-7人禽流感實驗室檢測技術方案

1、附7禽流感實驗室檢測技術方案 一、實驗室網(wǎng)絡設置實驗室網(wǎng)絡由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所國家流感中心和省級流感實驗室兩級組成。二、實驗室條件及生物安全操作的要求1省級流感實驗室實驗條件及生物安全的操作要求1實驗生物安全要求：安全級+BSL-2級+或安全級BSL-3級。2特異性H5 的 RT-PCR病毒核酸檢測、血清學檢測中用到的血凝抑制實驗HI可以在安全級+BSL-2級+實驗室里操作。3特異性H5 的 RT-PCR病毒核酸檢測在安全級+BSL-2級+實驗室的生物安全柜里提取病毒的核酸，進行病毒核酸檢測的實驗室要求請參照國家有關核酸檢測要求的規(guī)定。4微量中和實驗、特異性H5 的 RT-P

2、CR病毒核酸檢測陽性的采樣標本的病毒別離、尸檢標本的檢測必須在安全級BSL-3級實驗室里操作。5省級流感實驗室實驗條件：具備進行禽流感相關臨床標本初篩所需的生物安全柜、離心機、PCR儀、電泳儀、紫外線檢測儀等配套設備。2國家流感中心實驗生物安全要求：生物安全級+BSL-2級+和生物安全級BSL-3級實驗室。3省級流感實驗室職責1禽流感標本特異性H5 的 RT-PCR病毒核酸檢測；2禽流感H5的血清學檢測工作; 3特異性H5 的 RT-PCR病毒核酸檢測陽性標本的病毒別離必須在生物安全級BSL-3級實驗室；4沒有生物安全級BSL-3級實驗室的，將標本送國家流感中心做病毒的別離工作。4國家流感中心

3、實驗室職責1國家流感中心設立在中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所流感室；2對各省報告的禽流感疑似病例或確診病例進行復核、確認；3對不具備禽流感病毒別離條件的省份送檢標本的檢測、別離和確認；4對需要做微量中和實驗的血清標本進行微量中和試驗；5對各省級實驗室檢測人員的培訓；6對各省級流感實驗室的質量控制。三、原始標本采集1標本采集人員醫(yī)療機構的醫(yī)生、護士或當?shù)丶膊☆A防控制中心專業(yè)人員負責標本采集并填寫標本登記表，標本采集人員按照禽流感職業(yè)暴露人員防護指導原則做好個人防護。2標本采集種類和時限1采集標本的種類：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。（2） 采

4、集標本時間：1咽、鼻拭子或含漱液在發(fā)病的頭3天采集；2急性期血清在發(fā)病后7天內(nèi)采集，恢復期血清在發(fā)病后2-4周采集；3尸檢標本尸檢時采集。3標本的運送：所有采集的標本應在醫(yī)院采集時立即分裝，一式二份，其中一份單獨保存，以備復核。采集的標本假設不能在24小時內(nèi)送達，則應盡快在70 以下保存。無70 條件的需在20 冰箱短時間暫存，并盡快聯(lián)系遞送標本。4標本采集的方法：詳見國標流行性感冒診斷標準及處理原則四、送流感中心的標本包裝、運送與接收1標本的包裝1標本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有橡膠圈的塑料管里，擰緊。2將密閉后的標本放入大小適合的塑料袋內(nèi)密封；每袋裝一份標本。3直接在塑料管上用油性記號筆

5、寫明樣本的種類、采樣時間、編號、，同時也將標本有關信息填在禽流感人體標本送檢登記表，連同塑料管用另一塑料袋密封。4將裝標本的密封袋放入專用運輸箱內(nèi)或疫苗冷藏包，放入冰排，然后以柔軟物質填充，內(nèi)襯具吸水和緩沖能力的材料。同一患者2份以上的密封標本，可以放在同一個塑料袋內(nèi)再次做密封。假設將進行病毒別離，可將密封好的裝有標本的容器直接放入液氮運輸罐內(nèi)運輸。所有容器必須印有生物危險標識。2標本運送1航空或鐵路運送。2專人專車運送：主要用于近距離樣品運送。3標本的接收1各省級中心實驗室應公布標本接收聯(lián)系方式，并實行24小時標本接收制；2國家實驗室標本接收：需送國家流感中心實驗室檢測的原始標本、病毒別離物

6、、可疑陽性標本、血清等，填寫標本送檢登記表，在低溫保存條件下，于24小時內(nèi)送至中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所流感中心進行復核。國家流感中心標本接收聯(lián)系方式為：中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，地址：北京市宣武區(qū)迎新街100號，聯(lián)系人：郭元吉、王敏，聯(lián)系 010-63581337， ：01063534632。五、標本檢測方法1禽H5病毒核酸檢測： 材料：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物等。方法： RT-PCR，用于禽H5亞型流感病毒的快速檢測、測序及排除工作試劑：特異性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA 提取試劑盒、逆轉

