微生物學(xué)_09b微生物與基因工程

1、第九章第九章 微生物與基因工程微生物與基因工程基因工程技術(shù)基因工程技術(shù)基因工程（基因工程（genetic engineering)：把分離到的或：把分離到的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而得到大量基因產(chǎn)物，胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而得到大量基因產(chǎn)物，或令生物表現(xiàn)出新的形狀?；蛄钌锉憩F(xiàn)出新的形狀?；蚬こ檀笫掠浕蚬こ檀笫掠?973 Cohen1973 Cohen和和BoyerBoyer第一次將重組體第一次將重組體DNADNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了實(shí)現(xiàn)了DNADNA的分子克隆的分子克隆; ;1978 G

2、enentech1978 Genentech公司公司-人胰島素人胰島素-世界上第一種基因世界上第一種基因工程蛋白藥物工程蛋白藥物 1982 1982 第一個基因工程藥物第一個基因工程藥物-重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用使用 1985 1985 第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國 轉(zhuǎn)基轉(zhuǎn)基因魚因魚 1993 1993 基因工程西紅柿在美國上市基因工程西紅柿在美國上市1997 英國羅斯林研究所英國羅斯林研究所-克隆羊多莉克隆羊多莉1999.9 中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計劃中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計劃, 負(fù)責(zé)測定負(fù)責(zé)測定人類基因組全部序列的人類

3、基因組全部序列的1%2000.6.26 科學(xué)家公布人類基因組工作草圖科學(xué)家公布人類基因組工作草圖2001.2.11 公布人類基因組基本信息公布人類基因組基本信息9.1 基因工程概述基因工程概述三項(xiàng)重要技術(shù)為基因工程奠定了基礎(chǔ)三項(xiàng)重要技術(shù)為基因工程奠定了基礎(chǔ):1967-1970年年R.Yuan和和H.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切限制性核酸內(nèi)切酶酶為基因工程提供了有力的工具；為基因工程提供了有力的工具；1972年年Berg等將等將SV-40病毒病毒DNA與噬菌體與噬菌體P22DNA在體外在體外重組重組成功；成功；1973年年Cohen和和Boyer第一次將重組體第一次將重組體DNA

4、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了化大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了DNA的分子克隆的分子克隆; 1977年年Boyer等首先等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽；肽；1975-1977年年Sanger、Maxam和和Gilbert先后發(fā)明了三種先后發(fā)明了三種DNA序列的快速測定法序列的快速測定法；90年代全自動核酸測序儀問世；年代全自動核酸測序儀問世；一、基因工程基本過程一、基因工程基本過程1、目的基因的提?。悍蛛x或合成外源基因。、目的基因的提取：分離或合成外源基因。2、體外重組：

5、外源基因與載體體外連接，構(gòu)建重、體外重組：外源基因與載體體外連接，構(gòu)建重組組DNA分子；分子；3、轉(zhuǎn)化：重組、轉(zhuǎn)化：重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞。分子導(dǎo)入細(xì)胞。4、擴(kuò)增該克隆、擴(kuò)增該克隆DNA。5、篩選與鑒定；、篩選與鑒定；6、基因表達(dá)：控制適當(dāng)條件，外源、基因表達(dá)：控制適當(dāng)條件，外源DNA表達(dá)。表達(dá)。7. 獲得表達(dá)產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物。獲得表達(dá)產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物。一切基因工程操作都離不開微生物一切基因工程操作都離不開微生物1、基因工程所用克隆載體主要是用病毒、噬菌體和質(zhì)粒改造、基因工程所用克隆載體主要是用病毒、噬菌體和質(zhì)粒改造而成的。而成的。2、基因工程所用千余種工具酶是從微生物

6、中得到的。、基因工程所用千余種工具酶是從微生物中得到的。3、微生物細(xì)胞是基因克隆的宿主。、微生物細(xì)胞是基因克隆的宿主。4、大規(guī)模表達(dá)基因產(chǎn)物，構(gòu)建工程菌，利用工廠發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)。、大規(guī)模表達(dá)基因產(chǎn)物，構(gòu)建工程菌，利用工廠發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)。5、提供基因資源（抗高溫、高鹽、高堿、低溫等特性）。、提供基因資源（抗高溫、高鹽、高堿、低溫等特性）。6、模式生物提供基礎(chǔ)理論。、模式生物提供基礎(chǔ)理論。二、微生物與基因工程關(guān)系二、微生物與基因工程關(guān)系9.2 微生物與克隆載體微生物與克隆載體載體載體：克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體：克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體克隆載體克隆載體：外源：外源DNA片段進(jìn)行克隆，需要一個合適片段

7、進(jìn)行克隆，需要一個合適的載體，將其運(yùn)送到細(xì)胞中并進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增。這的載體，將其運(yùn)送到細(xì)胞中并進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增。這種以擴(kuò)增外源種以擴(kuò)增外源DNA為目的載體，稱為為目的載體，稱為克隆載體克隆載體?？寺≥d體應(yīng)具備的性質(zhì)克隆載體應(yīng)具備的性質(zhì)1、可獨(dú)立自主復(fù)制，具備復(fù)制原點(diǎn)；、可獨(dú)立自主復(fù)制，具備復(fù)制原點(diǎn)；2、具有若干限制酶單一切割位點(diǎn)，且位于載體復(fù)制、具有若干限制酶單一切割位點(diǎn)，且位于載體復(fù)制的非必需區(qū)，以便插入外源基因后不影響復(fù)制。的非必需區(qū)，以便插入外源基因后不影響復(fù)制。3、有可供選擇的遺傳標(biāo)記（抗性基因、顯色反應(yīng)），、有可供選擇的遺傳標(biāo)記（抗性基因、顯色反應(yīng)），以便于對陽性克隆的鑒別和篩選。以便于

8、對陽性克隆的鑒別和篩選。目前克隆載體種類目前克隆載體種類質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體噬菌體載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體M13噬菌體載體噬菌體載體真核細(xì)胞的克隆載體真核細(xì)胞的克隆載體人工染色體。人工染色體。一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體1、特點(diǎn)：、特點(diǎn)：（1）具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn)；）具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn)；（2）具有較小的相對分子質(zhì)量。）具有較小的相對分子質(zhì)量。1200kb，外源，外源DNA15kb；（3）具有較高拷貝數(shù)，多為松馳控制型。人為增加拷貝數(shù)可用終）具有較高拷貝數(shù)，多為松馳控制型。人為增加拷貝數(shù)可用終濃度濃度1020g/ml，氯霉素停止細(xì)胞蛋白合成，宿主，氯霉素停止細(xì)胞蛋白合成，宿主DNA合成合成終止，

