硼替佐米單用或聯(lián)合三尖杉酯堿體外誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研

1、硼替佐米單用或聯(lián)合三尖杉酯堿體外誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究(1)】 本研究探討硼替佐米（bortezomib， Bor）單用或聯(lián)合三尖杉酯堿（harringtonine， HT）對(duì)HL60細(xì)胞凋亡的影響。以不同濃度Bor、HT處理HL60細(xì)胞12-48小時(shí)，采用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活性，以DNA凝膠電泳、熒光顯微鏡檢、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明： 10-50 nmol/L Bor可有效抑制HL60細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。其中10 nmol/L劑量處理12小時(shí)即有細(xì)胞凋亡發(fā)生，延長作用時(shí)間或增加藥物劑量可使細(xì)胞凋亡率明顯增加。30 nmol/L HT與10 nmol/L Bor聯(lián)合應(yīng)

2、用時(shí)，可見HL60細(xì)胞凋亡率比兩種藥物單獨(dú)使用時(shí)顯著增加。結(jié)論： Bor對(duì)HL60細(xì)胞具有時(shí)間和劑量依賴性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，與HT聯(lián)合應(yīng)用有明顯的協(xié)同作用。 【關(guān)鍵詞】 硼替佐米； 三尖杉酯堿； 凋亡 Induction of Apoptosis in HL60 Cells by Bortezomib aloneorin Combination with Harringtonine In VitroAbstractThe aim of this study was to investigate the effect of bortezomib alone and in combination

3、 with harringtonine on apoptosis of HL60 cells. HL60 cells were treated with bortezomib, harringtonine in different concentrations for 12-48 hours. Cell proliferation was analyzed by MTT assay； the apoptosis of HL60 cells was observed by DNA gel electrophoresis， fluorescence microscopy and flow cyto

4、metry. The results showed that 10-50 nmol/L bortezomib could effectively inhibit HL60 cell proliferation, and induced its apoptosis. After treating for 12 hours, 10 nmol/L bortezomib could trigger cells apoptosis. With time prolongation ordose increase, HL60 cell apoptotic rate significantly increas

5、ed. Furthermore, coadministration of bortezomib (10 nmol/L) with harringtonine (30 nmol/L) resulted in a higher cell apoptotic rate when compared with that induced by those agents used alone. It is concluded that the bortezomib can induce HL60 cells apoptosis in a timeanddosedependent manner and syn

6、ergistic effectiveness can be found when bortezomib combined with harringtonine.Key wordsbortezomib; harringtonine; apoptosisJ Exp Hematol 2007; 15(2):233-236急性白血病是一類惡性克隆性疾病，雖然其治療水平近年來已有了明顯提高，但仍有相當(dāng)一部分患者因疾病復(fù)發(fā)或耐藥而轉(zhuǎn)變成難治的白血病，因此積極尋求新的治療方法在當(dāng)前仍然顯得尤為重。硼替佐米（bortezomib，Bor）是一種新型抗腫瘤靶向治療藥物，目前主用于復(fù)發(fā)或難治的多發(fā)性骨髓瘤的治療，

7、并已顯示出良好的療效1。研究顯示Bor在體外對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞均具有良好的療效，但在急性白血病方面的研究至今報(bào)道很少，更未見與三尖杉酯堿（harringtonine, HT)聯(lián)合應(yīng)用的研究報(bào)告。本研究首次揭示Bor與HT聯(lián)合作用于HL60細(xì)胞的效果，為臨床用于治療白血病提供理論依據(jù)。材料和方法試劑RPMI 1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品，新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，MTT、Hoechst33342、碘化丙錠（PI）、RNA酶A、蛋白酶K均為Sigma公司產(chǎn)品。硼替佐米（bortezomib、Velcade、萬珂）為美國Millennium公司產(chǎn)品（西安楊森制藥有限公司惠贈(zèng)），用無菌水配