7、錄酶、Taq DNA聚合酶等試劑, 建議使用德國QIAGEN的Rneasy Mini Kit (病毒核酸提取 ) 和QIAquick Gel Extraction KitPCR產(chǎn)物純化產(chǎn)品。2病毒別離及鑒定：材料: 疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物等。方法：采用雞胚和MDCK細胞別離方法，血凝及血凝抑制試驗HAI具體方法詳見國標流行性感冒診斷標準及處理原則。經(jīng)特異性H5 RT-PCR病毒核酸檢測陽性標本的病毒別離及鑒定工作必須在安全級BSL-3級實驗室里操作。試劑：雞胚接種采用SPF雞胚，MDCK細胞等。3疑似病例的血清學檢測：材料：疑似病例的急性期和恢復期

8、的雙份血清方法：血凝抑制實驗具體方法詳見國標流行性感冒診斷標準及處理原則。試劑：H5滅活病毒。4微量中和試驗材料：疑似病例的急性期和恢復期的雙份血清試劑：H5活病毒，必須在生物安全級 (BSL-3級)實驗室里操作。六、檢測結果確實認以下情況的原始標本及別離物送國家流感中心檢測、復核、確認。1標本別離物血凝試驗HA陽性，同時H5血凝抑制試驗HI陰性，H5的RT-PCR檢測陽性。2標本別離物血凝試驗HA陽性，同時H5血凝抑制試驗HI陽性或H5的RT-PCR檢測陽性。3標本別離物血凝試驗HA陽性，同時H5的RT-PCR檢測陽性。4病人恢復期血清比急性期血清的H5抗體有4倍或以上增高。5標本別離物血凝

9、試驗HA陽性，H5血凝抑制試驗陰性，并已排除了是當前流行的甲、乙型毒株的可能。七、檢測結果報告一般情況下, 實驗室收到的樣本立即進行實驗，并于收到標本后24小時內(nèi)出具RT-PCR檢測報告，3-5天出具病毒別離培養(yǎng)結果，于別離到病毒后的3-5天出具流感病毒的血凝抑制結果，微量中和實驗須3-5天完成。當實驗過程中出現(xiàn)不可預測情況或意外事件，影響了按時出具報告時，應及時報告和說明。附件ICS GB中華人民共和國國家標準GB流行性感冒診斷標準及處理原則Diagnostic criteria and principles of management of influenza (報 批 稿)發(fā)布 實施國家

10、質量技術監(jiān)督局發(fā)布目次前言31 范圍42 診斷原則43 診斷標準44 處理原則5附錄A 標準附錄 病原學診斷方法5附錄B標準附錄 血清學診斷方法7附錄C資料附錄 紅細胞凝集抑制試驗8附錄D資料附錄神經(jīng)氨酸酶活性抑制試驗12附錄E資料附錄 對流免疫電泳及瓊脂凝膠沉淀試驗16附錄F資料附錄 流感快速診斷方法19GB前 言流行性感冒(簡稱流感)為一種人、禽、畜共患的病毒性急性傳染病。流感病毒根據(jù)其核蛋白NP和M1蛋白抗原性和基因特性的不同分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常以流行形式出現(xiàn)，能引起世界性流感大流行，它在動物中廣泛分布，并也能在動物中引起流感流行和造成大量動物死亡。乙型流感病毒能引起流感局

11、部爆發(fā)，不會造成世界性流感大流行，至今除在人以外還能在海豹中別離到它。丙型流感病毒主要以散在形式出現(xiàn)，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行，它也能感染豬。流感常突然發(fā)生，迅速蔓延，涉及面廣，發(fā)病率和死亡率均高但病死率低。至今仍嚴重威脅著人的身心健康，甚至奪走性命，常給國民經(jīng)濟帶來巨大損失，我國被世界公認為是流感的多發(fā)地。受衛(wèi)生部傳染病防治監(jiān)督管理辦公室委托，由郭元吉同志負責對流行性感冒診斷標準及處理原則GB15944-1995進行修改，其目的：把過時的，不適用的刪除，加入適用新的內(nèi)容。具體修改之處如下：1 前言中強調了流感為一種人、禽、畜共患病，同時考慮到禽流感病毒在人群中可引起的流感，其傳播途

12、徑不清楚，故把傳播途徑刪除。2 診斷原則中增加了或從患者采集的標本中查到病毒顆粒特異的蛋白或特異核酸成分。3 實驗室診斷中去掉白細胞計數(shù)指標，因該指標不能做為流感的試驗診斷依據(jù)。4 附錄A。病毒別離中，因甲型流感病毒“O”相特性的出現(xiàn)，故強調了細胞系統(tǒng)別離病毒的重要性；在HA測定中不應用雞紅細胞，而應用豚鼠或人的紅細胞。5 把B3神經(jīng)氨酸酶抑制試驗改為附錄D。把B3中不標準的一律改為當今國際上統(tǒng)一使用的方法。6 刪除B2已過時，操作復雜，易受實驗條件影響的“型特異性補體結合試驗，改為附錄E“對流免疫電泳”，同時考慮到對禽血清抗體測定時，常用瓊脂凝膠沉淀試驗。因此，在附錄E中也加入后者的內(nèi)容。7

13、 快速診斷為附錄C改為附錄F。同時加入FLU OIA Kit 和RT-PCR法。本標準的附錄A和B是標準的附錄。本標準的附錄C-F是資料的附錄。本標準由中華人民共和國衛(wèi)生部提出。本標準起草單位：中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所本標準主要修訂人：郭元吉本標準由衛(wèi)生部委托技術歸口單位衛(wèi)生部傳染病防治監(jiān)督管理辦公室負責解釋。中華人民共和國國家標準流行性感冒診斷標準及處理原則 GBDiagnostic criteria and principles of management of influenza1 范圍本標準規(guī)定了流感的診斷標準及處理原則。本標準適用于各級醫(yī)療、衛(wèi)生、保健機構和人員。對流感的

