QTL定位研究在各種作物中的廣泛開展，人們對(duì)QTL定位的可靠性越來越關(guān)注。根據(jù)已有的研究報(bào)道看，盡管不同研究者所使用的實(shí)驗(yàn)材料和群體不同，但對(duì)同一性狀的研究結(jié)果還是有相符之處的，特別是一些效應(yīng)較大的QTL，確實(shí)能在不同的實(shí)驗(yàn)群體中被檢測(cè)出來，而且定出的位置也比較相近。這說明QTL定位具有一定的可靠性。吳為人課題組對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病抗性QTL的研究結(jié)果為QTL定位的可靠性提供了有力的證據(jù)。該研究用同一個(gè)高感品種 ´ 高抗品種雜交組合（H359 ´ Acc8558），建立了RI和F2兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)群體，并利用RI群體構(gòu)建該組合的分子標(biāo)記（RFLP和AFLP）連鎖圖譜。對(duì)RI群

39、體進(jìn)行了連續(xù)兩年的抗性鑒定試驗(yàn)，對(duì)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用復(fù)合區(qū)間定位方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)在兩年試驗(yàn)中都表現(xiàn)出較大效應(yīng)的QTL。對(duì)F2群體則采用BSA法進(jìn)行分析，共檢測(cè)到3個(gè)QTL。有趣的是，這3個(gè)QTL正好包含在從RI群體中發(fā)現(xiàn)的那5個(gè)效應(yīng)較大的QTL中。該研究針對(duì)同一個(gè)雜交組合，采用不同的群體（一個(gè)為永久性群體RI；另一個(gè)為暫時(shí)性群體F2）和不同的分析方法（一種為統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，即復(fù)合區(qū)間定位法；另一種為生物學(xué)方法，即BSA法），定位出相同的QTL。這有力地證明了QTL的真實(shí)存在性，同時(shí)也說明，至少對(duì)效應(yīng)較大的QTL來說，定位的結(jié)果一般是可靠的。許多計(jì)算機(jī)模擬研究也都表明，只要QTL能被檢測(cè)出（即達(dá)到

40、統(tǒng)計(jì)顯著水平），則對(duì)它的位置估計(jì)一般都是比較可靠的，定位結(jié)果一般能夠用于標(biāo)記輔助育種（何小紅等 2000）。當(dāng)然，由于受實(shí)驗(yàn)群體的限制，QTL初級(jí)定位的精確度是有限的，存在較大的置信區(qū)間。若要更準(zhǔn)確地定位QTL，則必須進(jìn)行精細(xì)定位（參見下一節(jié)）。九、提高QTL定位靈敏度和精確度的方法一個(gè)QTL的存在是通過它的表型效應(yīng)體現(xiàn)出來的。因此，一個(gè)QTL的效應(yīng)就象它發(fā)出的一種“信號(hào)”，通過接收該信號(hào)就能獲知它的存在。然而，一個(gè)QTL的效應(yīng)并不是孤立存在的，而是混雜在遺傳背景（其它QTL）和環(huán)境的效應(yīng)之中。遺傳背景和環(huán)境的效應(yīng)就象“噪音”，干擾了信號(hào)（目標(biāo)QTL效應(yīng)）的檢測(cè)。要提高QTL定位的靈敏度和精確

41、度，就必須增強(qiáng)信號(hào)，減小噪音。選擇性基因型測(cè)定（selective genotyping）是增強(qiáng)信號(hào)（擴(kuò)大QTL效應(yīng)）的一種方法（Darvasi and Soller 1992）。其思想是，在一個(gè)群體中，選擇高、低兩種極端表型的個(gè)體構(gòu)成一個(gè)子群體，僅對(duì)該子群體測(cè)定個(gè)體的分子標(biāo)記基因型，用于QTL定位分析，以減少分子標(biāo)記分析的費(fèi)用。雖然極端表型子群體的個(gè)體數(shù)遠(yuǎn)少于原群體，但其QTL定位靈敏度和精確度卻可以不亞于原群體，因?yàn)樵谧尤后w中，QTL的效應(yīng)通常被擴(kuò)大。以DH群體為例，從圖5.7可以看出，在原群體中，某QTL的效應(yīng)（兩種基因型間的差值）為mQQ - mqq；而在極端表型子群體中，該QTL的效

