光譜分析技術(shù)

1、學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握光譜分析中的對(duì)比法、摩爾吸收系數(shù)法、比濁法測定的方法原理，在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用及注意事項(xiàng)；區(qū)帶電泳的原理、應(yīng)用及影響因素；離子選擇性電極法測定的原理和注意事項(xiàng)。 熟悉離心技術(shù)，其它電泳技術(shù)和層析技術(shù)中的HPLC及親和層析的原理和應(yīng)用；免疫分析技術(shù)、生物傳感技術(shù)的概念和應(yīng)用原理。 了解色譜、層析等常用生化技術(shù)的應(yīng)用原理和方法，生物芯片技術(shù)的概念和應(yīng)用原理 是能的一種表現(xiàn)形式，是電是能的一種表現(xiàn)形式，是電磁波的一種。光在真空中以直磁波的一種。光在真空中以直線方式傳播，在不同的介質(zhì)處線方式傳播，在不同的介質(zhì)處發(fā)生發(fā)生反射反射、折射折射、衍射衍射、色散色散、干涉干涉和和偏振偏振等現(xiàn)象?？捎貌?/p>

2、長、等現(xiàn)象?？捎貌ㄩL、頻率、傳播速度等參量來描述頻率、傳播速度等參量來描述即光具有即光具有“波波動(dòng)動(dòng)性性”。光的顏。光的顏色色即由光的波長決定，人眼能感即由光的波長決定，人眼能感覺到的光稱為可見光，其波長覺到的光稱為可見光，其波長在在400750nm之間。在可見之間。在可見光之外是光之外是 紅外光紅外光7601000nm 紫外光紫外光200400nm什么是光譜分析技術(shù)？光的波長（） 單位用納米（nm）各種化學(xué)物質(zhì)都具有一定的光譜特性，表現(xiàn)在能選擇性吸收、發(fā)射或散射某種波長的光。利用物質(zhì)的吸收光譜、發(fā)射光譜或散射光譜特征對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的技術(shù)稱為光譜分析技術(shù)。光譜分析技術(shù)原理：利用各種化

3、學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。光譜分析技術(shù)分類：光譜分析技術(shù)分類：發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、熒光法發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、熒光法吸收光譜分析技術(shù)：吸收光譜分析技術(shù)：紫外紫外、紅外、原子、紅外、原子、可見光可見光分光光度法分光光度法散射光譜分析技術(shù)：散射光譜分析技術(shù)：比濁比濁法法一、分光光度技術(shù)的基本原理 許多化學(xué)物質(zhì)具有顏色，有些無顏色的化合物也可以與顯色劑作用，生成有色物質(zhì)。實(shí)踐證明，有色溶液的濃度越大，顏色越深；濃度越小，顏色越淺。因此，可以通過比較

4、溶液顏色深淺的方法來確定有色溶液的濃度，對(duì)溶液中所含的物質(zhì)進(jìn)行定量分析?；诒容^顏色深淺對(duì)溶液進(jìn)行定量分析的方法稱為比色分析法。 光子的能量與波長的關(guān)系為 E=h= hc式中E為光子的能量（J：焦耳），為頻率，h為普朗克常數(shù)（6.6310-34JS），c為光速，為光的波長 因此，不同波長的光，其能量不同，短波能量大，長波能量小。光的顯色原理若把某兩種顏色的光，按一定的強(qiáng)度比例混合，能夠得到白色光，則這兩種顏色的光叫做互補(bǔ)色。圖中處于直線關(guān)系的兩種光為互補(bǔ)色。如綠光和紫光為互補(bǔ)色，黃光和藍(lán)光為互補(bǔ)色等等。各種溶液會(huì)呈現(xiàn)出不同的顏色，其原因是溶液中有色質(zhì)點(diǎn)（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光。實(shí)