14、診斷，報告和處理的應用。2 診斷原則流感流行時一般可根據(jù)臨床癥狀，結合流行病學資料可對患者作出初步診斷。如確診則需要病毒別離陽性或病人雙份血清抗體測定，其恢復期抗體滴度較急性期增高4倍或以上，或從患者采集的標本中查到病毒粒特異的蛋白或特異核酸成分。3 診斷標準31流行病學資料在流行季節(jié)一個單位或地區(qū)同時出現(xiàn)大量上呼吸道感染病人；或近期內(nèi)本地區(qū)或鄰近地區(qū)上呼吸道感染病人明顯增多；或醫(yī)院門診呼吸道感染病人明顯增多；或挨家挨戶上呼吸道感染患者明顯增多。32臨床癥狀321 出現(xiàn)急起畏寒、高熱、頭痛、頭暈、渾身酸痛、乏力等中毒癥狀。322 可伴有咽痛、干咳、流鼻涕等癥狀。323 少數(shù)病例有食欲減退、伴有

15、腹痛，腹脹、嘔吐和腹瀉等消化道癥狀。 33實驗室診斷331 從病人鼻咽分泌物中可別離到流感病毒見附錄A。332 患者恢復期血清中抗流感病毒抗體滴度比急性期高4倍或以上見附錄B。333 在患者呼吸道上皮細胞查到流感病毒顆粒特異的蛋白成份或特異的核酸見附錄F。334 采集標本經(jīng)敏感細胞將病毒增殖一代后，查到流感病毒粒特異的蛋白或特異的核酸見附錄F。3 4病例分類341 疑似病例流感樣病例 具備腋下體溫38，加上其他臨床癥狀兩項或以上，或加3、1及胃腸道癥狀兩項或以上。342 確診病例疑似病例加3.3.1或3.3.2或3.3.3或3.3.4。4. 處理原則4.1 早期隔離病人,服抗流感病毒藥物,對癥

16、治療和防并發(fā)癥.早期發(fā)現(xiàn)病人,早期隔離(因地制宜,就地適當隔離)病人是重要的措施.對病人治療一般采用對癥療法,發(fā)病早期(48小時內(nèi))可服用抗流感病毒藥物,嚴重患者如嚴重肺炎,呼吸極度困難,高熱不退等需住院治療.防治并發(fā)癥主要應防止流感病毒性肺炎和細菌性肺炎,尤其對年邁體衰者或伴有心血管,糖尿病,慢性呼吸道疾病者或嬰幼兒等流感高危人群因他們由于流感本身或其它合并癥可造成死亡,故應特別注意加強治療護理. 4 2 預防措施一般采用綜合性措施，講究衛(wèi)生，注意體格鍛煉和營養(yǎng)，保持室內(nèi)空氣流通；對易感人群應采取相對隔離措施，如防止接觸病人，不去公共場所等；對年邁和健康狀態(tài)差，尤其帶有慢性病的人必要時可采用

17、滅活疫苗接種，對疫苗過敏者或可能已被感染如密切接觸病人者應及時服用抗流感病毒藥物。 附錄A標準附錄 病原學診斷方法A1 病毒別離從疑似流感病人呼吸道采集標本別離病原體A2 標本的采集病毒別離成功與否很大程度上取決于采集標本的質量，時間應于發(fā)病的頭3天，越早越好，及其保存運輸?shù)拳h(huán)節(jié)。標本主要取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次為氣管和支氣管分泌物，有時也采用肺活檢材料等。常用的采樣液為：普通肉湯，pH 7.4-7.6的Hanks氏液或Eagle氏液或水解乳蛋白液。在采樣液中需加入抗菌素，以往多用青、鏈霉素，近來發(fā)現(xiàn)不少種類細菌對它們具有耐藥性，故近來多用慶大霉素其終濃度為每ml采樣液中加入0.1 ml的

18、10mg/ ml和抗真菌素終濃度為每ml采樣液中加入0.008 ml的250ug/ ml。A21標本采集方法A 221 鼻拭子 將棉簽輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉動退出。以同一拭子拭兩側鼻孔。將棉簽浸入4-5 ml采樣液的管中，尾部棄去。然后，塞緊或蓋好管蓋。A222咽拭子 用棉簽擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，同樣將棉簽頭浸入4-5 ml采樣液的管中，尾部棄去，塞緊或蓋好管蓋。 注：亦可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高別離率，減少工作 量。A223鼻咽抽取物或抽取氣管和支氣管分泌物 用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取氣管和支氣管分泌物。先將收集器頭部插入鼻腔或氣管