42、應(yīng)變成，明顯增大。圖5.7選擇性基因型測(cè)定增大QTL效應(yīng)的原理. 實(shí)曲線示DH群體中某性狀的頻率分布, 兩虛曲線分別示某QTL兩種基因型QQ和qq的性狀頻率分布, 兩端豎線分別表示選擇高低極端表型個(gè)體的界限, 和分別為原群體中基因型QQ和qq的均值, 和分別為中選個(gè)體中基因型QQ和qq的均值（用黑色倒三角形指示）如前所述，QTL定位分析中的噪音有兩個(gè)來源，一個(gè)是遺傳背景，一個(gè)是環(huán)境。環(huán)境噪音（誤差）是隨機(jī)的，一般可以通過適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)設(shè)計(jì)（如設(shè)置重復(fù)）來加以控制?？刂七z傳背景噪音的方法有兩種，一種是實(shí)驗(yàn)方法，從試驗(yàn)材料進(jìn)行控制（參見下一節(jié)）；另一種是數(shù)學(xué)方法，從統(tǒng)計(jì)上進(jìn)行控制。例如，復(fù)合區(qū)間定位法

43、就是利用被檢區(qū)間以外的標(biāo)記來消除其它QTL（遺傳背景）對(duì)被檢區(qū)間（QTL）的影響的?；谶@一原理，Wu等（1998）提出了消除遺傳背景噪音的一般方法。其思想是：先利用式(5.11)進(jìn)行性狀-標(biāo)記回歸分析（可以是一般的多元回歸分析，模型包括所有的標(biāo)記；也可以是逐步回歸分析，模型最后只包括回歸顯著的標(biāo)記），然后對(duì)每條（如第s條）染色體計(jì)算只包含其凈效應(yīng)的表型值： (5.22)式中，表示對(duì)位于第s染色體之外的全部或部分標(biāo)記求和。可以看出，式(5.22)就象一個(gè)過濾器，它將其它染色體上的QTL（遺傳背景）的效應(yīng)濾去。這樣，對(duì)每條染色體上的QTL就可以用只包含該染色體凈效應(yīng)的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行定位分析，從而消

44、除了遺傳背景噪音的干擾。這種方法可以與已有的所有QTL定位方法配合使用。 這種針對(duì)某條染色體濾除遺傳背景噪音的統(tǒng)計(jì)思想還可以延伸到只針對(duì)某個(gè)標(biāo)記區(qū)間的情況（吳為人等 2000）。這時(shí)式(5.22)仍然適用，只是其中s表示的是標(biāo)記區(qū)間（而非染色體）的序號(hào)，因而yi(s)是只包含第s區(qū)間凈效應(yīng)的表型值。用這種凈表型值對(duì)被檢區(qū)間進(jìn)行QTL定位，可以顯著提高統(tǒng)計(jì)功效（靈敏度）。第二節(jié) 數(shù)量性狀基因的精細(xì)定位理論研究表明，影響QTL初級(jí)定位靈敏度和精確度的最重要因素還是群體的大小。但是，在實(shí)際研究中，限于費(fèi)用和工作量，所用的初級(jí)群體不可能很大。而即使沒有費(fèi)用和工作量的問題，一個(gè)很大的群體也會(huì)給田間試驗(yàn)的