9、質(zhì)粒復(fù)制正常進(jìn)行，可達(dá)數(shù)千個拷貝；終止，質(zhì)粒復(fù)制正常進(jìn)行，可達(dá)數(shù)千個拷貝；（4）具有便于選擇的標(biāo)記；）具有便于選擇的標(biāo)記；（5）易于導(dǎo)入細(xì)胞，質(zhì)?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化和電穿孔等方法導(dǎo)入細(xì)胞；）易于導(dǎo)入細(xì)胞，質(zhì)?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化和電穿孔等方法導(dǎo)入細(xì)胞；（6）具有安全性。）具有安全性。pBR322的結(jié)構(gòu)特征環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA分子，由分子，由4361bp組成，松馳型組成，松馳型;colE復(fù)制起點(diǎn)，外源復(fù)制起點(diǎn)，外源DNA大小為大小為5kb左右左右;四環(huán)素抗性基因（四環(huán)素抗性基因（Tetr）、氨芐青霉素抗性基因）、氨芐青霉素抗性基因（Ampr）;24單一酶切位點(diǎn)（單一酶切位點(diǎn)（ Tetr中中7個，個， Ampr中

10、中3個）。個）。插入失活篩選轉(zhuǎn)化子 插入失活插入失活：pBR322抗生素抗性基因內(nèi)有許多單一切點(diǎn)的抗生素抗性基因內(nèi)有許多單一切點(diǎn)的限制性位點(diǎn)，可以用來切開分子，插入新的限制性位點(diǎn)，可以用來切開分子，插入新的DNA片段，新片段，新DNA片段的插入將導(dǎo)致相應(yīng)抗性基因的失活，這種現(xiàn)象片段的插入將導(dǎo)致相應(yīng)抗性基因的失活，這種現(xiàn)象稱稱如如BamHI可以從四環(huán)素位點(diǎn)切開，使該基因不能表達(dá)，對可以從四環(huán)素位點(diǎn)切開，使該基因不能表達(dá)，對四環(huán)素是敏感的，但仍能表達(dá)氨芐抗性基因。四環(huán)素是敏感的，但仍能表達(dá)氨芐抗性基因。篩選重組篩選重組pBR322 按照以下方法進(jìn)行，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)于按照以下方法進(jìn)行，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)

11、于氨芐培養(yǎng)基中，只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以生長形成克隆，影印到氨芐培養(yǎng)基中，只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以生長形成克隆，影印到四環(huán)素培養(yǎng)基上，不能在該培養(yǎng)基上生長的菌落可能就是四環(huán)素培養(yǎng)基上，不能在該培養(yǎng)基上生長的菌落可能就是目的克隆。目的克隆。pUC質(zhì)粒載體一個復(fù)制起始位點(diǎn)一個復(fù)制起始位點(diǎn)具有更小的分子量：具有更小的分子量：2.8kb更高的拷貝數(shù)，每個細(xì)胞大約更高的拷貝數(shù)，每個細(xì)胞大約500各拷貝各拷貝具有多克隆位點(diǎn)具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段區(qū)段攜帶了氨卞青霉素抗性基因（攜帶了氨卞青霉素抗性基因（ampR）多克隆位點(diǎn)區(qū)位于多克隆位點(diǎn)區(qū)位于lacZ基因中，在此位點(diǎn)上插入外源基因會基因中，在此位點(diǎn)上插入外源基因會導(dǎo)致導(dǎo)致

12、lacZ基因失活，可利用基因失活，可利用藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選重組子重組子 。質(zhì)粒的不足（1）外源）外源DNA15kb。（2）轉(zhuǎn)化效率低，約）轉(zhuǎn)化效率低，約0.1的轉(zhuǎn)化率。的轉(zhuǎn)化率。二、二、噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體噬菌體的優(yōu)點(diǎn)：噬菌體的優(yōu)點(diǎn)：（1）遺傳背景清楚；）遺傳背景清楚；（2）容納外源）容納外源DNA23kb。（3）高感染率）高感染率100%，體外包裝上外殼蛋白。，體外包裝上外殼蛋白。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：DNA分子很大；限制酶有很多切點(diǎn)，且多位分子很大；限制酶有很多切點(diǎn)，且多位于必需基因內(nèi)。于必需基因內(nèi)。噬菌體克隆載體的構(gòu)建a、縮短長度、縮短長度野生型野生型DNA包裝的上限為包裝的上限為50.

13、5kb，本身，本身長度為長度為48.5kb，插入片段至多為，插入片段至多為2.0kb，如果將其縮短便能夠提高裝載量。如果將其縮短便能夠提高裝載量。I 插入型載體經(jīng)改造后的長度為經(jīng)改造后的長度為37kb，為包裝的下限，為包裝的下限，插入片段最大為插入片段最大為13.5kb（50.5-37kb）由于該類載體重組與否均可包裝，因而為由于該類載體重組與否均可包裝，因而為區(qū)分組子與非重組子必須攜帶標(biāo)記基因。區(qū)分組子與非重組子必須攜帶標(biāo)記基因。II 取代型載體經(jīng)改造后的長度約為經(jīng)改造后的長度約為40kb，含兩個酶切口，兩者，含兩個酶切口，兩者間的距離為間的距離為14kb，然后用外源，然后用外源DNA片段取

14、代之。片段取代之。包裝下限為包裝下限為37kb，這類載體不需要標(biāo)記基因，因?yàn)榭蛰d的載體這類載體不需要標(biāo)記基因，因?yàn)榭蛰d的載體DNA只有只有26kb，不可能被包裝，因而無法進(jìn)入受體細(xì)，不可能被包裝，因而無法進(jìn)入受體細(xì)胞中去。胞中去。b 刪除重復(fù)的酶切口插入型載體在插入位點(diǎn)有一酶切口，但這必須是插入型載體在插入位點(diǎn)有一酶切口，但這必須是唯一的；取代型載體在取代位點(diǎn)有兩個酶切口，唯一的；取代型載體在取代位點(diǎn)有兩個酶切口，多了也不行，而天然的多了也不行，而天然的DNA上有許多重復(fù)的酶切上有許多重復(fù)的酶切口，如：口，如：EcoRI 5個，個，HindIII 7個，這些多余的酶個，這些多余的酶切口必須被刪

15、除切口必須被刪除噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)可在體外包裝成噬菌體，高效感染大腸桿菌可在體外包裝成噬菌體，高效感染大腸桿菌裝載外源裝載外源DNA的量大（的量大（23kb）重組重組-DNA的篩選提取方便的篩選提取方便噬菌體載體常用于構(gòu)建基因文庫。噬菌體載體常用于構(gòu)建基因文庫?？滤官|(zhì)粒載體（COS載體，粘粒載體）考斯質(zhì)粒是含考斯質(zhì)粒是含有有-DNA兩兩端端cos區(qū)的質(zhì)區(qū)的質(zhì)粒?？妓官|(zhì)粒的構(gòu)建由于由于 -DNA包裝蛋白只識別粘性末端的一小段順包裝蛋白只識別粘性末端的一小段順序序cos區(qū)。將這段區(qū)。將這段DNA與質(zhì)粒連在一起，構(gòu)建的與質(zhì)粒連在一起，構(gòu)建的重組質(zhì)重組質(zhì) 粒，可裝載外源粒，可裝載外源DNA（45.5kb

