不同濃度絲裂霉素C預(yù)防椎板切除術(shù)后硬膜外黏連的實(shí)驗(yàn)研究

1、不同濃度絲裂霉素C預(yù)防椎板切除術(shù)后硬膜外黏連的實(shí)驗(yàn)研究         【摘要】  目的比較局部應(yīng)用不同濃度絲裂霉素C（MMC）預(yù)防椎板切除術(shù)后硬膜外黏連的效果。方法40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，分別切除L1椎板。術(shù)中各組分別以棉片浸透生理鹽水（C組）、0.01 mgml（L組）、0.05 mgml（M組）、0.1 mgml（H組）MMC，置于裸露的硬脊膜后5 min。術(shù)后第4周處死動物取材，分別作肉眼觀察、羥脯氨酸（HOP）含量測定、膠原組織面積測定及成纖維細(xì)胞記數(shù)。結(jié)果C組標(biāo)本硬膜外瘢痕組織致密，與硬脊

2、膜形成緊密黏連。H組無明顯硬膜外黏連，HOP含量、膠原組織面積及成纖維細(xì)胞記數(shù)顯著減少。M、L組HOP含量、膠原組織面積及成纖維細(xì)胞記數(shù)不同程度的減少，但不能避免硬膜外黏連的形成。結(jié)論局部應(yīng)用濃度為0.1 mgml的MMC能夠有效減少硬膜外瘢痕組織增生，避免椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕黏連。 【關(guān)鍵詞】  椎板切除術(shù)； 硬膜； 黏連； 絲裂霉素C； 濃度椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕形成是引起腰椎手術(shù)失敗綜合征的重要原因之一。絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）作為一種具有抑制成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖作用的抗代謝藥物，其抑制瘢痕形成的作用已經(jīng)在臨床實(shí)踐中得到成熟運(yùn)用。本研究采用定性和定量的方法探

3、討局部應(yīng)用不同濃度的MMC預(yù)防椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕的形成的效果。1  材料與方法   1.1  動物分組健康成年雄性SD大鼠40只，體重200220 g。隨機(jī)分為4組，每組10只。各組動物椎板切除術(shù)后硬膜外局部應(yīng)用的MMC分別為：高濃度（H）組：MMC 0.1 mgml；中濃度（M）組：MMC 0.05 mgml；低濃度（L）組：MMC 0.01 mgml；對照（C）組：生理鹽水。1.2  制作動物模型大鼠以氯胺酮（100 mgkg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，取脊柱正中切口，顯露L1和L2椎板，切除L1椎板，暴露硬脊膜，壓迫止血。C組以浸透

4、生理鹽水棉片，H組、M組、L組以浸透不同濃度的MMC棉片置于裸露的硬脊膜后方5 min后取出，每只動物都以生理鹽水沖洗3次共20 ml，逐層縫合手術(shù)切口。1.3  觀察指標(biāo)及方法術(shù)后觀察實(shí)驗(yàn)動物手術(shù)切口愈合情況及肢體運(yùn)動情況，于手術(shù)4周后隨機(jī)處死每組各4只動物，肉眼觀察硬膜外黏連情況，切取手術(shù)段脊柱硬脊膜后部大小約為0.2 cm×0.1 cm×0.5cm組織，漂洗、稱重、勻漿，離心取上清，消化，加入HOP顯色劑，測定吸光度，推算出每毫克濕組織HOP的含量（g）。其余動物分別以氯胺酮（100 mgkg）腹腔注射麻醉后，以PBS和4%多聚甲醛依次作動脈灌注后切取手術(shù)段

5、脊柱包括其后側(cè)瘢痕組織及骶棘肌。經(jīng)6%硝酸脫鈣，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，分別作HE染色和Masson染色。在光鏡下主觀評估各組標(biāo)本硬膜外瘢痕黏連的程度，并觀察脊髓、神經(jīng)根、骶棘肌的組織結(jié)構(gòu)變化。Masson染色組織切片取同一放大率的組織圖像（×50倍），輸入計算機(jī)，經(jīng)處理，選取1 000 m×2 000 m范圍作為測量區(qū)域，避開背部筋膜組織，測出不規(guī)則形態(tài)的瘢痕橫切面面積。HE染色組織切片取同一放大率的組織圖像（×400倍），輸入計算機(jī)，選取100 m×100 m作為計數(shù)范圍，作成纖維細(xì)胞計數(shù)。每標(biāo)本計數(shù)3個不同區(qū)域，取其平均值。1.4  統(tǒng)

