實(shí)驗(yàn)三 血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

1、實(shí)驗(yàn)三 血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳分析技術(shù)是目前臨床常規(guī)測(cè)定中應(yīng)用最廣的方法，具有微量、快速、簡(jiǎn)便、吸附作用和電滲作用小、分離區(qū)帶清晰、靈敏度及分辨率高等特點(diǎn)。醋酸纖維素薄膜還可進(jìn)行透明化處理，便于照相和掃描計(jì)算結(jié)果。廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、脂蛋白、結(jié)合球蛋白、同工酶的分離和測(cè)定。【目的】1.掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理、操作方法。2.了解電泳法分離蛋白質(zhì)的臨床意義。【原理】帶電粒子在電場(chǎng)中向與其電性相反的電極泳動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大多在pH4.07.3之間，在pH8.6的緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中都向正極移動(dòng)。由于血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)

2、不同，因此在同一pH環(huán)境中所帶負(fù)電荷多少不同，又由于其分子大小不同，所以在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度也不同。分子小而帶電荷多者，泳動(dòng)速度較快；反之，則泳動(dòng)速度較慢。因此通過電泳可將血清蛋白質(zhì)分為5條區(qū)帶，從正極端依次分為清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、-球蛋白和球蛋白等，經(jīng)染色可計(jì)算出各蛋白質(zhì)含量的百分?jǐn)?shù)?！酒鞑摹?醋酸纖維素薄膜（2cm×8cm）、培養(yǎng)皿、濾紙、無齒鑷、剪子、加樣器（可用蓋玻片或或微量加樣器）、直尺、鉛筆、玻璃板（8cm×12cm）、試管、試管架、吸管、電泳儀、電泳槽、分光光度計(jì)或吸光度掃描計(jì)?！驹噭?. 巴比妥緩沖液(pH8.6，0.07mol/L，離子強(qiáng)度0.06)

3、 稱取巴比妥鈉12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸餾水，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸餾水至1000毫升。2. 氨基黑10B染色液 稱取氨基黑10B 0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混勻，加蒸餾水至100ml。3. 漂洗液 甲醇45ml、冰醋酸5ml，混勻后加蒸餾水至100ml。 4. 洗脫液 0.4molLNaOH溶液。5. 透明液 稱取檸檬酸21g，N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸餾水溶解并稀釋至500ml。 【操作】1. 準(zhǔn)備 將緩沖液加入電泳槽的兩槽內(nèi)，并使兩側(cè)的液面等高。裁剪尺寸合適的濾紙條，疊成四層貼在電泳槽的兩側(cè)支架上，一端與支架前沿對(duì)齊，另一端侵入電泳槽

4、的緩沖液內(nèi)，使濾紙全部濕潤(rùn)，此即 “濾紙橋”（圖3-1）。將醋酸纖維素薄膜切成2cm×8cm大小，在無光澤面的一端約1.5cm處，用鉛筆輕劃一直線，作為點(diǎn)樣位置。然后將無光澤面向下，置于盛有巴比妥緩沖液的培養(yǎng)皿中浸泡，待充分浸透（約20分鐘）即無白色斑點(diǎn)后取出，用潔凈濾紙輕輕吸去表面的多余緩沖液。2. 點(diǎn)樣 取少量血清于玻璃板上，用加樣器取少量血清(約23l)，加在點(diǎn)樣線上，待血清滲入膜內(nèi)，移開加樣器。點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)注意血清要適量，應(yīng)形成均勻的直線，并避免弄破薄膜（圖3-2）。3. 平衡與電泳 將點(diǎn)樣后的薄膜有光面朝上，點(diǎn)樣的一端靠近負(fù)極，平直地貼于電泳槽支架的濾紙上，平衡約5分鐘。蓋上電

5、泳槽蓋，通電進(jìn)行電泳。調(diào)節(jié)電壓為100160伏，電流0.40.6mAcm寬，夏季通電45分鐘，冬季通電60分鐘，待電泳區(qū)帶展開2.53.5cm時(shí)斷電。4. 染色 用無齒鑷小心取出薄膜，浸于染色液中13分鐘（以清蛋白帶染透為止）。染色過程中應(yīng)輕輕晃動(dòng)染色皿，使薄膜與染色液充分接觸，薄膜量較多時(shí)，應(yīng)避免彼此緊貼而影響染色效果。5. 漂洗 準(zhǔn)備3個(gè)培養(yǎng)皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜，依次在漂洗液中連續(xù)浸洗數(shù)次，直至背景無色為止。將漂凈的薄膜用濾紙吸干，從正極端起依次為清蛋白（A）、1、2、及-球蛋白（圖3-3）。 6.定量 (1)洗脫法：取6支試管，編號(hào)，分別為A、1、2、和空白管。于清蛋白管加