16、)，它仍可，它仍可象象-DNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體，進(jìn)入細(xì)胞后，要通過質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行菌體，進(jìn)入細(xì)胞后，要通過質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制。復(fù)制?？妓官|(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)能象能象-DNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞細(xì)胞可以裝載更大的外源可以裝載更大的外源DNA片段，可裝片段，可裝載載45.5kb。攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選有質(zhì)粒上的多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆。有質(zhì)粒上的多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆。M13噬菌體載體1、 M13 噬菌體基本特點(diǎn)：噬菌體基本特點(diǎn)：（1） M13 噬菌體顆粒是絲狀的，只

17、感染雄性大腸桿菌。感染噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長和分裂；顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長和分裂；（2） M13 噬菌體的基因組為單鏈?zhǔn)删w的基因組為單鏈 DNA ，由，由 6407 的堿基組的堿基組成成 ；（3）在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删w）在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删w DNA （正鏈）在宿（正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈 DNA ，用于，用于 DNA 的復(fù)制，的復(fù)制，因此這種雙鏈因此這種雙鏈 DNA 稱為復(fù)制型稱

18、為復(fù)制型 DNA （replicative form DNA） ，即，即 RF DNA ；M13噬菌體的改造 野生型野生型M13不適于作為克隆載體，因此人們對野生不適于作為克隆載體，因此人們對野生型型M13進(jìn)行了改造，構(gòu)建了一系列進(jìn)行了改造，構(gòu)建了一系列M13克隆載體?？寺≥d體。 在在M13基因組中，除基因間隔區(qū)（基因組中，除基因間隔區(qū)（IG）外，其他）外，其他均為復(fù)制和組裝所必需的基因。均為復(fù)制和組裝所必需的基因。 外源外源DNA插入插入IG區(qū)，可不影響區(qū)，可不影響M13活動，因此對活動，因此對野生型野生型M13的改造主要在的改造主要在IG區(qū)中進(jìn)行。區(qū)中進(jìn)行。 插入半乳糖苷酶選擇標(biāo)記在在IG

19、區(qū)中插入?yún)^(qū)中插入半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端一小段編碼序列及端一小段編碼序列及其調(diào)控序列，該序列編碼其調(diào)控序列，該序列編碼半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的肽，肽，肽可與大腸桿菌肽可與大腸桿菌LacZ突變基因突變基因 M15進(jìn)行進(jìn)行互補(bǔ)，互補(bǔ)，產(chǎn)生具有活性的產(chǎn)生具有活性的半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。若將若將M13和宿主細(xì)胞涂布在含有異丙基硫代和宿主細(xì)胞涂布在含有異丙基硫代-D-半乳糖苷半乳糖苷(IPTG)和呈色物質(zhì)和呈色物質(zhì)5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷(Xgal)培養(yǎng)基的平板上時，可形成藍(lán)色培養(yǎng)基的平板上時，可形成藍(lán)色噬菌斑。噬菌斑。 插入一小段多克隆位點(diǎn)區(qū)在在肽的編碼區(qū)內(nèi)插入一小段密

20、集限制酶單一位點(diǎn)肽的編碼區(qū)內(nèi)插入一小段密集限制酶單一位點(diǎn)的的DNA片段，當(dāng)外源片段，當(dāng)外源DNA插入到這一區(qū)段，則會插入到這一區(qū)段，則會破壞破壞互補(bǔ)作用。這時若將互補(bǔ)作用。這時若將M13（含外源（含外源DNA）和）和宿主細(xì)胞涂布在含有宿主細(xì)胞涂布在含有IPTG和和Xgal培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)基的平板上，則形成無色噬菌斑。上，則形成無色噬菌斑。M13載體克隆外源載體克隆外源DNA的能力較小，一般只適的能力較小，一般只適于克隆于克隆300400bp的外源的外源DNA片段；片段；它的突出優(yōu)點(diǎn)是，特別適合用于制備克隆基因它的突出優(yōu)點(diǎn)是，特別適合用于制備克隆基因的單鏈的單鏈DNA。因此，它主要被用于制備測序

21、用。因此，它主要被用于制備測序用單鏈單鏈DNA模板、特異的單鏈模板、特異的單鏈DNA探針，定位探針，定位誘變等。誘變等。表9-1 幾類大腸桿菌克隆載體比較載體類型載體類型 克隆外源克隆外源DNA片段片段大小大小 主要用途主要用途 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 15kb 克隆和表達(dá)外源基因；克隆和表達(dá)外源基因；DNA測序測序 噬菌體載噬菌體載體體 23kb 構(gòu)建基因文庫和構(gòu)建基因文庫和cDNA文庫文庫 柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒載體載體 45kb 構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫 M13載體載體 300400bp 制備單鏈制備單鏈DNA；定位誘變；定位誘變；噬菌體展示噬菌體展示 三、真核生物的克隆載體三、真核生物的克隆載體1

22、.酵母質(zhì)粒載體酵母質(zhì)粒載體酵母質(zhì)粒載體都是利用其酵母質(zhì)粒載體都是利用其2m質(zhì)粒和其酵母染質(zhì)粒和其酵母染色體組分與細(xì)菌質(zhì)粒色體組分與細(xì)菌質(zhì)粒pBR322構(gòu)建而成的。可構(gòu)建而成的。可分別在細(xì)菌、酵母中復(fù)制，又稱穿梭質(zhì)粒。分別在細(xì)菌、酵母中復(fù)制，又稱穿梭質(zhì)粒。主要有三種：附加體質(zhì)粒、主要有三種：附加體質(zhì)粒、復(fù)制質(zhì)粒、整合質(zhì)粒復(fù)制質(zhì)粒、整合質(zhì)粒（1）附加體質(zhì)粒（episomal plasmid） 結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：pBR322的復(fù)制起點(diǎn)、的復(fù)制起點(diǎn)、Ampr（氨芐（氨芐青霉素抗性基因）；青霉素抗性基因）；2m的復(fù)制起點(diǎn)；酵的復(fù)制起點(diǎn)；酵母選擇標(biāo)記的母選擇標(biāo)記的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合基因（尿嘧啶核苷酸合

23、成酶基因成酶基因3）。）。 細(xì)胞中拷貝數(shù)：酵母中高拷貝數(shù)。細(xì)胞中拷貝數(shù)：酵母中高拷貝數(shù)。（2）復(fù)制質(zhì)粒含有：來自細(xì)菌質(zhì)粒含有：來自細(xì)菌質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因（霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）。來自酵母染色體的自主復(fù)制序列）。來自酵母染色體的自主復(fù)制序列（ARS）；作為酵母選擇標(biāo)記的）；作為酵母選擇標(biāo)記的URA3基因和基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因基因（色氨酸合成酶基因1）。）。這種質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，能在大腸桿菌或酵母細(xì)胞中這種質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，能在大腸桿菌或酵母細(xì)胞中復(fù)制，重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞中可獲得中等拷貝數(shù)復(fù)