6、計學(xué)方法分析數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，各組定量測定結(jié)果采用單因素方差分析和組間兩兩比較，檢驗(yàn)的顯著性水平為P0.05。應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件完成統(tǒng)計運(yùn)算。   2  結(jié)果   2.1  大體觀察及硬膜外瘢痕組織中HOP含量測定所有動物切口愈合良好，活動敏捷，無步態(tài)異常。肉眼觀察H組硬膜與瘢痕組織分離后仍保持完整。C組硬膜與瘢痕無法鈍性分離。M組、L組硬膜與瘢痕部分緊密黏連無法完整鈍性分離。和C組比較，H組HOP含量明顯降低，具有顯著性差異（P0.05）；M組、L組HOP含量也顯示了降低趨勢，但

7、三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。表1  硬膜外瘢痕組織中HOP的含量（略）*與對照組比較有顯著性差異P0.052.2  光鏡觀察及計算機(jī)圖像分析C組硬膜外膠原組織大量增生，形成致密瘢痕，與背部筋膜、肌間隔連成一體。硬膜外大量致密的膠原纖維與硬膜平行排列，成纖維細(xì)胞與纖維細(xì)胞混雜，數(shù)量較多，瘢痕組織與硬膜黏連緊密，難以區(qū)分（圖1）。H組硬膜外膠原組織增生明顯減少，瘢痕組織結(jié)構(gòu)疏松。硬膜外膠原纖維亦與硬膜平行排列，成纖維細(xì)胞數(shù)量少，瘢痕組織與硬膜之間可見明顯間隙或形成纖維素樣黏連。部分組織切片中可見硬膜與瘢痕組織完全脫離（圖2）。M、L組硬膜外膠原組織增生較多，膠原纖維排列緊密。

8、瘢痕組織與硬膜形成不連續(xù)的黏連，部分區(qū)域黏連緊密，部分區(qū)域黏連疏松（圖3、4）。各組脊髓、神經(jīng)根、肌肉的組織學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)明顯異常。         計算機(jī)圖像分析顯示，H組橫切面膠原組織明顯低于C組，兩者差異具有顯著性（P0.05）；M組、L組膠原組織面積低于C組，但三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組成纖維細(xì)胞記數(shù)隨MMC濃度增加呈遞減趨勢。H、M組明顯低于C組，差異具有顯著性（P0.05），L組雖低于C組，但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。 表2  橫切面膠原組織面積測定、成纖維細(xì)胞計數(shù)（略）*與對照組比較有顯著

9、性差異P0.053  討論   硬膜外瘢痕黏連的實(shí)質(zhì)是纖維結(jié)締組織增生來修復(fù)椎板切除造成的局部缺損。目前較為常用的預(yù)防措施是以各種半流體物質(zhì)或者膜性材料作為硬膜與瘢痕之間的物理屏障1、2。但效果并不令人滿意，而且，作為異物植入的一些副作用以及操作過程的繁瑣使之不能作為理想的方法。抑制作為修復(fù)細(xì)胞主要成分的成纖維細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)膠原代謝成為當(dāng)前生物學(xué)防治病理性瘢痕的熱點(diǎn)。Ribeiro等3通過局部應(yīng)用MMC有效地抑制了大鼠背部傷口愈合過程中瘢痕組織的形成。體外細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)MMC是成纖維細(xì)胞增殖的有效抑制劑，MMC抑制成纖維細(xì)胞的增殖并未依賴其細(xì)胞毒作用，而是抑制了成

10、纖維細(xì)胞向增殖表型的轉(zhuǎn)化，使局部的成纖維細(xì)胞數(shù)目，特別是具有增殖活力的成纖維細(xì)胞的數(shù)目相對減少4。青光眼濾過手術(shù)中應(yīng)用一定濃度的MMC能有效抑制成纖維細(xì)胞的增殖，減少膠原的沉積。MMC在低氧環(huán)境下活性增加，所以在傷口血管形成之前用，即術(shù)中能有效阻止纖維化。這些資料還表明MMC在組織內(nèi)濃度很低但其抑制作用能長期保持5、6。由于硬脊膜與角膜都起源于中外胚層，在組織學(xué)上具有同源性。本實(shí)驗(yàn)采用與青光眼濾過手術(shù)相似的方法在椎板切除術(shù)中應(yīng)用不同濃度的MMC溶液作用于硬膜后和神經(jīng)根周圍，觀察其抑制成纖維細(xì)胞增殖，減少瘢痕組織形成的效果。大體和組織形態(tài)學(xué)觀察顯示術(shù)中經(jīng)過0.1 mgml MMC處理，大鼠術(shù)后硬