8、成1 mg/ml濃度備用。三尖杉酯堿注射液為北京協(xié)和制藥廠產(chǎn)品，使用時(shí)稀釋到實(shí)驗(yàn)所需的濃度。細(xì)胞培養(yǎng)HL60白血病細(xì)胞株購自天津血液病研究所，用含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，在37、5% CO2條件下培養(yǎng)，1-2天換液1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志 J Exp Hematol 2007; 15(2)硼替佐米或聯(lián)合三尖杉酯堿誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究研究方案 依預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇Bor（10-50 nmol/L）和HT（7.5-75 nmol/L）分別單獨(dú)處理HL60細(xì)胞12-48小時(shí)，觀察藥物劑量反應(yīng)效應(yīng)。根據(jù)藥物反應(yīng)結(jié)果，選擇HT IC50劑量與Bor各濃度聯(lián)

9、合，觀察藥物聯(lián)合后對(duì)HL60細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)。細(xì)胞增殖活性MTT檢測對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)整密度為1105 cells/ml，每孔100 l接種，按求加入不同濃度處理藥物，終體積200 l/well，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)至相應(yīng)的時(shí)間后加入20 l MTT（5 mg/ml），繼續(xù)孵育4小時(shí)。離心并吸棄上清，加DMSO 170 l/well,輕震蕩，酶標(biāo)儀測570 nm OD值（A）。細(xì)胞活力計(jì)算:細(xì)胞活力（%）=（A處理組A調(diào)零組/A對(duì)照組A調(diào)零組）100% 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Hoechst33342以終濃度10 g/ml加入培養(yǎng)板各處理組細(xì)胞中，避光染色15分鐘，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。DN

10、A提取及電泳 參照文獻(xiàn)2,分別收集各濃度藥物處理的細(xì)胞5105個(gè)，用PBS洗滌1次，加入20 l裂解緩沖液EDTA 20 mmol/L, Tris 100 mmol/L, pH 8.0, 0.8%(w/v) SDS和10 l RNA酶A（10 mg/ml）, 37水浴60分鐘。再加入10 l蛋白酶K（20 mg/ml）,55水浴120分鐘。取20 l樣品加6 l 10DNA上樣緩沖液，80 V，電泳50分鐘。紫外燈下顯示，拍照。流式細(xì)胞術(shù)分析 分別收集各濃度藥物處理的細(xì)胞1106個(gè)，用PBS洗滌后，70%乙醇4固定。24小時(shí)后用PBS再洗滌1次，加1 ml PI(100 g/ml)和RNA酶A

11、（100 g/ml）染液，于4避光染色30分鐘，400目篩網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞儀檢測。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，設(shè)定P0.05為顯著性差異。結(jié)果HL60細(xì)胞增殖活性10-50 nmol/L Bor 對(duì)HL60細(xì)胞的增殖均有一定抑制作用，表現(xiàn)為時(shí)間劑量依賴關(guān)系，隨濃度增加和時(shí)間延長抑制效果逐漸增強(qiáng)（圖1），其24小時(shí)的IC50為20 nmol/L。30 nmol/L劑量處理12-48小時(shí)，細(xì)胞抑制率與對(duì)照組相比差別均有顯著性意義（P0.01）；作用24小時(shí)時(shí)，抑制效果達(dá)到最大，但與48小時(shí)相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.328），而

12、與12小時(shí)或18小時(shí)相比，抑制效果明顯增強(qiáng)，有顯著性意義（P=0.002、P=0.011），其余濃度也均可見類似規(guī)律。以7.5、15、22.5、30、37.5、56.2、75 nmol/L HT處理HL60細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞活力分別下降為對(duì)照的92%、82%、61%、47%、33%、23%、21%，也顯示出明顯的劑量依賴性抑制效應(yīng)，其24小時(shí)的IC50劑量約為30 nmol/L。選擇30 nmol/L HT與Bor各濃度聯(lián)合，可見在達(dá)到最大抑制效果前，聯(lián)合處理組對(duì)細(xì)胞的抑制作用比同劑量兩藥任一種單獨(dú)使用時(shí)都顯著增強(qiáng)(P0.01）（圖2）。作者：孫啟鑫，孟凡義，扶云碧，李利【摘】 本研究探討硼替

13、佐米（bortezomib， Bor）單用或聯(lián)合三尖杉酯堿（harri 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變Hoechst33342染色顯示，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后對(duì)照組細(xì)胞無凋亡發(fā)生，細(xì)胞核呈均勻、彌散的藍(lán)色熒光（圖3A）；而Bor（圖3B）與HT（圖3C）單獨(dú)或聯(lián)合處理組均可見細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞核凝集、固縮，形成質(zhì)密明亮的藍(lán)色熒光顆粒；且單位視野下10 nmol/L Bor與30 nmol/L HT聯(lián)合處理組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于