6、入0.4mol/LNaOH溶液4ml,其余5管加2ml。剪下各條蛋白區(qū)帶，另于空白部分剪一條與各蛋白區(qū)帶寬度近似的薄膜作為空白，分別浸入各管中，振搖數(shù)次，置37水浴20分鐘，使色澤完全浸出。用620nm波長(zhǎng)以空白管調(diào)零比色，讀取各管吸光度，按下式計(jì)算：T = A×2 + 1 + 2 + + 清蛋白% 清蛋白管吸光度×2/T×1001-球蛋白% 1-球蛋白管吸光度/T×1002-球蛋白% 2-球蛋白管吸光度/T×100 -球蛋白% -球蛋白管吸光度/T×100-球蛋白% -清蛋白管吸光度/T×100 (2)掃描法：待染色的醋酸

7、纖維素薄膜完全干燥，置透明液中約3分鐘，取出貼于玻片上，薄膜完全透明。將已透明的薄膜放入全自動(dòng)光密度計(jì)中，對(duì)蛋白區(qū)帶進(jìn)行掃描，自動(dòng)繪出電泳圖，并直接打印出各區(qū)帶的百分含量?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 標(biāo)本不能溶血，否則，球蛋白濃度偏高。2每次電泳時(shí)應(yīng)交換電極，以使兩側(cè)電泳槽內(nèi)緩沖液的正負(fù)離子相互交換，使緩沖液的pH維持在一定水平。 3電泳槽緩沖液的液面要保持一定高度，過低可能出現(xiàn)了球蛋白的電滲現(xiàn)象(向陰極移動(dòng))。同時(shí)，電泳槽兩側(cè)的液面應(yīng)保持在同一水平面，否則，通過薄膜時(shí)有虹吸現(xiàn)象，將會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的泳動(dòng)速度。4電泳時(shí)電泳槽要密閉，以保持濕度，否則，薄膜水分蒸發(fā)干燥，使電流下降，分離不佳。5電泳失敗或圖

8、譜不理想的常見原因。(1)電泳圖譜不整齊：點(diǎn)樣不均勻；薄膜未完全浸透或溫度過高致使膜面局部干燥或水分補(bǔ)給不足；緩沖液變質(zhì)；電泳時(shí)薄膜放置不正，與電流方向不平行。(2)各蛋白區(qū)帶分離不清晰：點(diǎn)樣過多；電流過低，多由薄膜過于致密、吸水性差、導(dǎo)電能力差引起；膜面干燥；薄膜過薄。 (3)清蛋白中間著色淺：染色時(shí)間不夠或染色液陳舊；清蛋白含量過高，可減少血清用量或延長(zhǎng)染色時(shí)間。 (4)電泳速度慢：電流過低；供給薄膜的緩沖液不足，連接薄膜與緩沖液的濾紙或紗布過薄(一般需4層)；溫度過低，冬季電泳速度較夏季慢；薄膜結(jié)構(gòu)過于致密，導(dǎo)電性差；緩沖液中水分蒸發(fā)，致使離子強(qiáng)度增大。6樣品要求點(diǎn)在粗糙面(無光澤面)，

9、否則，樣品很難吸人膜內(nèi)。電泳時(shí)最好將點(diǎn)有樣品的一面朝下，以防電泳過程中水分蒸發(fā)，影響電泳結(jié)果。7染色時(shí)間以2分鐘為佳(室溫低時(shí)，時(shí)間可稍長(zhǎng))，若時(shí)間過長(zhǎng)，可使1球蛋白與染料結(jié)合率增加，導(dǎo)致1球蛋白百分比上升。【正常參考值】 清蛋白： 57.4571.73% 1-球蛋白： 1.764.48% 2-球蛋白： 4.048.28% -球蛋白： 6.7911.39% -球蛋白： 11.8522.97% A/G 1.242.36 【臨床意義】急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭時(shí)，清蛋白降低，1、2和-球蛋白升高；慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化時(shí)，清蛋白降低，、-球蛋白升高；急性炎癥時(shí)，1、2-球蛋白升高；慢性炎癥時(shí)，清蛋白降低，2、-球蛋白