19、，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器3次。近來國內(nèi)有用小孩導尿管接在50 ml注射器上來替代收集器。A224漱口液 用10 ml采樣液漱口。漱時讓患者頭部微后仰，發(fā)噢聲，讓洗液在咽部轉動。然后，用平皿或燒杯收集漱液。 注：取漱口液時，需預先了解患者是否對抗菌素有過敏史，如有，含漱液中不應含抗菌素。A225 肺活檢材料肺活檢組織在無菌條件下，用滅菌過的乳缽磨碎，用生理鹽水配成20%懸液，2000rpm離心10min，取上清加入上述提到的抗菌素。A3 標本運送標本應在4條件下，盡快送至實驗室。標本至實驗室后，病毒別離標本應盡快進行接種別離，48h內(nèi)能進行接種可

20、置4保存，如未能接種應置-70下保存。A4 標本處理 標本至實驗室后，含棉拭子的標本，先將棉拭子在管壁反復擠壓后取出。然后用干凈滅過菌的毛細吸管反復吹打收集的溶液，以便打碎粘液。置4待其自然沉淀5-10min。注：如采樣液中尚未加抗菌素應補加之，所加的量同前，加完并混勻，置4 1-2h后方可用于接種。A5 接種與培養(yǎng)最常用的為細胞接種和雞胚接種法，有條件的應兩法并用。近來由于“O”相毒株的出現(xiàn)，MDCKMadin Dardy Canine Kidney等一些細胞對“O”相毒株的敏感性大大超出雞胚的敏感性。同時“O”相毒株幾乎不凝集雞紅細胞，故近來在紅細胞凝集和凝集抑制試驗中常用豚鼠或人的“O”

21、型紅細胞，而不用雞的紅細胞。A51 MDCK細胞接種和收獲 成片的MDCK細胞棄生長液，用Hanks氏液洗兩遍，將殘余的牛血清洗凈，每瓶加入接種標本0.5-1.0 ml，接種量要根據(jù)瓶的大小，一般2瓶/標本，輕晃細胞瓶，使標本完全覆蓋細胞，置35吸附1-2h；倒掉感染液，再用Hanks氏液洗1-2遍，每瓶加入3 ml隨瓶的大小而異維持液不含小牛血清，而含終濃度為2ug/ml胰酶的Eagle氏溶液，置35培養(yǎng)；次日起每天觀察有無細胞病理變化CPE；當CPE出現(xiàn)+ +號時，即75%-100%細胞出現(xiàn)病變時進行收獲，收獲之前可將細胞凍融1-2次以提高收獲標本的病毒滴度。由于CPE不能證實就是流感病毒

22、所造成。最后還需檢查維持液中是否有紅細胞凝集活性HA，用毛細吸管取細胞維持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人紅細胞，輕搖混勻，置室溫或4，1h后觀察結果。出現(xiàn)紅細胞凝集的為陽性標本，收獲所有的維持液進行病毒鑒定。 如收獲的維持液HA滴度不高或量不夠用于鑒定，需在MDCK細胞中傳代，把HA滴度提高或量增加后，方可進行病毒鑒定。 如HA陰性，應在MDCK細胞上盲傳一代，如HA仍陰性，可認為是陰性標本，棄之。注： CPE出現(xiàn)時間隨感染病毒的型別，甚至毒株的差異以及感染量的大小而異。一般標本接種后7-10天還不出CPE，維持液中又查不出HA活性，基本上可認為陰性標本，棄之。同時要

23、注意MDCK細胞的代數(shù)，因隨MDCK細胞代數(shù)增加，其對流感病毒的敏感性下降。A52雞胚接種和收獲取9-11日胚齡雞胚，經(jīng)羊膜腔和尿囊腔接種標本0.2 ml，每份標本接種3-4只胚，置33-35培養(yǎng)72h。然后將雞胚置4過夜或置-20冰箱1h再置4數(shù)小時，分別收獲尿囊液和羊水并檢查HA活性用毛細吸管分別取3-4滴尿囊液和羊水，分別置大孔塑料板不同孔內(nèi)，再加入3-4滴1 %豚鼠或人紅細胞，搖勻后置室溫或4 1h后觀察結果。如HA為+ +時，再按系列倍比稀釋測定HA滴度，如具有一定的HA滴度即可進行病毒鑒定。如HA陰性，可盲傳一代，如HA仍為陰性則棄之。A6病毒鑒定至今對流感病毒鑒定最常用的方法為紅

24、細胞凝集抑制HI測定，因該法簡便易行，結果可信具體方法見附錄C。其次為神經(jīng)氨酸酶活性抑制NI測定具體方法見附錄D。進行型鑒定時常用對流免疫電泳具體方法見附錄E。附錄B標準附錄血清學診斷方法B1 血清標本采集血清標本應包括急性期和恢復期雙份血清。急性期血樣應盡早采集，一般不晚于發(fā)病后7天?；謴推谘獦觿t在發(fā)病后2-4周采集。單份血清一般不能用作診斷。血液標本2000-2500rpm離心15min。收集血清，棄血凝塊。B2 血清標本運送和保存血清標本在4下運送，置-20下長期保存。B3 抗體測定測定用抗原一般為當前人群中流行的H3N2 和H1N1亞型及乙型流感病毒。測定方法為HI法見附錄C。B4 結