14、同劑量Bor或HT單獨(dú)處理組（圖3D）。DNA凝膠電泳 10-50 nmol/L Bor 處理細(xì)胞12小時(shí)，DNA凝膠電泳均可見明顯DNA Ladder出現(xiàn), 其中10 nmol/L Bor處理組還可見正?；蚪MDNA條帶和凋亡DNA Ladder共存。相同條件下，延長作用時(shí)間至24小時(shí)，各處理組仍可見明顯DNA Ladder，但10 nmol/L處理組正?；蚪M條帶消失，顯示隨時(shí)間延長Bor作用效果增強(qiáng)。此外，30 nmol/L HT單獨(dú)或與10 nmol/L Bor聯(lián)合處理細(xì)胞24小時(shí)，DNA凝膠電泳也均顯示出明顯DNA Ladder。流式細(xì)胞術(shù)檢測對(duì)照組經(jīng)12小時(shí)和24小時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞無明顯

15、凋亡，亞G1期、G0/G1期、G2/M期細(xì)胞比率分別為2%、53%和24%，而 Bor與HT各處理組則均可見凋亡亞G1峰出現(xiàn)，其中Bor各處理組細(xì)胞凋亡率還呈現(xiàn)隨劑量增加而明顯增高的規(guī)律。10 nmol/L Bor處理細(xì)胞12小時(shí)和24小時(shí)，凋亡率分別為5%和19%。30 nmol/L Bor處理12小時(shí)和24小時(shí)，凋亡率分別為59%和62%，顯著高于同時(shí)間10 nmol/L處理的效果（P值均0.01）。HT 30 nmol/L處理細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率、G0/G1期比率明顯增加，分別為11%和65%，與10 nmol/L Bor聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增至44%，顯著高于各藥物單獨(dú)處理

16、時(shí)效果P0.01（圖4）。討論Bor是一種新型抗腫瘤靶向治療藥物，主通過抑制真核細(xì)胞26S蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的降解，促使多種與細(xì)胞增殖、分化、存活、凋亡密切相關(guān)的蛋白代謝發(fā)生紊亂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡3。研究表明，Bor能有效抑制放療、化療引起的NFB激活，阻止多種抗凋亡蛋白和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，增加細(xì)胞對(duì)放療、化療的敏感性；同時(shí)，通過穩(wěn)定多種細(xì)胞周期蛋白（P53，P21，P27）的表達(dá)，促使細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡4。目前，作為第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的蛋白酶體抑制劑類藥物Bor對(duì)復(fù)發(fā)或難治的多發(fā)性骨髓瘤患者已顯示出良好的療效，對(duì)白血病的療效也正在評(píng)價(jià)之中。Gatto等5報(bào)道，多種髓系白血病細(xì)胞

17、株對(duì)Bor均敏感，單獨(dú)應(yīng)用時(shí)其IC50劑量均在10-15 nmol/L之間。Horton等6發(fā)現(xiàn)，Bor不但對(duì)各型急性白血病細(xì)胞株有效，對(duì)白血病原代細(xì)胞也具有明顯抑制作用，但不同細(xì)胞類型對(duì)其敏感性略有差異。急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株（Jurkat、Molt4等）敏感性最高（平均IC50為7.5 nmol/L），急性髓系白血病原代細(xì)胞敏感性最差（平均IC50為30 nmol/L）。本研究顯示，對(duì)于急性髓系白血病HL60細(xì)胞，Bor 的有效抑制濃度為10-50 nmol/L，其中10 nmol/L劑量處理12小時(shí)即可抑制HL60細(xì)胞增殖，30 nmol/L處理24小時(shí)達(dá)最大抑制效果，這與國外文獻(xiàn)報(bào)告