24、制，重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞中可獲得中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒。的質(zhì)粒。（3）整合質(zhì)粒含有：來自含有：來自pBR322的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青霉素抗的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因（性基因（Ampr）、四環(huán)素抗性基因（）、四環(huán)素抗性基因（Tetr）。來）。來自酵母的自酵母的URA3基因；它既可以作為酵母細(xì)胞的基因；它既可以作為酵母細(xì)胞的選擇標(biāo)記，也可與酵母染色體選擇標(biāo)記，也可與酵母染色體DNA進(jìn)行同源重組。進(jìn)行同源重組。這種質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中復(fù)制，但不能在酵母細(xì)這種質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中復(fù)制，但不能在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制。一旦導(dǎo)入酵母細(xì)胞，可整合胞中進(jìn)行自主復(fù)制。一旦導(dǎo)入酵母細(xì)胞，可整合到酵母染色體上，成為染色體到酵

25、母染色體上，成為染色體DNA的一個片段。的一個片段。2.真核生物病毒載體（1）哺乳動物病毒載體：目前利用許多哺乳動物?。┎溉閯游锊《据d體：目前利用許多哺乳動物病毒如毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等，腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等改造后的衍生物作為基因載體。改造后的衍生物作為基因載體。（2）昆蟲病毒載體：主要為高克隆容量（）昆蟲病毒載體：主要為高克隆容量（100kb）；）；其次具有高表達(dá)效率（其次具有高表達(dá)效率（25）；安全，僅感染）；安全，僅感染無脊椎動物；無脊椎動物；（3）植物病毒載體）植物病毒載體四、人工染色體四、人工染色體酵母人工染色體（酵母人工染色體（YAC）：能容納最大外

26、源）：能容納最大外源DNA片段。片段。1、組成：著絲粒（、組成：著絲粒（centromere，CEN）、端粒（）、端粒（telomere， TEL）、酵母自主復(fù)制序列（）、酵母自主復(fù)制序列（ARS）、選擇性標(biāo)記（如）、選擇性標(biāo)記（如URA3）。）。2、功能：大片段克?。?、功能：大片段克隆（100萬萬bp），多用于真核生物基因庫的載），多用于真核生物基因庫的載體。體。3、相關(guān)：細(xì)菌人工染色體（、相關(guān)：細(xì)菌人工染色體（BAC）。）。常用工具酶種類常用工具酶種類 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 把DNA長鏈切割為短的片段 連接酶連接酶 將2段DNA片段拼接起來 聚合酶聚合酶 催化合成形成核酸鏈 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶

27、片段末端加接多聚核苷酸 核酸酶核酸酶 水解酶，非專一性 反向轉(zhuǎn)錄酶反向轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶9.3 微生物與基因工程工具酶微生物與基因工程工具酶一、限制性內(nèi)切酶一、限制性內(nèi)切酶 1、限制性內(nèi)切酶的定義、限制性內(nèi)切酶的定義 是指已被證明是限制修飾系統(tǒng)中的一個組成部是指已被證明是限制修飾系統(tǒng)中的一個組成部分，具有識別雙鏈分，具有識別雙鏈DNA分子中的某種分子中的某種特定核酸特定核酸序列序列并由此切割并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的酶統(tǒng)稱為雙鏈結(jié)構(gòu)的酶統(tǒng)稱為限制限制性內(nèi)切酶。性內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) Luria和和Human發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將外來的發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將外來的DNA片段在某片段在某些專一位點(diǎn)上切斷，從而保證

28、其不被外來噬菌體所些專一位點(diǎn)上切斷，從而保證其不被外來噬菌體所感染，而其自身的感染，而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾由于被一種特殊的酶所修飾（甲基化）而得以保護(hù)，這種現(xiàn)象叫做（甲基化）而得以保護(hù)，這種現(xiàn)象叫做限制修飾限制修飾。Smith和和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到一種酶，從流感嗜血桿菌中分離到一種酶，能夠特異性的切割能夠特異性的切割DNA，這個酶被命名為，這個酶被命名為Hind I,這這是第一個分離到的限制性內(nèi)切核酸酶。是第一個分離到的限制性內(nèi)切核酸酶。3、限制性核酸內(nèi)切酶的命名 按酶來源菌的屬、種名而定，取屬名的第一個字按酶來源菌的屬、種名而定，取屬名的第一個字母與種名的頭

29、兩個字母組成的三個斜體字母作略母與種名的頭兩個字母組成的三個斜體字母作略語表示；如有株名，再加上一個字母，其后再按語表示；如有株名，再加上一個字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌例如：從流感嗜血桿菌d株（株（Haemophilus influenzae d）中先后分離到）中先后分離到3種限制酶，則分別種限制酶，則分別命名為命名為Hind、Hind和和Hind。4、限制性內(nèi)切酶的類型 限制性內(nèi)切酶可分為三大類型：限制性內(nèi)切酶可分為三大類型：類型類型I和類型和類型III ：由于識別位點(diǎn)并非嚴(yán)格專一，很少：由于識別位點(diǎn)并非嚴(yán)格專一，很少被應(yīng)用。被應(yīng)用。類

30、型類型II的特點(diǎn)的特點(diǎn): 識別位點(diǎn)嚴(yán)格專一；識別序列的堿基識別位點(diǎn)嚴(yán)格專一；識別序列的堿基數(shù)一般為數(shù)一般為4、6、8個個bp；識別位點(diǎn)經(jīng)常是一種回；識別位點(diǎn)經(jīng)常是一種回文序列的文序列的DNA；是；是DNA重組技術(shù)最為常用的工具重組技術(shù)最為常用的工具酶。酶。寡核苷酸順序具有二沖旋轉(zhuǎn)對稱軸，又稱為寡核苷酸順序具有二沖旋轉(zhuǎn)對稱軸，又稱為回文順序回文順序（palindromic sequence） GAA TTC CTT AAG也有一些對稱順序被一個或幾個非特定的核也有一些對稱順序被一個或幾個非特定的核苷酸間隔開。苷酸間隔開。N-四種均可四種均可 Py-嘧啶嘧啶 Pu-嘌呤嘌呤如如GTPyPuAC H

31、ind I6、限制性內(nèi)切酶的切割方式就切割位點(diǎn)相對于對稱軸的位置而言就切割位點(diǎn)相對于對稱軸的位置而言,切割方式有切割方式有三種三種:在對稱軸在對稱軸5 側(cè)切割產(chǎn)生側(cè)切割產(chǎn)生5 粘端粘端在對稱軸在對稱軸3 側(cè)切割產(chǎn)生側(cè)切割產(chǎn)生3 粘端粘端在對稱軸處切割產(chǎn)生平在對稱軸處切割產(chǎn)生平二、二、DNA連接酶連接酶配對的堿基產(chǎn)生的氫鍵還不足以把兩個配對的堿基產(chǎn)生的氫鍵還不足以把兩個DNA分子分子拴在一起，還需要通過拴在一起，還需要通過DNA連接酶在連接酶在3羥基和羥基和5磷磷酸基團(tuán)之間形成新的酸基團(tuán)之間形成新的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵。大多數(shù)大多數(shù)DNA連接酶都是從連接酶都是從T4噬菌體中分離出來的，噬菌體中分