25、果判斷 凡恢復期血清抗體滴度比急性期增高4倍為陽性結果，其余的均為陰性結果。附錄C資料附錄紅細胞凝集抑制試驗C1原理流感病毒粒外表的血凝素HA蛋白，含有識別和結合宿主細胞外表受體的結構，能夠與一些哺乳類動物和禽的紅細胞發(fā)生凝集，這就是紅細胞凝集現(xiàn)象。雖然多種哺乳動物和禽類的紅細胞均能被流感病毒凝集，但目前應用最廣的是豚鼠、雞和人“O”型的紅細胞?！癘”相毒株是指只能在雞胚羊膜腔或敏感細胞中生長，感染的羊水或細胞維持液只凝集人或豚鼠的紅細胞，而幾乎不凝集雞的紅細胞的流感毒株。這種毒株在雞胚尿囊腔適應傳代后，獲得了在雞胚尿囊腔復制的能力，同時還獲得了對雞紅細胞凝集能力與人及豚鼠的一樣好，這種生物學

26、特性發(fā)生改變的病毒為“D”相毒株。流感病毒能從凝集的紅細胞外表釋放下來，釋放下來的病毒還能凝集新的紅細胞，而被凝集和釋放后的紅細胞不能再被相同的病毒顆粒所凝集。于病毒懸液中加入特異性的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制紅細胞凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，即為紅細胞凝集抑制實驗。目前，紅細胞凝集和凝集抑制實驗為流感各方面工作中應用最廣泛的一種技術。C2實驗器材C21 大孔或小孔塑料板C22 10ml或1ml 或1000ul和200ul或多排吸管C23 200ul和1000ul吸頭C3試劑C31 0.85% 無菌生理鹽水C32 Alsever氏液 葡萄糖 2.08g 檸檬酸鈉 0.80 g 檸檬酸 0.055 g

27、 NaCl 0 .42g 加蒸餾水至 100ml 8磅20分鐘高壓滅菌，置4備用。C33 1% 紅細胞懸液 以雞紅細胞為例：于10或20ml注射器中先吸入約3 ml 阿氏液Alsever's Solution，然后從雞翅靜脈或心臟采集，用生理鹽水洗滌3次，前2次1500r/ min離心5min，最后1次同速度離心10min， 棄上清，用無菌生理鹽水配成1%懸液，置4待用。一般置4能保存7天左右，一旦發(fā)生溶血應棄掉。C34受體破壞酶RDEC35 免疫血清或測定血清C4紅細胞凝集實驗C41 操作步驟C411 取一干凈的大孔塑料板，標記所要測定的標本名稱C412 于第一孔加入0.25ml1：

28、2開始稀釋或0.4ml1：5開始稀釋，從第二孔開始一律各加0.25ml 0.85%生理鹽水。C413 如1：2開始稀釋，于第一孔中加入0.25ml病毒懸液；如1：5開始稀釋，于第一孔中加入0.1ml病毒懸液。用吸管吹打，使充分混勻，吸出0.25ml至第二孔，依次類推作倍比稀釋，直至最后一孔，吹打后吸出0.25ml棄掉。C414 于每孔中加入0.25ml 生理鹽水，然后再加入0.25ml 1% 紅細胞懸液。相混后置室溫或4 30-60min，而后觀察結果。 注：如采用微量法，應用小孔塑料板和稀釋槍，總量為75ul病毒25ul，25ul生理鹽水和紅細胞懸液25ul，其余同常量法。C42 觀察結果

29、結果以+、+、+、+、±和 表示之。 一層紅細胞均勻地鋪于孔上者為+。 基本同上，但邊緣不整齊，鋪的面積稍小些者為+。 紅細胞形成一個環(huán)狀，四周有小凝集塊者為+。 紅細胞形成一個小團，但邊緣不光滑，四周有小凝塊者為+。 紅細胞于孔底形成一個小團，邊緣光滑并有立體感，將板傾斜片刻，就可見紅細胞滑動象人的眼淚滴樣者為 。但用豚鼠或人“O”型紅細胞時常見不到孔底形成一個小團和眼淚滴樣結果出現(xiàn)。 “±”即為可疑，計算時以“”陰性處理。C43 紅細胞凝集滴度計算 結果以+為終點，亦即一個凝集單位。也就是說最高稀釋度病毒能引起+號的紅細胞凝集為終點，此稀釋度的倒數(shù)為紅細胞凝集滴度，簡稱

30、血凝滴度。下面以表1為例，進行計算。表 紅細胞凝集單位計算標本號病毒稀釋度滴度備注1:101:201:401:801:1601:3201:6401:12801+480取均數(shù)2+560小1/83+640不必算4+800大1/45+640先整后算6+>1280或19207<10或7.5口訣：1 先整后算。表1中，1-4，6和7不必進行整理，而5中，必須將1：640處一個加號挪到1：320處為4個加號，而1：160處變成兩個加號，然后再進行計算。2 兩個加號不用算。如表1中的3，滴度為640。3 小，小本身的1/8。如表1中的2，1：640處僅一個加號，故血凝滴度一定小于640，應為64

31、0-640/8=560。4 大，大本身的1/4。同理4中血凝滴度一定大于640，應為640+640/4=800。5 兩個極端取中間。如1，1：320為4個加號，1：640為陰性，應為320+640/2=480。C5紅細胞凝集抑制實驗C51操作步驟C511 血清中非特異抑制素的去除 受體破壞酶RDE處理法：1容量血清，加4容量RDE，37水浴1618h，然后，置56水浴50min(以破壞殘余的RDE活性)；置4保存待用，勿凍存。經(jīng)此法處理的人、雞和山羊血清對甲、乙型流感病毒的非特異性抑制素均可完全去除。RDE處理對特異性抗體無影響。但有時經(jīng)處理的血清對測定的紅細胞有非特異性凝集。如發(fā)現(xiàn)時應在處理