11、膜外瘢痕組織形成減少，結(jié)構(gòu)疏松，硬脊膜與瘢痕組織不形成緊密黏連，能完整分離。說明MMC預(yù)防硬膜外瘢痕黏連具有可行性。膠原蛋白是構(gòu)成瘢痕組織中膠原纖維的主要成分，HOP為其主要成分之一。膠原以外的蛋白質(zhì)，除彈性蛋白含少量HOP外，均不含HOP，因此瘢痕組織中的HOP含量可作為膠原組織含量的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H組大鼠硬膜外瘢痕組織中膠原組織的形成受到了MMC的有效抑制。  圖1C組硬膜外膠原組織大量增生，硬膜（D）與瘢痕組織黏連緊密。成纖維細(xì)胞數(shù)量較多（Masson染色  ×400）（略） 圖2H組硬膜外膠原組織少，瘢痕組織結(jié)構(gòu)疏松，成纖維細(xì)胞數(shù)量較少

12、，瘢痕組織與硬膜之間可見明顯間隙（Masson染色  ×400）（略）  圖3M組硬膜外瘢痕組織結(jié)構(gòu)較C組疏松，硬脊膜與瘢痕組織之間形成不完全黏連（Masson染色  ×400） （略）圖4L組硬膜外瘢痕組織結(jié)構(gòu)較為致密，硬脊膜與瘢痕組織之間黏連較為緊密（Masson染色  ×400）（略）應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)事先設(shè)定瘢痕組織的面積的測定和成纖維細(xì)胞記數(shù)的部位和范圍，減少了主觀因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明MMC與其抑制成纖維細(xì)胞增殖、硬膜外瘢痕組織形成的作用具有濃度-效應(yīng)關(guān)系。0.1 mgml的MMC能夠有效預(yù)防椎板切除術(shù)后硬

13、膜外瘢痕黏連。MMC作為一種抗腫瘤藥物，他的副作用是藥物在其作用部位發(fā)揮藥理作用的結(jié)果。由于對細(xì)胞增殖的非特異性抑制作用，MMC必然影響與之接觸的其他代謝旺盛組織，其影響程度與藥物劑量密切相關(guān)6，因此藥物的濃度和維持時間是影響并發(fā)癥的重要因素，采用較低的有效濃度和較短的作用時間并將二者有機(jī)的統(tǒng)一可有效地減少并發(fā)癥。由于手術(shù)中僅有切口深部的部分創(chuàng)面以及裸露的硬脊膜接觸過MMC，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組動物的運(yùn)動功能和切口愈合未受影響。經(jīng)MMC處理的大鼠硬膜、神經(jīng)根、肌肉組織，由于其接觸的藥物濃度低、接觸時間短，實(shí)驗(yàn)中觀察其組織學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常。Ilbay以0.5 mgml MMC作用于大鼠坐骨神經(jīng)5 m

14、in并未對神經(jīng)組織造成嚴(yán)重?fù)p傷7。本方法的安全性值得信賴。  【參考文獻(xiàn)】  1 張興林.異體硬脊膜與透明質(zhì)酸鈉聯(lián)合應(yīng)用預(yù)防椎板切除術(shù)后硬脊膜黏連J.中國矯形外科雜志，2000，7（11）：1101.2 聞久全，蔣閱，陳江華，等.應(yīng)用人工硬脊膜預(yù)防瘢痕黏連早期臨床觀察J.中國矯形外科雜志,2003，11（12）：821822.3 Ribeiro FDQ，Guaraldo L，Borges JD，et al.Clinical and histological healing of surgical wounds treated with mitomycin CJ.Laryngoscope,2004，114（1）：148152.4 胡丹，惠延年，Philip P,et al.絲裂霉素C抑制人結(jié)膜囊成纖維細(xì)胞生長及增殖J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001，22（13）：12301232.5 Cincik H，Gungor A，Cekin E，et al.Effects of topical application of mitomycin C and 5fluorouracil on myringotomy in ratsJ.Otology & Neurotology,200