5、驗(yàn)證明：溶液所呈現(xiàn)的顏色是其主要吸收 光的互補(bǔ)色。如一束白光通過高 錳酸鉀溶液時(shí)，綠光大部分被選 擇吸收，其它的光透過溶液。從 互補(bǔ)色示意圖可以看出， 透過光 中只剩下紫色光，所以高錳酸鉀 溶液呈紫色。（二）光的吸收定律溶液顏色的深淺與濃度之間的關(guān)系可以用吸收定律來描述。它是由約翰海因里希朗伯和奧古斯特比爾相結(jié)合而成的，所以叫朗伯-比爾定律。原子吸收分光光度計(jì)也符合這個(gè)定律。溶液對(duì)光的吸收 當(dāng)一束強(qiáng)度為I的平行單色光照到溶液時(shí)，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光則透過溶液，如圖所示結(jié)論： I0=I a+ I r+ I t I0-入射光強(qiáng)度 I a-吸收光強(qiáng)度 I r-反射光強(qiáng)度

6、I t-透射光強(qiáng)度 通常由于I r很小可忽略不計(jì)，上式可簡化為 I0=I a+ I t透射光I t與入射光強(qiáng)度I0之比為透光率或透光度，用T表示： T= I t/ I 0透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度或光密度或消光度，用A表示： A=lgT=lg1/T=lgI 0/ I t吸光度越大，表示該物質(zhì)對(duì)光的吸收越強(qiáng)。透光度和吸光度都是用來表示入射光被吸收的程度，它們之間可據(jù)式相互換算。 實(shí)驗(yàn)證明：單色光經(jīng)過有色溶液時(shí)，透過溶液的光強(qiáng)度不僅與溶液的濃度 有關(guān)，而且還與溶液的厚度以及溶液本身對(duì)光的吸收性能有關(guān)。 其規(guī)律可用下式表示為 AKCL 式中： A吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）； K某溶液的消光（

7、吸收）系數(shù)； C溶液的濃度； L光程，即溶液的厚度。Lambert-BeerLambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。 分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)可見光光度計(jì)721、721-A、722、723型分光光度計(jì)等紫外分光光度計(jì)751、752、753型分光光度計(jì)等紫外-可見分光光度計(jì)貝克曼DU500系列紫外/分光光度計(jì)吸光（消光）系數(shù)表達(dá)式吸光吸光系數(shù)系數(shù) A Aa a表示表示 a a = = C C（g/Lg/L）.L(cm).L(cm) 單位單位 L/g.cm L/g.cm摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù) A A表示表示 =

8、C = C（mol/Lmol/L）.L(cm).L(cm) 單位單位 L/L/molmol.cm.cm 百分消光系數(shù)百分消光系數(shù) A A E E 表示表示 E = E = C C（g/dlg/dl）.L(cm).L(cm) 單位是單位是d dL/(g.cm)L/(g.cm)摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù)與與百分消光系數(shù)百分消光系數(shù)的換算關(guān)系：的換算關(guān)系： = = E E * * M M（摩爾質(zhì)量）（摩爾質(zhì)量） 1010一、儀器基本組成一、儀器基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì)722型分光光度計(jì)示意圖722型分光光度計(jì)使用方法（1）預(yù)熱儀器 將選擇開關(guān)置于“T”，打開電源開

9、關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘。為了防止光 電管疲勞，不要連續(xù)光照，預(yù)熱儀器時(shí)和不測定時(shí)應(yīng)將試樣室蓋打開，使光路切 斷。（2）選定波長 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，轉(zhuǎn)動(dòng)波長手輪，調(diào)至所需要的單色波長。（3）固定靈敏度檔 在能使空白溶液很好地調(diào)到“100%”的情況下，盡可能采用靈敏度 較低的擋，使用時(shí)，首先調(diào)到“1”擋，靈敏度不夠時(shí)再逐漸升高。但換擋改變靈敏 度后，須重新校正“0%”和“100%”。選好的靈敏度，實(shí)驗(yàn)過程中不要再變動(dòng)。（4）調(diào)節(jié)T=0% 輕輕旋動(dòng)“0%”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”（此時(shí)試樣室是打開的）。（5）調(diào)節(jié)T=100% 將盛蒸餾水（或空白溶液，或純?nèi)軇┑谋壬蠓湃氡壬笞苤?的第一格內(nèi)，