32、后血清中加入終濃度為20%的濃的測定用紅細胞，搖勻，置室溫60min或4過夜，1000r/min離心5min，收存上清。對人血清抗體測定時，一般均經(jīng)此步處理。C512 四個血凝單位抗原的制備 四個血凝單位計算：將血凝單位除以4，如表1中標本1，它的四個血凝單位應為：480/4=120，即將標本1進行1：120稀釋時，其稀釋液就是含四個血凝單位。配成后必須進行復核測定：取一塊干凈的大孔塑料板，在前三孔，也可任意連續(xù)的三孔，每孔加入0.25ml生理鹽水，用一根1ml的吸管，取0.25ml四個血凝單位的抗原放入第一孔，倍比稀釋至第三孔，吸出0.25ml棄之，然后每孔加入0.25 ml生理鹽水，再加入

33、0.25ml 1%紅細胞懸液，搖勻，置室溫3060 min后，觀察結果。正確結果，應第一孔出現(xiàn)+，第二孔+，第三孔陰性或+。如太大或太小都得重新配置。復核測定合格后，置4或冰上，當天使用。C513 血抑測定C5131 取一干凈的塑料板，標明測定血清標本，最后一孔為血清對照孔。C5132 每孔加入0.25ml生理鹽水。C5133 于第一孔和最后一孔中各加入0.25 ml經(jīng)RDE處理過的血清，從第一孔起作倍比稀釋至倒數(shù)第二孔，棄掉0.25ml。C5134 將最后一孔輕輕吹打后，亦棄掉0.25ml。C5135 于最后一孔加入0.25ml生理鹽水，其余各孔一律加入0.25ml四個凝集單位抗原，輕輕搖勻

34、，置室溫60 min。C5136 各孔加入0.25ml 1%的紅細胞懸液，搖勻置室溫30-60 min后觀察結果。C5137 對照組 血清對照 血清0.25ml+生理鹽水0.25ml 血凝素對照 分別加入4，2，1，1/2單位血凝素0.25ml+生理鹽水0.25ml 紅細胞對照 加生理鹽水0.5ml 以上各對照組再分別加入1%的紅細胞懸液0.25ml，搖勻，在同等條件下觀察結果。C52 結果判斷血凝的記錄同血凝測定法，以能完全抑制紅細胞凝集簡稱血抑的最高血清稀釋度的倒數(shù)為血清抗體效價，即終點。以表2為例，加以說明。表2 血抑測定結果血清號血清稀釋度效價1：101：201：401：801：160

35、1：3201：6401：12801+3202+2803+2404+2005+1606+320712808+<10或5 同樣在計算抗體效價之前，應對結果進行整理，方法同前。如6中，必須把1：320處的一個加號移到1：640處，使1：320處變成“”，而1：640處變成“+”。 根據(jù)公式進行計算： X=Y+Y/4×Z X：血清效價 Y：能引起血凝全抑制最高血清稀釋度的倒數(shù) Z：4減去不能被抑制數(shù)全抑制高一個稀釋度例如：2號血清效價：X=Y+Y/4×Z=160+160/4×4-1=280C53 交叉血抑測定和抗原比計算 為了確切了解抗原性變異的幅度，常用交叉血抑測

36、定進行抗原分析。測定中所用的免疫血清包括既往流行過的代表株和用新別離病毒制備的免疫血清。所用抗原都是和血清相應的同株抗原。每個抗原均必須準確調至四個單位，實驗必須在同一條件下進行。 根據(jù)公式計算抗原比： R=r1·r2 r1=甲血清對乙抗原的血抑滴度/甲血清對甲抗原的血抑滴度 r2=乙血清對甲抗原的血抑滴度/乙血清對乙抗原的血抑滴度 R為抗原比，當R=1時，說明兩株間抗原性相同；R<1.5/1或1/<1.5時，說明兩毒株間抗原性無明顯差異；R為1/1.51/2時說明兩毒株的抗原性有小差異，R值越大，差異越大。附錄D資料附錄神經(jīng)氨酸酶活性抑制試驗D1反應原理：D11 自由的

37、N-乙酰神經(jīng)氨酸N-acetylneuraminic acid經(jīng)神經(jīng)氨酸酶的作用，自胎球蛋白Fetuin底物中釋放。D12 經(jīng)過碘酸鹽的氧化作用，將N-乙酰神經(jīng)氨酸轉化為ß-甲酰丙酮酸-formyl pyruvic acid 。D13 ß-甲酰丙酮酸經(jīng)硫代巴比妥酸的作用形成生色團。D14 用有機溶劑提取生色團，便可用分光光度計測定之，這樣可測知標本中神經(jīng)氨酸酶活性，并可選擇用于神經(jīng)氨酸酶抑制試驗的標準劑量。神經(jīng)氨酸酶活性抑制實驗是測定血清抑制標準量酶活性的效價。NI測定已成為流感病毒鑒定不可缺少的手段之一。因NI測定結果是流感病毒神經(jīng)氨酸亞型劃分的主要依據(jù)之一。有時該法也用