45、具體操作和誤差控制帶來極大的困難。所以，使用很大的初級(jí)群體是不切合實(shí)際的。由于群體大小的限制，因此無論怎樣改進(jìn)統(tǒng)計(jì)分析方法，也無法使初級(jí)定位的分辨率或精度達(dá)到很高，估計(jì)出的QTL位置的置信區(qū)間一般都在10 cM以上（Alpert and Tanksley 1996），不能確定檢測(cè)到的一個(gè)QTL中到底是只包含一個(gè)效應(yīng)較大的基因還是包含數(shù)個(gè)效應(yīng)較小的基因（Yano and Sasaki 1997）。也就是說，初級(jí)定位的精度還不足以將數(shù)量性狀確切地分解成一個(gè)個(gè)孟德爾因子。因此，為了更精確地了解數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)，在初級(jí)定位的基礎(chǔ)上，還必須對(duì)QTL進(jìn)行高分辨率（亞厘摩水平）的精細(xì)定位，亦即在目標(biāo)QTL

46、區(qū)域上建立高分辨率的分子標(biāo)記圖譜，并分析目標(biāo)QTL與這些標(biāo)記間的連鎖關(guān)系。一、單個(gè)QTL的精細(xì)定位為了精細(xì)定位某個(gè)QTL，必須使用含有該目標(biāo)QTL的染色體片段代換系或近等基因系（簡(jiǎn)稱為目標(biāo)代換系）與受體親本進(jìn)行雜交，建立次級(jí)實(shí)驗(yàn)群體。一個(gè)理想的染色體片段代換系應(yīng)該是，除了目標(biāo)QTL所在的染色體片段完整地來自供體親本之外，基因組的其余部分全部與受體親本相同（圖5.8）。這樣，在染色體片段代換系與受體親本雜交的后代中，僅在代換片段上存在基因分離，因而QTL定位分析只局限在很窄的染色體區(qū)域上，消除了遺傳背景變異的干擾，這就從遺傳和統(tǒng)計(jì)兩個(gè)方面保證了QTL定位的精確性。例如，日本水稻基因組研究計(jì)劃成功

47、地應(yīng)用染色體片段代換系對(duì)一個(gè)水稻抽穗期主效QTL進(jìn)行了精細(xì)定位，分辨率超過0.5 cM（Yamamoto et al. 1996）。圖5.8染色體片段代換系. 圖中僅畫出與受體親本有差異的染色體, 其余染色體的組成皆與受體親本相同精細(xì)定位目標(biāo)QTL的程序是：（1）將目標(biāo)代換系與受體親本雜交，建立僅在代換片段上發(fā)生基因分離的F2群體（次級(jí)群體）；（2）調(diào)查F2群體中各單株的目標(biāo)（被研）性狀值（表現(xiàn)型）；（3）篩選目標(biāo)代換系與受體親本間（在代換片段上）的分子標(biāo)記；（4）用篩選出的分子標(biāo)記測(cè)定F2各單株的標(biāo)記型（marker-type，即分子標(biāo)記的基因型）；（5）聯(lián)合表現(xiàn)型數(shù)據(jù)和標(biāo)記型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，估計(jì)出目標(biāo)QTL與標(biāo)記間的連鎖距離。在初級(jí)定位中所用的QTL定位方法均可用于精細(xì)定位中的數(shù)據(jù)分析。由于精細(xì)定位的精度達(dá)到亞厘摩水平（< 1 cM），因此，為了檢測(cè)到重組基因型，F(xiàn)2群體必須非常大（通常 > 1000）。染色體片段代換系一般通過多代回交來建立。在回交過程中，為了對(duì)目標(biāo)QTL所在的染色體區(qū)段進(jìn)行選擇，先必須對(duì)該QTL進(jìn)行初級(jí)定位，然后通過連鎖標(biāo)記進(jìn)行跟蹤選擇，亦即進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇（詳見第六章）。很顯然，標(biāo)記輔助選擇的可靠性依賴于QTL初級(jí)定位的準(zhǔn)確性。因此，這種建立目標(biāo)染色體片段代換系的方法一般只適用于一些效應(yīng)大的QTL，因?yàn)橹挥行?yīng)較