32、離出來的，它可以催化在兩條它可以催化在兩條DNA鏈的末端形成磷酸二酯鍵，鏈的末端形成磷酸二酯鍵，包括粘性末端堿基配對的兩條包括粘性末端堿基配對的兩條DNA鏈和末端都是鏈和末端都是平末端的兩條平末端的兩條DNA鏈鏈其它常用工具酶3. Tag DNA聚合酶：是一種耐熱的依賴聚合酶：是一種耐熱的依賴于于DNA的的DNA聚合酶，具有聚合酶，具有5 3聚聚合酶活性，該酶最適反應(yīng)溫度為合酶活性，該酶最適反應(yīng)溫度為7580 ，主要用途是進(jìn)行，主要用途是進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)。4. 逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的的DNA聚合酶）聚合酶）主要作用是將主要作用是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成cDNA（二）堿性

33、磷酸酶其作用是去除其作用是去除DNA、RNA的的5磷酸根（磷酸根（ 5-P），以防自身環(huán)化；另外在用），以防自身環(huán)化；另外在用32P標(biāo)記標(biāo)記5末末端前，可先用其去除端前，可先用其去除DNA或或RNA上的上的5- P（三）核酸酶S1核酸酶：主要用于去除核酸酶：主要用于去除DNA片段粘末端而產(chǎn)生片段粘末端而產(chǎn)生平端；打開平端；打開cDNA中發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使其成平端。中發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使其成平端。核糖核酸酶（核糖核酸酶（RNaseA)：在質(zhì)粒提取時降解：在質(zhì)粒提取時降解RNA；從從DNA-RNA雜交體中去除未雜交的雜交體中去除未雜交的RNA區(qū)。區(qū)。9.4 微生物作為克隆載體的宿主微生物作為克隆載體的宿主一、宿

34、主的基本要求與性質(zhì)一、宿主的基本要求與性質(zhì)1、能夠高效吸收外源、能夠高效吸收外源DNA；2、具有使外源、具有使外源DNA進(jìn)行高效復(fù)制的酶系統(tǒng)；進(jìn)行高效復(fù)制的酶系統(tǒng)；3、不具有限制修飾系統(tǒng)，故不會使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修、不具有限制修飾系統(tǒng)，故不會使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源飾的外源DNA發(fā)生降解；發(fā)生降解；4、一般為重組缺陷型（、一般為重組缺陷型（RecA-）菌株，使克隆載體）菌株，使克隆載體DNA與與宿主染色體宿主染色體DNA之間不發(fā)生同源重組；之間不發(fā)生同源重組；5、便于進(jìn)行基因操作和篩選；、便于進(jìn)行基因操作和篩選；6、具有安全性。、具有安全性。二、原核生物宿主二、原核生物宿主1、首先應(yīng)根

35、據(jù)克隆載體性質(zhì)以及它們導(dǎo)入細(xì)胞的方式選擇相、首先應(yīng)根據(jù)克隆載體性質(zhì)以及它們導(dǎo)入細(xì)胞的方式選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞：應(yīng)的宿主細(xì)胞：噬菌體載體噬菌體載體E.coli k12菌株、菌株、M13含含有有F因子的雄性大腸桿菌。因子的雄性大腸桿菌。2、其次為了便于陽性克隆的篩選，作為克隆宿主的基因型應(yīng)、其次為了便于陽性克隆的篩選，作為克隆宿主的基因型應(yīng)與載體基因相對應(yīng)。與載體基因相對應(yīng)。3. 最后為了安全目的，需嚴(yán)格限制載體的宿主范圍，以達(dá)到最后為了安全目的，需嚴(yán)格限制載體的宿主范圍，以達(dá)到盡量避免重組體從實(shí)驗(yàn)室逃逸出去。盡量避免重組體從實(shí)驗(yàn)室逃逸出去。三、真核生物宿主（釀酒酵母）三、真核生物宿主（釀酒酵母）利

36、用真核生物作為克隆載體宿主具有兩個重要意義。利用真核生物作為克隆載體宿主具有兩個重要意義。第一，它促進(jìn)了對真核生物復(fù)雜基因組及其基因調(diào)第一，它促進(jìn)了對真核生物復(fù)雜基因組及其基因調(diào)控的研究；控的研究；第二，它有利于真核基因產(chǎn)物的翻譯后加工。第二，它有利于真核基因產(chǎn)物的翻譯后加工。釀酒酵母是一種理想的真核生物克隆載體宿主。釀酒酵母是一種理想的真核生物克隆載體宿主。四、外源基因?qū)胨拗魉?、外源基因?qū)胨拗?、外源、外源DNA導(dǎo)入導(dǎo)入原核細(xì)胞導(dǎo)入導(dǎo)入原核細(xì)胞（1）轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染：外源）轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染：外源DNA以重組質(zhì)粒載體形式存在，則可以重組質(zhì)粒載體形式存在，則可通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入原核細(xì)胞；外源通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入原核細(xì)

37、胞；外源 DNA構(gòu)建成重組噬菌體構(gòu)建成重組噬菌體DNA或或重組噬菌質(zhì)粒，則可通過轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入重組噬菌質(zhì)粒，則可通過轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入 宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞：用氯化鈣處理宿主細(xì)胞，使細(xì)胞變得易于吸引外感受態(tài)細(xì)胞：用氯化鈣處理宿主細(xì)胞，使細(xì)胞變得易于吸引外源源DNA。（2）DNA的侵染（體外包裝轉(zhuǎn)染技術(shù)）的侵染（體外包裝轉(zhuǎn)染技術(shù)）體外包裝（將重組體外包裝（將重組DNA分子與分子與噬菌體的頭部、尾部以及有關(guān)噬菌體的頭部、尾部以及有關(guān)包裝蛋白混合，組裝成具感染力的包裝蛋白混合，組裝成具感染力的噬菌體粒子）感染宿主。噬菌體粒子）感染宿主。較轉(zhuǎn)染效率要高出較轉(zhuǎn)染效率要高出104105倍。倍。2、外源、

38、外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞導(dǎo)入真核細(xì)胞（1）外源）外源DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞導(dǎo)入酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體蝸牛酶蝸牛酶CaCl2和聚乙二醇和聚乙二醇復(fù)合體（含復(fù)合體（含DNA的原生質(zhì)體）的原生質(zhì)體）長出有壁細(xì)胞長出有壁細(xì)胞再生培養(yǎng)基中再生培養(yǎng)基中（2）外源）外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞 其中最簡便的是微量注射法和電穿孔法。其中最簡便的是微量注射法和電穿孔法。（3）外）外DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞：導(dǎo)入植物細(xì)胞： 除了微量注射法及電除了微量注射法及電穿孔法可將外源穿孔法可將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞外。導(dǎo)入植物細(xì)胞外。 還有兩種方法，一種是基因槍法或稱微彈槍法；還有兩種方法，一種是基因槍