38、于了解流感病毒NA抗原性變異和血清診斷等方面。NI測定不受血清中非特異性抑制素的影響，但易受病毒粒血凝素抗體的影響即空間干擾。為解決這弊端，在流感病毒鑒定中，常使用單價血清只針對NA的或基因重配毒株所制備的免疫血清如使基因重配株NA抗原為N2或N1，其HA抗原為馬1H7亞型的。D2 材料D21 試劑配制 D211 磷酸緩沖液甲液：400mmol/L 正磷酸氫二鈉乙液：400mmol/L 正磷酸二氫鈉丙液：60 mmol/L 氯化鈣 甲液19 ml加乙液81 ml混之，將pH調至5.9±0.05，pH偏高用乙液調之，偏低用甲液調之。而后加入1 ml丙液，此時CaCl2的終濃度為6 mm

39、ol/L。置4或室溫保存。注：常常加入CaCl2后，緩沖液出現(xiàn)沉淀，故我們一般不加它。甲、乙液為200 mmol/L。D212 胎球蛋白用蒸餾水把冰凍干燥的胎球蛋白配制成48-50mg/ml的溶液讓其緩慢溶解。或將冰凍保存的胎球蛋白溶液用去離子水配成工作液。D213 過碘酸鹽試劑428g過碘酸鈉(NaIO4)溶于38ml去離子水中，加62 ml濃正磷酸，充分混合，存于帶玻璃塞的棕色瓶中。D214 砷試劑10 g亞砷酸鈉NaAsO4和7.1 g無水硫酸鈉加去離子水至100 ml，混之，加0.3 ml濃硫酸，使之完全溶解。D215 硫代巴比妥酸試劑1.2 g硫代巴比妥酸和14.2 g無水硫酸鈉加入

40、去離子水至200 ml，在沸水浴中加熱溶解，用前新配，使用期為一周。D216 生理鹽水 0.85g NaCl加入100 ml去離子水，溶解，置室溫保存。D217酸化正丁醇試劑95ml正丁醇Butanol中加入5ml濃鹽酸，存在帶塞棕色瓶中置室溫保存。D218 玻璃器材和煮鍋等。D3 操作步驟D31 神經(jīng)氨酸酶活性測定D311 病毒溶液用生理鹽水作倍比稀釋，一般新鮮尿囊液抗原作1：21：32稀釋已足夠。稀釋好的病毒，每個稀釋度加一管，0.05ml/管。于底物對照管中加入0.05ml生理鹽水(不加病毒)。D312 于每管中加入0.05ml pH5.9的PBS(因流感病毒神經(jīng)氨酸酶最適pH為5.9)

41、,每管中再加入0.1 ml胎蛋白溶液,充分混合后置37水浴16-18h。 注:加每樣試劑均應送至管底;我們稀釋病毒有時直接用200 mmol/L pH5.9的PBS,每管加0.1ml,這樣做不正規(guī),但操作方便，對測定結果影響不大;有些流感病毒株NA活性很高，于37水浴2-4h(與底物一起)就可測出酶活性.D313 從水浴中取出試管，放室溫冷卻，每管加入0.1ml過碘酸鹽試劑，充分混合，置室溫20 min這個時間要精確。D314 每管緩慢加入1ml砷試劑。由于碘的釋放出現(xiàn)棕色，搖蕩試管待棕色消失乳白色出現(xiàn)為止。必要時試驗可在此步暫停，測定物置4冰箱保存。其余測定步驟一律不能暫停。D315 每管加

42、入2.5ml硫代巴比妥酸試劑，充分混合。該試劑在煮沸溶解時趁熱加入管中。D316 立刻將試管置煮沸的水浴中煮15min，此時所出現(xiàn)的紅色即為神經(jīng)氨酸酶活性的反應。D317 將試管置冰水中冷卻，然后加入4ml酸化正丁醇，塞上干凈的膠皮塞，用手劇烈搖蕩1-2min，使紅色轉到丁醇層。D318 1500r/min離心5min,上層到達透明不混濁。D319 將分光光度計波長調至549nm，用底物對照管調零點，而后，從高稀釋度到低稀釋度，將管中的上層溶液吸置透光池中，依次測出并記錄它們的吸光度A值曾稱光密度OD值，A值越高說明酶活性越強。D3110 一個酶單位確定：一般將A值為0.45-0.85的病毒稀

43、釋度作為一個酶單位。我們常將A值為0.5的病毒稀釋度為一個酶單位，用于酶活性抑制測定。一個酶單位確定方法如下：將上述測到的數(shù)據(jù)作直線回歸，找出A值為0.5的病毒稀釋度。但也可以下方法來確定：（1） 取一張半對數(shù)坐標紙，其縱軸對數(shù)表示病毒的稀釋度，橫軸算術表示吸光度。于吸光度值為0.5處畫一條與縱軸平行的直線。（2） 將所得的A值一一標在相應的位置上，見圖1示意圖。（3） 在吸光值0.5附近找出4個點，其中2個點A值大于0.5，而另2個點小于0.5。在這4個點中找出一條直線，這條直線要使它一側點至其垂直線的平均值與另一側點到其垂直線的平均值相等。這條線與0.5的垂直線有一個交叉點圖中X點。（4）

