無形體病標本采集運送及實驗室檢測

1、無形體病標本采集運送無形體病標本采集運送及實驗室檢測及實驗室檢測武漢市疾病預防控制中心微檢科武漢市疾病預防控制中心微檢科 曾瑩春曾瑩春2009.07.02，武漢，武漢標本采集運送標本采集運送n標本采集對象：標本采集對象：n疑似病例疑似病例n密切接觸者或其他健康人群密切接觸者或其他健康人群n疫源地可疑宿主動物（野生動物及狗、羊、牛等家畜）、媒介蜱。標本采集運送標本采集運送n標本的種類：標本的種類：n疑似病例血液疑似病例血液: 病人血液（抗凝血病人血液（抗凝血&非抗非抗凝血）凝血）n人粒細胞無形體病尸檢標本人粒細胞無形體病尸檢標本:病人脾臟、病人脾臟、肝臟各肝臟各1克克X3份。份。n密切接

2、觸者或其他健康人群血：密切接觸者或其他健康人群血：5mLX1份份n可疑野生動物及狗、羊、牛、吸血蜱、不可疑野生動物及狗、羊、牛、吸血蜱、不吸血蜱的脾臟、肝臟各吸血蜱的脾臟、肝臟各1克克X3份。份。不同標本的采集技術n無菌采集。無菌采集。n抗凝血標本：常用EDTA 抗凝管或枸櫞酸鹽抗凝管采集血液5ml，用于病原分離。應盡可能在病人使用抗生素前進行血液的采集。n非抗凝血標本：用標準無菌真空管，用于血清抗體及PCR 檢測。采集后，應及時分離血清，將血清、血球分別保存。nPS-血清標本：不加任何抗凝劑。血清學檢測需采集急性期與恢復期雙份血清（至少間隔3周）。如果不能及時檢測，應儲存在-70或液氮中。如

3、果恢復期標本沒有4倍升高，應建議醫(yī)生采集第三份血（至少間隔2周）。盡量避免溶血。不同標本的采集技術采集動物體表媒介蜱，用鑷子夾取，放入鋪墊有潮濕濾紙或紗布的青霉素小瓶或試管中，用紗布包緊瓶口以防止蜱爬出。標本運送標本運送nB類包裝n同時附流調(diào)資料、病歷資料n標本運送 溫度： 0- 4度標本采集的原則n檢測的關鍵步驟檢測的關鍵步驟n最佳采集時間、數(shù)量、種類最佳采集時間、數(shù)量、種類n廣泛的思路：廣泛的思路：檢驗人員需具備的流行病學和臨床知識檢驗人員需具備的流行病學和臨床知識n理想的信息記錄：理想的信息記錄：認真填寫采樣登記表、獨立的編號規(guī)則認真填寫采樣登記表、獨立的編號規(guī)則 n最佳保藏條件和方法：

4、最佳保藏條件和方法：帶螺旋蓋凍存管，帶螺旋蓋凍存管，4度、度、-70度度n明確責任人和聯(lián)系方式明確責任人和聯(lián)系方式實驗室檢測方法實驗室檢測方法n包涵體檢測n血清學方法檢測n分子生物學方法檢測n病原體分離標本滅活、病原標本滅活、病原DNA 標本提取及病原體分離操作應在生物安全標本提取及病原體分離操作應在生物安全級實驗級實驗室進行。非感染性材料的檢測可在生物安全室進行。非感染性材料的檢測可在生物安全I 級實驗室進行。級實驗室進行。血細胞血細胞染色檢查包涵體染色檢查包涵體 厚血片法。厚血片法。 國際血液學標準化委員會推薦羅氏國際血液學標準化委員會推薦羅氏RomanowskyRomanowsky) )

5、染色為標準染色法。染色為標準染色法。 國內(nèi)主要采用瑞氏（國內(nèi)主要采用瑞氏（Wright)Wright)染色法、染色法、姬氏（姬氏（GiemsaGiemsa) )染色法或瑞染色法或瑞姬（姬（W-G)W-G)混混合染色法。染料加磷酸鹽控制其合染色法。染料加磷酸鹽控制其PHPH值，值，可克服使用瑞氏、姬氏染色中存在的缺可克服使用瑞氏、姬氏染色中存在的缺點。點。 Wright-Giemsa（中性粒細胞中可見桑葚狀包涵體）（中性粒細胞中可見桑葚狀包涵體） 血清學血清學檢測方法間間接免疫接免疫螢螢光光實驗實驗(IFA)(IFA)采集急性期采集急性期與與恢恢復復期期雙份雙份血血清清，推薦，推薦國際國際質(zhì)質(zhì)量