39、法或稱微彈槍法；另一種是將含有重組另一種是將含有重組Ti質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與植物質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)（即共培養(yǎng)法）或與植物葉片培原生質(zhì)體共培養(yǎng)（即共培養(yǎng)法）或與植物葉片培養(yǎng)（即葉片培養(yǎng)法）。養(yǎng)（即葉片培養(yǎng)法）。五、基因文庫與五、基因文庫與cDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建利用重組利用重組DNA技術(shù)，可將某一原核生物或真核生技術(shù)，可將某一原核生物或真核生物染色體基因組的全部遺傳信息，貯存在由重組物染色體基因組的全部遺傳信息，貯存在由重組體群體（如重組噬菌體群體）構(gòu)成的基因文庫體群體（如重組噬菌體群體）構(gòu)成的基因文庫(genomic library)或或cDNA文庫文庫(cDNA li

40、brary)1. 基因文庫的構(gòu)建所謂基因文庫是指生物染色體基因組各所謂基因文庫是指生物染色體基因組各DNA片片段的克隆總體。文庫中的每一個克隆只含基因段的克隆總體。文庫中的每一個克隆只含基因組中某一特定的組中某一特定的DNA片段。片段。一個理想的基因文庫應(yīng)包括該生物染色體基因一個理想的基因文庫應(yīng)包括該生物染色體基因組全部遺傳信息（即全部組全部遺傳信息（即全部DNA序列）。序列）。2、基因文庫的構(gòu)建步驟：、基因文庫的構(gòu)建步驟：（1）從組織或細(xì)胞提取基因組）從組織或細(xì)胞提取基因組DNA；（2）用限制性酶部分水解或機(jī)械剪切成適當(dāng)長度）用限制性酶部分水解或機(jī)械剪切成適當(dāng)長度DNA 片段，經(jīng)分級選出一定

41、大小合適克隆片段，經(jīng)分級選出一定大小合適克隆DNA片段；片段；（3）選擇容載量較大的克隆載體，通常采用）選擇容載量較大的克隆載體，通常采用噬菌體或噬菌體或 柯斯質(zhì)粒載體，在適當(dāng)位點(diǎn)將載體切開；柯斯質(zhì)粒載體，在適當(dāng)位點(diǎn)將載體切開；（4）將基因組）將基因組DNA片段與載體進(jìn)行體外連接；片段與載體進(jìn)行體外連接；（5）重組體）重組體DNA直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌或用體外包裝的重組直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌或用體外包裝的重組噬噬 菌體顆粒感染敏感細(xì)菌細(xì)胞。最后得到攜帶重組菌體顆粒感染敏感細(xì)菌細(xì)胞。最后得到攜帶重組 DNA的細(xì)菌群體或噬菌體群體即構(gòu)成基因文庫。的細(xì)菌群體或噬菌體群體即構(gòu)成基因文庫。2. cDNA文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建所謂

42、所謂cDNA文庫是指生物體全部文庫是指生物體全部mRNA的的cDNA克隆總體。克隆總體。cDNA文庫中的每一個克隆只含一種文庫中的每一個克隆只含一種mRNA信息。信息。由于真核生物基因組十分龐大，因此要求構(gòu)建基因文庫的由于真核生物基因組十分龐大，因此要求構(gòu)建基因文庫的庫容量要足夠大，才能篩選到某一目的基因。但基于這樣庫容量要足夠大，才能篩選到某一目的基因。但基于這樣一個事實(shí)，即細(xì)胞中的一個事實(shí)，即細(xì)胞中的mRNA分子數(shù)要比基因組的基因數(shù)分子數(shù)要比基因組的基因數(shù)小得多（通常大約僅有小得多（通常大約僅有15%左右基因被表達(dá)），因而若由左右基因被表達(dá)），因而若由mRNA逆轉(zhuǎn)錄為逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，那么

43、所構(gòu)建的，那么所構(gòu)建的cDNA文庫的庫容量文庫的庫容量相應(yīng)比基因文庫小。相應(yīng)比基因文庫小。構(gòu)建構(gòu)建cDNA文庫的主要步驟：文庫的主要步驟：從生物體或細(xì)胞中提取從生物體或細(xì)胞中提取mRNA。利用逆轉(zhuǎn)錄酶以寡聚利用逆轉(zhuǎn)錄酶以寡聚(dT)或隨機(jī)寡聚核苷酸為引物合或隨機(jī)寡聚核苷酸為引物合成成cDNA的第一條鏈。的第一條鏈。利用利用DNA聚合酶聚合酶I，以，以cDNA第一條鏈作為模板，用適第一條鏈作為模板，用適當(dāng)引物合成當(dāng)引物合成cDNA第二條鏈第二條鏈;常用常用RNA酶酶H在雜交分子在雜交分子的的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物引物;或是除去雜交分子的或是

44、除去雜交分子的mRNA后，加入隨機(jī)引物，即可后，加入隨機(jī)引物，即可合成第二條鏈。合成第二條鏈。cDNA與載體的體外連接。與載體的體外連接。噬菌體的體外包裝及感染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。由于噬菌體的體外包裝及感染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。由于cDNA不不含基因的啟動子和內(nèi)含子，因而序列比基因短，其克含基因的啟動子和內(nèi)含子，因而序列比基因短，其克隆載體可選用質(zhì)?；虿《据d體。隆載體可選用質(zhì)?；虿《据d體。六、重組體的篩選與鑒定六、重組體的篩選與鑒定1. 重組體表型特征的鑒定重組體表型特征的鑒定 2. 重組重組DNA分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定 3. 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定外源基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 1. 重組體表型特征

45、的鑒定(1) 抗生素平板法抗生素平板法 (2) 插入失活法插入失活法 (3) 插入表達(dá)法插入表達(dá)法 (4) -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法抗生素平板法缺點(diǎn)缺點(diǎn):假陽性高假陽性高插入失活法 因外源因外源 DNA 的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱為插入失活（象，稱為插入失活（ insertional inactivation ）插入表達(dá)法 在某些載體的標(biāo)記基因前面連接一段負(fù)控制序列，在某些載體的標(biāo)記基因前面連接一段負(fù)控制序列，當(dāng)外源當(dāng)外源 DNA 片段插入該負(fù)控制序列中，使負(fù)控制片段插入該負(fù)控制序列中，使負(fù)控制序列失活，因而位于下游的標(biāo)記基因因解除阻遏而序列失活，