44、 從X點向縱軸線劃一條與橫坐標相平行的線圖中虛線，這條線與縱坐標相交的點為Y。（5） Y點所示的數(shù)字如8，也就是說當測定病毒1：8稀釋時就相當于一個酶單位。注：由于病毒鑒定時多為定性，一般做到步驟6D3.1.6已足夠，接著可憑經(jīng)驗判斷病毒所用的濃度；有些流感病毒株酶活性很低，經(jīng)延長與底物孵育時間后仍很低，對這些毒株進行酶鑒定時，需靈活掌握，一般肉眼見到有一定的紅色吸光度肯定小于0.5也就可以了。D32 神經(jīng)氨酸酶活性抑制測定D321 測定血清作0.5Lg稀釋一個0.5Lg稀釋為1：3.16，它的近似值為1：3.2。具體稀釋法舉例如圖2。稀釋好的血清從高稀釋度到低稀釋度各取出0.05 ml于標好

45、相應稀釋度的空管中.按同法做正常血清對照組。D322 將已測定的抗原用生理鹽水配成一個酶單位，加入測定血清和對照血清中，0.05 ml/管。相混，37水浴孵育1h。D323 從水浴中取出試管，每管加入0.1 ml胎球蛋白溶液，混合，置37水浴16-18h。D324 從水浴取出，接著步驟同酶測定步驟3-9D3.1.3-D3.1.9。但吸上層溶液于透光池中，應從低稀釋度血清到高稀釋度血清。D325 計算血清對神經(jīng)氨酸酶活性抑制效價：根據(jù)測定血清與正常血清兩組的測定結果，求每組血清同一稀釋度A值的商數(shù)，即為經(jīng)血清作用后所剩的酶活性百分數(shù)。具體計算公式如下： 每一稀釋度如1：10血清+病毒的A值 X

46、100% = %酶活性 同一稀釋度1：10正常血清+病毒的A值D326 血清效價是能抑制50%酶活性的最高血清稀釋度的倒數(shù)。它確實定方法如下：（1） 取一張半對數(shù)坐標紙，縱坐標對數(shù)表示血清稀釋度，橫坐標算術表示剩下神經(jīng)氨酸酶活性的百分數(shù)。（2） 將“5”步驟D3.2.5所得的數(shù)放在坐標紙上應在的位置。如圖3。3從酶活性剩余50%處劃一條與縱坐標平行的直線，在50%酶活性處找出3-4個點，使其中1-2個點剩余酶活性不到50%，而其他1-2個點剩余酶活性大于50%，在這3-4個點間畫一條直線，同樣使這條直線一側的1-2點至直線垂直線的平均值與另一側的垂直線平均值相等。4從這條線與50%線相交處途中

47、x向縱坐標劃一條與橫坐標相平行線。這條線與縱坐標相交叉y處所表示的數(shù)字即為血清效價。如y處為1400，則該血清神經(jīng)氨酸酶抑制效價為1：1400。當然也可用直線回歸來計算。注：對流感病毒株鑒定時，我們對陽性血清常用200mmol/L pH5.9的PBS進行倍比稀釋，一般從1：10開始，用量0.1ml/管，這樣加上0.1ml抗原在加0.1ml底物，這時總量為0.3ml/管，與標準的0.2ml/管有出入，但對定性測定影響不大；正常對照血清用不同亞型或不同型免疫血清替代；結果常用肉眼判斷，不測A值；至于血凝素抗體空間干擾問題，一般情況不加以重視，因它的干擾程度約為10%，我們所用的免疫血清血抑效價多為

48、1：640左右，這樣當NI效價40時可判為陽性，一般就不受空間干擾影響了；當然對關鍵重要毒株鑒定時，需用單價的抗血清進行鑒定；在磷酸緩沖液中需加入終濃度為1的NaN3；Russ 等人曾報道用三硝基甲苯X-100Triton X-100，Yamane等人報道用多聚仙梨醇 Nonidet P40直接處理完整的病毒粒，就能排除空間干擾，根據(jù)我們的實踐，這些方法效果不穩(wěn)定。附錄E資料附錄對流免疫電泳及瓊脂凝膠沉淀試驗E1 對流免疫電泳 Counter- Immunoelectrophoresis E11 原理帶電顆粒向著與它相反電荷的電極移動，稱為“電泳”。膠體顆粒由于解離或吸附而使外表帶電荷，在電場

49、中便發(fā)生移動。例如蛋白質由于有暴露在外表的極化基團，如-COO- 基和NH3+，在酸性溶液里-COO- 基和H+結合，生成不解離的-COOH，結果蛋白質分子外表的NH3+基過剩，使它帶有正電荷；反之，在堿性溶液里，-OH-與-NH3+基作用生成H2O和不帶電荷的-NH2基，結果，分子因-COO-基過剩而帶負電荷。反應式如下： NH3+ NH3+在酸性條件下：蛋白質 +H+ 蛋白質 COO- COOH NH3+ NH2在堿性條件下：蛋白質 +OH- 蛋白質 +H2O COO- COO- 在某一特定pH時，蛋白質分子凈電荷為零，這時的pH為該蛋白的等電點。在等電點的pH溶液中，蛋白質分子既不向正極也不向負極移動。根據(jù)