6、量認證認證（ISOISO）的商）的商業(yè)產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品（品（FOCUS)FOCUS)作作間間接免疫接免疫熒熒光光試驗試驗。FOCUS KIT微量間接免疫熒光法微量間接免疫熒光法 采集急性期與恢復期雙份血清，采集急性期與恢復期雙份血清，推薦推薦國 際 質(zhì) 量 認 證 （國 際 質(zhì) 量 認 證 （ I S OI S O ） 的 商 業(yè) 產(chǎn) 品） 的 商 業(yè) 產(chǎn) 品（FOCUS)FOCUS)作間接免疫熒光試驗。作間接免疫熒光試驗。IFAIFA檢測檢測結果按說明書進行結果按說明書進行 病人血清抗體病人血清抗體人粒細胞無形體抗人粒細胞無形體抗原原熒光標記的抗抗體熒光標記的抗抗體結果觀察結果觀察IFAIFA檢測檢

7、測HGAIgMHGAIgM抗體陽性結抗體陽性結果（感染細胞胞漿內(nèi)可見果（感染細胞胞漿內(nèi)可見黃綠色熒光包涵體）黃綠色熒光包涵體）IFAIFA檢測檢測HGAIgMHGAIgM抗體陰性結抗體陰性結果（感染細胞胞漿內(nèi)無黃果（感染細胞胞漿內(nèi)無黃綠色熒光包涵體）綠色熒光包涵體）間接免疫熒光法間接免疫熒光法n急性期血清：急性期血清：IgM 1:32, IgG 1:64 有參考有參考意義。意義。n恢復期雙份血清恢復期雙份血清: IgM或或IgG四倍增長有診四倍增長有診斷參考意義。斷參考意義。抗體交叉現(xiàn)象抗體交叉現(xiàn)象n斑點熱：斑點熱：n埃立克體?。喊Ａ⒖梭w病：n嗜吞噬無形體：嗜吞噬無形體：nQ熱：熱：n立克次體

8、：斑疹傷寒立克次體：斑疹傷寒分類分類用途用途 血清學診斷在發(fā)病一周內(nèi)往往檢測不到抗血清學診斷在發(fā)病一周內(nèi)往往檢測不到抗體體, ,而病原分離操作復雜而病原分離操作復雜, ,且分離率十分低。以且分離率十分低。以PCR PCR 擴增及測序為主要手段的分子生物學技術擴增及測序為主要手段的分子生物學技術目前已取代病原分離作為直接診斷依據(jù)。目前已取代病原分離作為直接診斷依據(jù)。16SrRNA16SrRNA基因檢測：基因檢測： PCRPCR檢測無形體最常用的擴增基因是檢測無形體最常用的擴增基因是16SrRNA16SrRNA，該方法已在國際上普遍應用并得到良好的方法學，該方法已在國際上普遍應用并得到良好的方法學

9、評估。采用無形體及埃立克體屬通用引物及種特異分型引評估。采用無形體及埃立克體屬通用引物及種特異分型引物同時進行檢測物同時進行檢測, ,可以區(qū)分無形體與埃立克體。但要特別注可以區(qū)分無形體與埃立克體。但要特別注意意PCRPCR檢測應分區(qū)進行，避免污染。檢測應分區(qū)進行，避免污染。無形體無形體PCRPCR檢測（巢式檢測（巢式PCRPCR）為提高為提高PCR PCR 方法的特異性方法的特異性, ,目前巢式目前巢式PCR PCR 已普遍取代已普遍取代常規(guī)常規(guī)PCRPCR。如。如17KD 17KD 、gltAgltA 、ompBompB 、56KD56KD， 巢式巢式PCR PCR 分別被用來檢測斑疹傷寒分

10、別被用來檢測斑疹傷寒群和斑點熱群、恙蟲病立群和斑點熱群、恙蟲病立克次體、無形體?？舜误w、無形體。巢式巢式PCRPCR當靶基因表達量較低或常規(guī)當靶基因表達量較低或常規(guī)PCRPCR無法得到理想的擴增產(chǎn)物時，無法得到理想的擴增產(chǎn)物時，對靶基因進行第二次擴增以獲得足夠和特異的擴增產(chǎn)物對靶基因進行第二次擴增以獲得足夠和特異的擴增產(chǎn)物。外引物對外引物對內(nèi)引物對內(nèi)引物對無形體及埃立克體巢氏無形體及埃立克體巢氏PCRPCR檢測檢測16SrRNA16SrRNA基因常用引物基因常用引物通用通用引物引物埃立埃立克體克體無形無形體體無形無形體體uDNADNA抽提抽提材料材料疑似病例的全血標本疑似病例的全血標本QIAGENQIAGEN公司的公司的DNADNA