46、因而位于下游的標(biāo)記基因因解除阻遏而得到表達(dá)。得到表達(dá)。例如質(zhì)粒例如質(zhì)粒 pTR262 有一個負(fù)調(diào)控的有一個負(fù)調(diào)控的 cI 基因，當(dāng)外基因，當(dāng)外源源 DNA 片段插入片段插入 cI 基因中的基因中的 BcII 或或 HindIII 位點(diǎn)，位點(diǎn)，造成造成 cI 基因失活，位于基因失活，位于 cI 基因下游的基因下游的 tet 基因基因（受（受 cI 基因控制）因解除阻遏而被表達(dá)，轉(zhuǎn)化后的基因控制）因解除阻遏而被表達(dá)，轉(zhuǎn)化后的重組體細(xì)胞，在含有四環(huán)素的平板中可形成菌落；重組體細(xì)胞，在含有四環(huán)素的平板中可形成菌落； - 半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法 蘭蘭-白斑篩選：某些載體，如白斑篩選：某些載體，如M13，P

47、UC系列，系列，PGEM質(zhì)粒系列等，都帶有質(zhì)粒系列等，都帶有l(wèi)ac Z基因的一段序列，基因的一段序列，編碼編碼半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的肽；而宿主細(xì)胞為肽；而宿主細(xì)胞為Lac Z M15的突變株時，的突變株時， 肽可與肽可與M15進(jìn)行進(jìn)行互補(bǔ)，產(chǎn)互補(bǔ)，產(chǎn)生具有活性的生具有活性的半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。若將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有異丙基硫代若將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有異丙基硫代-D-半乳糖苷半乳糖苷(IPTG)和呈色物質(zhì)和呈色物質(zhì)5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷(Xgal)培養(yǎng)基的平板上時，可形成藍(lán)色菌落。培養(yǎng)基的平板上時，可形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源當(dāng)外源DNA插入到這一區(qū)段，則會破壞插入到

48、這一區(qū)段，則會破壞互互補(bǔ)作用。這時若將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有補(bǔ)作用。這時若將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有IPTG和和Xgal培養(yǎng)基的平板上，則形成無色培養(yǎng)基的平板上，則形成無色菌落。菌落。2. 重組DNA分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定菌落（或噬菌斑）原位雜交（菌落（或噬菌斑）原位雜交（ in situ hybridization ） 內(nèi)切酶圖譜鑒定內(nèi)切酶圖譜鑒定 PCR 鑒定鑒定 菌落（或噬菌斑）原位雜交將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)在瓊脂平板上，當(dāng)形成菌落或噬菌斑后，再將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)在瓊脂平板上，當(dāng)形成菌落或噬菌斑后，再將硝酸纖維濾膜貼在平板上，使菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖將硝酸纖維濾膜貼在平板上，使菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上。

49、維濾膜上。翻轉(zhuǎn)此濾膜并置于另一不含菌的平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)后的濾膜翻轉(zhuǎn)此濾膜并置于另一不含菌的平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)后的濾膜上可長出菌落或噬菌斑。取出濾膜，用裂解液處理使菌體裂上可長出菌落或噬菌斑。取出濾膜，用裂解液處理使菌體裂解，釋放出解，釋放出 DNA 。再用堿處理，使再用堿處理，使 DNA 變性，經(jīng)烘烤將變性變性，經(jīng)烘烤將變性 DNA 固定于濾膜固定于濾膜上。然后用放射性同位素標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交，并上。然后用放射性同位素標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交，并經(jīng)放射自顯影，黑點(diǎn)代表雜交上的菌落，即可篩選到陽性克經(jīng)放射自顯影，黑點(diǎn)代表雜交上的菌落，即可篩選到陽性克隆。隆。內(nèi)切酶圖譜鑒定 將初步篩選的陽

50、性克隆小量培養(yǎng)后，提取重將初步篩選的陽性克隆小量培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體 DNA ，用，用 12 種內(nèi)切種內(nèi)切酶酶切，然后進(jìn)行凝膠電泳，檢測插入酶酶切，然后進(jìn)行凝膠電泳，檢測插入 DNA 片段大小。片段大小。 雙酶切鑒定重組質(zhì)粒雙酶切鑒定重組質(zhì)粒 PCR 鑒定 通過與插入片段兩側(cè)互補(bǔ)的引物，以重組質(zhì)粒通過與插入片段兩側(cè)互補(bǔ)的引物，以重組質(zhì)粒 DNA 作為模板進(jìn)行作為模板進(jìn)行 PCR 分析，可快速測出插入分析，可快速測出插入 DNA 片段大小及鑒定其序列特異性。片段大小及鑒定其序列特異性。 DNA 序列測定 最后為了確證目的基因序列的正確性，必須最后為了確證目的基因序列

51、的正確性，必須對重組體的對重組體的 DNA 進(jìn)行序列測定進(jìn)行序列測定 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 表達(dá)產(chǎn)物免疫活性測定表達(dá)產(chǎn)物免疫活性測定 表達(dá)產(chǎn)物生物活性檢查表達(dá)產(chǎn)物生物活性檢查 表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列測定表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列測定 表達(dá)產(chǎn)物免疫活性測定Western blot with anti-Sak antisera (rabbit)表達(dá)產(chǎn)物生物活性檢查表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列測定一般分析一般分析N-末端（末端（15個殘基序列）和個殘基序列）和C-末末端（一般端（一般5個）氨基酸鑒別蛋白質(zhì)的性質(zhì)和個）氨基酸鑒別蛋白質(zhì)的性質(zhì)和同質(zhì)性；同質(zhì)性；9.5 表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的主要目的是使外源

52、基因能在細(xì)菌、酵基因工程的主要目的是使外源基因能在細(xì)菌、酵母或動、植物細(xì)胞中得到高效表達(dá)，以便獲得大母或動、植物細(xì)胞中得到高效表達(dá)，以便獲得大量有益的基因表達(dá)產(chǎn)物或改變微生物或動、植物量有益的基因表達(dá)產(chǎn)物或改變微生物或動、植物的遺傳性狀。的遺傳性狀。 所謂表達(dá)載體（所謂表達(dá)載體（ expression vector ）是指宿主）是指宿主細(xì)胞基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基細(xì)胞基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。 用原核細(xì)胞表達(dá)真核生物基因時，應(yīng)注意的問題用原核細(xì)胞表達(dá)真核生物基因時，應(yīng)注意的問題 基因的編碼區(qū)必須是連續(xù)的，

53、因此要用切除內(nèi)含基因的編碼區(qū)必須是連續(xù)的，因此要用切除內(nèi)含子的子的 cDNA ； 基因必須置于原核細(xì)胞啟動子、終止子和基因必須置于原核細(xì)胞啟動子、終止子和 SD 序序列的控制之下，才能被宿主的轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)有列的控制之下，才能被宿主的轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)有效識別；效識別； 產(chǎn)生的產(chǎn)生的 mRNA 必須相對穩(wěn)定并能有效進(jìn)行翻譯和必須相對穩(wěn)定并能有效進(jìn)行翻譯和蛋白質(zhì)折疊。此外還要防止外源蛋白被宿主蛋白蛋白質(zhì)折疊。此外還要防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解。酶降解。 一一 主要調(diào)控元件主要調(diào)控元件 啟動子啟動子核糖體的結(jié)合位點(diǎn)核糖體的結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號轉(zhuǎn)錄終止信號（ 1 ）、啟動子）、啟動子 （ promot