18、基本一致6。Dai等7、8報(bào)道，Bor與細(xì)胞周期激酶抑制劑flavopiridol聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)U937細(xì)胞和Bcr/Abl 的K562細(xì)胞具有明顯的協(xié)同誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。Horton等4報(bào)道，Bor體外聯(lián)合地塞米松、熱休克蛋白抑制劑格爾德霉素（geldanamycin），可明顯增強(qiáng)它們對(duì)各自敏感細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用；Bor分別與長春新堿、阿霉素、阿糖胞苷、門冬酰胺酶，Bcl2抑制劑（HA 14.1）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞毒作用也均比各自單用時(shí)明顯增強(qiáng)。另外，Smolewski 等9報(bào)道，對(duì)于BCLL原代細(xì)胞，小劑量5 nmol/L Bor單用時(shí)細(xì)胞抑制率即為48%，聯(lián)合CD52單克隆抗體應(yīng)用后抑制率顯著增

19、至64%，如果將用藥順序改為預(yù)先應(yīng)用CD52單克隆抗體作用24小時(shí)，再加入Bor，結(jié)果細(xì)胞抑制率比它們同時(shí)應(yīng)用時(shí)還高。本研究中，我們首次將HT與Bor進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，研究它們對(duì)HL60細(xì)胞增殖、凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 nmol/L Bor 與30 nmol/L HT單用24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別為19%和11%，而聯(lián)合后凋亡率顯著增至44%，顯示兩者之間具有明顯的協(xié)同作用。但在臨床急性白血病治療中，如HA 方案聯(lián)合Bor同時(shí)應(yīng)用，對(duì)患者是否會(huì)產(chǎn)生更好的療效，值得進(jìn)一步探討。目前，Bor單獨(dú)或聯(lián)合各種化療治療白血病的臨床試驗(yàn)已經(jīng)展開，已有期臨床試驗(yàn)報(bào)道10，對(duì)于難治或復(fù)發(fā)的急性白血病患者，Bor單

20、藥最大耐受劑量為1.25 mg/m2，常見的劑量相關(guān)性副反應(yīng)有惡心、嘔吐、 直立性低血壓、血小板減少等，最終在參加試驗(yàn)的15人中，5人獲得了明顯的血液學(xué)改善。此外，另一項(xiàng)評(píng)價(jià)Bor與阿糖胞苷（100 mg/m2，1-7天）、去甲氧柔紅霉素（12 mg/m2，1-3天）方案聯(lián)用安全性的期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行之中11，初步結(jié)果顯示: 1.0 mg/m2 劑量Bor與阿糖胞苷、去甲氧柔紅霉素聯(lián)合應(yīng)用，患者的耐受性均良好。在目前可評(píng)價(jià)的12名急性髓系白血病患者（均為18歲以上復(fù)發(fā)或60歲以上初發(fā)）中，有7例獲得完全緩解。總之，本研究顯示Bor能夠有效地誘導(dǎo)白血病HL60細(xì)胞凋亡，與HT聯(lián)合應(yīng)用，凋亡效果

21、顯著增強(qiáng)，顯示了很好的臨床應(yīng)用前景。【參考文獻(xiàn)】1Boccadoro M, Morgan G, Cavenagh J. Preclinical evaluation of the proteasome inhibitor bortezomib in cancer. Cancer Cell Int, 2005; 5: 18-272D. L.斯佩克特著 (黃培堂等譯). 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南. 北京: 科學(xué)出版社. 2001：108-1093蘭雨,張學(xué)敏,胡美茹等. 阻斷泛素蛋白酶體通路誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡及機(jī)制探討. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2001; 9:105-1094Voorhees PM, Dees

22、 EC, ONeil B, et al. The proteasome as a target for cancer therapy. Clin Cancer Res， 2003; 9:6316-63255Gatto S, Scappini B, Pham L， et al. The proteasome inhibitor PS341 inhibits growth and induces apoptosis in Bcr/Ablpositive cell lines sensitive and resistant to imatinib mesylate. Haematologica, 2

23、003; 88:853-8636Horton TM, Gannavarapu A, Blaney SM, et al. Bortezomib interactions with chemotherapy agents in acute leukemia in vitro. Cancer Chemother Pharmacol, 2006; 58:13-237Dai Y, Rahmani M, Pei XY, et al. Bortezomib and flavopiridol interact synergistically to induce apoptosis in chronic myeloid leukemia cells resistant to imatinib mesylate through both Bcr/Abldependent and independent mechanisms. Blood, 2004; 104: 509-518作者：孫啟鑫，孟凡義，扶云碧，李利【摘】 本研究探討硼替佐米（bortezomib， Bor）單用或聯(lián)合三尖杉酯堿（harri 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或