10、并對(duì)準(zhǔn)光路，把試樣室蓋子輕輕蓋上，調(diào)節(jié)透過率“100%”旋鈕，使 數(shù)字顯示正好為“100.0”。（6）吸光度的測定 將選擇開關(guān)置于“A”，蓋上試樣室蓋子，將空白液置于光路中，調(diào) 節(jié)吸光度調(diào)節(jié)旋鈕，使數(shù)字顯示為“.000”。將盛有待測溶液的比色皿放入比色皿 座架中的其它格內(nèi)，蓋上試樣室蓋，輕輕拉動(dòng)試樣架拉手，使待測溶液進(jìn)入光 路，此時(shí)數(shù)字顯示值即為該待測溶液的吸光度值。讀數(shù)后，打開試樣室蓋，切斷 光路。重復(fù)上述測定操作12次，讀取相應(yīng)的吸光度值，取平均值。（7）濃度的測定 選擇開關(guān)由“A”旋置“C”，將已標(biāo)定濃度的樣品放入光路，調(diào)節(jié)濃度旋 鈕，使得數(shù)字顯示為標(biāo)定值，將被測樣品放入光路，此時(shí)數(shù)字顯

11、示值即為該待測 溶液的濃度值。（8）關(guān)機(jī) 實(shí)驗(yàn)完畢，切斷電源，將比色皿取出洗凈，并將比色皿座架用軟紙擦凈。注意事項(xiàng)（1）為了防止光電管疲勞，不測定時(shí)必須將試樣室蓋打 開，使光路切斷，以延長光電管的使用壽命。（2）取拿比色皿時(shí)，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而 不能碰比色皿的光學(xué)表面。（3）比色皿不能用堿溶液或氧化性強(qiáng)的洗滌液洗滌，也不 能用毛刷清洗。比色皿外壁附著的水或溶液應(yīng)用擦鏡 紙或細(xì)而軟的吸水紙吸干，不要擦拭，以免損傷它的 光學(xué)表面。 一、標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法步驟： （1）先配制五種以上標(biāo)準(zhǔn)濃度的）先配制五種以上標(biāo)準(zhǔn)濃度的 溶液。溶液。 （2）測出每種溶液的吸光度）測出每種溶液的吸光度A

12、。 （3）做）做AC標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖 所示。所示。 有了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線便可對(duì)溶液進(jìn)行測量。在同樣的條件下，用儀有了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線便可對(duì)溶液進(jìn)行測量。在同樣的條件下，用儀器測出器測出A后，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得被測溶液的濃度值后，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得被測溶液的濃度值Cx。A-C曲線的數(shù)學(xué)表達(dá)式：曲線的數(shù)學(xué)表達(dá)式： y=ax+by：吸光度吸光度 x：濃度濃度a：斜率斜率 b：截距截距分光光度技術(shù)的定量方法制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：（1 1）測定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)）測定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng) 重新繪制。重新繪制。（2 2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)

13、準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。（3 3）當(dāng)待測液吸光度超過線性范圍時(shí)，應(yīng)將樣本稀釋后再）當(dāng)待測液吸光度超過線性范圍時(shí)，應(yīng)將樣本稀釋后再 測定。測定。（4 4）標(biāo)本測定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。）標(biāo)本測定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。2對(duì)比法（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法）己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時(shí)測定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)測定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：

14、 Cu=(AuCu=(AuCs)/AsCs)/As其中其中CuCu和和AuAu為標(biāo)本管濃度和吸光度，為標(biāo)本管濃度和吸光度，CsCs和和AsAs分別為標(biāo)準(zhǔn)分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。和標(biāo)本管濃度相近。 火焰光度法 Na+、K+測定可采用火焰光度法。 原理：火焰光度法是一種發(fā)射光譜分析法，利用火焰中激發(fā)態(tài)原子回降至基態(tài)時(shí)發(fā)射 的光譜強(qiáng)度進(jìn)行含量分析?；鹧婀舛确ǘ筷P(guān)系 I=a c式中, I -特征譜線強(qiáng)度; c -待測物濃度; a -與元素激發(fā)電位、溫度及試樣成份有關(guān)的參數(shù);用火焰作為激發(fā)光源時(shí)

15、,因燃燒穩(wěn)定,且組份在火焰中分散度好,此時(shí)a為常數(shù); b -自吸情況參數(shù),當(dāng)C很低時(shí),b=1。此時(shí), 自吸現(xiàn)象可忽略，則:I=a c該法可檢測血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，該方法屬于經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)參法， 優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果準(zhǔn)確可靠，廣為臨床采用醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。 通常采用的定量方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)加入法和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法。 內(nèi)標(biāo)法：標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液采用加進(jìn)相同濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素進(jìn)行測定，一般是加入鋰內(nèi) 標(biāo)，測定的是鋰/鈉或鋰/鉀電流的比值，而不是單獨(dú)的鈉或鉀的電流，這樣， 可減小燃?xì)夂突鹧鏈囟炔▌?dòng)等因素引起的誤差，因而有較好的準(zhǔn)確性。比濁分析法比濁分析法（濁度法），屬于散射光譜分析。原理：當(dāng)光線通過一

16、個(gè)渾濁介質(zhì)溶液時(shí)，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分， 吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測定光吸收量的方法稱為比濁分析法臨床應(yīng)用：最多是免疫比濁法利用抗原抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物，通過測定復(fù)合物形成量的多少，對(duì)抗原抗體進(jìn)行定量的方法。特點(diǎn)：（1）要有特異性的抗體 （2）抗原抗體的比例要適當(dāng) （3）溶液介質(zhì)的PH、離子強(qiáng)度等要適宜。影響因素：1.懸濁液的散射光強(qiáng)度主要和顆粒的數(shù)量有關(guān)2.注意掌握反應(yīng)溫度3.溶液的PH值可影響沉淀的形成及顆粒的大小4.懸濁液的穩(wěn)定性較差，需及時(shí)比濁5.稀釋緩沖液中的電解質(zhì)與非電解質(zhì)對(duì)免疫復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性有影響6.適當(dāng)選擇濾光片或入射光波長原子吸收分

17、光光度法 原理: 又稱原子吸收分光光度法是基于蒸汽相中待測元素的基態(tài)原子對(duì)其共振輻射的吸收強(qiáng)度來測定試樣中該元素含量的一種儀器分析方法。它是測定痕量和超痕量元素的有效方法。 特點(diǎn)： 具有靈敏度高、干擾較少、選擇性好、操作簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、應(yīng)用范圍廣、儀器比較簡單、價(jià)格較低廉等優(yōu)點(diǎn)，而且可以使整個(gè)操作自動(dòng)化，因此近年來發(fā)展迅速，是應(yīng)用廣泛的一種儀器分析新技術(shù)。 方法： 在溫度吸收光程，進(jìn)樣方式等實(shí)驗(yàn)條件固定時(shí)，樣品產(chǎn)生的待測元素相基態(tài)原子對(duì)作為銳線光源的該元素的空心陰極燈所輻射的單色光產(chǎn)生吸收，其吸光度（A）與樣品中該元素的濃度（C）成正比。即 A=KC 式中，K為常數(shù)。據(jù)此，通過測量

18、標(biāo)準(zhǔn)溶液及未知溶液的吸光度，又巳知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，可作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得未知液中待測元素濃度。 應(yīng)用： 主要適用樣品中微量及痕量組分分析。熒光分析法定義： 利用某些物質(zhì)被紫外光照射后所發(fā)生的能反映出該物質(zhì)特性的熒光，可以 進(jìn)行定性或定量分析的方法。原理： 物質(zhì)的分子吸收紫外光或可見光后，由電子基態(tài)能級(jí)躍遷至激發(fā)態(tài)能級(jí)。 處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，通過各種方式失去能量，返回基態(tài)。若分子首 先通過碰撞和系統(tǒng)內(nèi)轉(zhuǎn)換等方式失去部分能量，下降至電子第一激發(fā)態(tài)的 最低振動(dòng)能級(jí)，然后再發(fā)射一定波長的光返回電子基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)， 則被發(fā)射的光稱為熒光。顯然，熒光的能量小于激發(fā)光能量，波長則長于 激發(fā)光。熒光的平均壽命很