54、er ） 啟動子是指啟動子是指 RNA 聚合酶結(jié)合于聚合酶結(jié)合于 DNA 并起始合成并起始合成 RNA 的的一段一段 DNA 控制序列?？刂菩蛄小Ｔ嘶騿幼游挥谵D(zhuǎn)錄起點(diǎn)（原核基因啟動子位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)（ transcription initiation ）上游（左側(cè)），它由兩段彼此分開且又高度保守的核心序上游（左側(cè)），它由兩段彼此分開且又高度保守的核心序列組成。列組成。一個稱為一個稱為 -10 區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游約區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游約 10bp 處；處； RNA 聚合酶于該處解開聚合酶于該處解開 DNA 雙鏈，并決定轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)；雙鏈，并決定轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)；另一個稱為另一個稱為 -35 區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄

55、起點(diǎn)上游約區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游約 35bp 處，是處，是 RNA 聚合酶識別并結(jié)合的位點(diǎn)。聚合酶識別并結(jié)合的位點(diǎn)。 原核表達(dá)系統(tǒng)中常用啟動子原核表達(dá)系統(tǒng)中常用啟動子 lac 啟動子，是乳糖操縱子的啟動子，受啟動子，是乳糖操縱子的啟動子，受 lac I 編碼的阻遏編碼的阻遏蛋白調(diào)節(jié)控制；蛋白調(diào)節(jié)控制； trp 啟動子，是色氨酸操縱子啟動子，受啟動子，是色氨酸操縱子啟動子，受 trpR 編碼的阻遏編碼的阻遏蛋白調(diào)控；蛋白調(diào)控； tac 啟動子，由啟動子，由 lac 啟動子的啟動子的 -10 區(qū)和區(qū)和 trp 啟動子啟動子 -35 區(qū)融區(qū)融合而成，匯合了合而成，匯合了 lac 和和 trp 兩者優(yōu)點(diǎn)

56、，是一個很強(qiáng)的啟動子，兩者優(yōu)點(diǎn)，是一個很強(qiáng)的啟動子，同樣受同樣受 LacI 阻遏蛋白調(diào)控阻遏蛋白調(diào)控 。 P(L 、 R) 啟動子，是啟動子，是噬菌體左、右向啟動子，其溫度敏感噬菌體左、右向啟動子，其溫度敏感的阻遏蛋白受溫度調(diào)控；的阻遏蛋白受溫度調(diào)控； T 7 噬菌體啟動子，比大腸桿菌啟動子強(qiáng)得多且十分專一，噬菌體啟動子，比大腸桿菌啟動子強(qiáng)得多且十分專一，只被只被 T 7 RNA 聚合酶所識別。聚合酶所識別。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)原核微生物的原核微生物的 mRNA 結(jié)合核糖體的序列最初是由結(jié)合核糖體的序列最初是由夏英（夏英（ Shine ）和達(dá)爾加諾（）和達(dá)爾加諾（ Dalgarmo

57、）發(fā)現(xiàn)的，）發(fā)現(xiàn)的，因此稱為因此稱為 SD 序列序列;在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合點(diǎn)包括起始密碼子在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合點(diǎn)包括起始密碼子 (AUG) 及位于起始密碼子上游及位于起始密碼子上游 11bp 處，長度處，長度為為 bp 的序列的序列;這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與核糖體小亞基上這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與核糖體小亞基上 16S rRNA 3 端一段富含嘧啶的保守序列互補(bǔ)，從端一段富含嘧啶的保守序列互補(bǔ)，從而帶動核糖體與而帶動核糖體與 mRNA 的結(jié)合。的結(jié)合。 轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子指一段位于基因或操縱子的轉(zhuǎn)錄終止子指一段位于基因或操縱子的 末端，末端，具有終止轉(zhuǎn)錄功能的特定

58、具有終止轉(zhuǎn)錄功能的特定 DNA 序列。高效表達(dá)載序列。高效表達(dá)載體應(yīng)該含有終止子，因?yàn)楹铣傻捏w應(yīng)該含有終止子，因?yàn)楹铣傻?mRNA 過長，不過長，不僅消耗細(xì)胞內(nèi)的底物和能量，且易使僅消耗細(xì)胞內(nèi)的底物和能量，且易使 mRNA 形成形成妨礙翻譯的二級結(jié)構(gòu)。妨礙翻譯的二級結(jié)構(gòu)。 密碼子的偏愛性密碼子的偏愛性 由于密碼子的簡并性，一個氨基酸可有多個密碼由于密碼子的簡并性，一個氨基酸可有多個密碼子。子。在原核生物細(xì)胞中，對于在原核生物細(xì)胞中，對于 tRNA 豐富的密碼子稱豐富的密碼子稱為偏愛密碼子（為偏愛密碼子（ biased codons ），而對應(yīng)于），而對應(yīng)于 tRNA 稀少的密碼子稱為稀有密碼子

59、（稀少的密碼子稱為稀有密碼子（ rare codons ） 二二 表達(dá)載體中調(diào)節(jié)開關(guān)的作用表達(dá)載體中調(diào)節(jié)開關(guān)的作用 通常表達(dá)載體不應(yīng)使外源基因始終處于轉(zhuǎn)通常表達(dá)載體不應(yīng)使外源基因始終處于轉(zhuǎn)錄和翻譯之中。這是由于某些有價值的外錄和翻譯之中。這是由于某些有價值的外源蛋白可能對宿主細(xì)胞是有毒的，外源蛋源蛋白可能對宿主細(xì)胞是有毒的，外源蛋白的過量表達(dá)必將影響細(xì)胞生長；白的過量表達(dá)必將影響細(xì)胞生長； 宿主細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)應(yīng)該分成兩宿主細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)應(yīng)該分成兩個階段進(jìn)行。個階段進(jìn)行。第一階段使含有外源基因的宿主細(xì)胞迅速生長第一階段使含有外源基因的宿主細(xì)胞迅速生長直至獲得足夠量的細(xì)胞。

60、直至獲得足夠量的細(xì)胞。第二階段是啟動開關(guān)，使所有細(xì)胞外源基因同第二階段是啟動開關(guān)，使所有細(xì)胞外源基因同時高效表達(dá)，產(chǎn)生大量有價值的表達(dá)產(chǎn)物。時高效表達(dá)，產(chǎn)生大量有價值的表達(dá)產(chǎn)物。外源基因表達(dá)常采用化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)與溫度誘導(dǎo)外源基因表達(dá)常采用化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)與溫度誘導(dǎo)兩種不同方法。兩種不同方法?；瘜W(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo) 當(dāng)用當(dāng)用lac啟動子構(gòu)建表達(dá)載體時，啟動子構(gòu)建表達(dá)載體時，lac啟動子受啟動子受CAP蛋白和蛋白和cAMP的正調(diào)控。受阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控；的正調(diào)控。受阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控；當(dāng)宿主細(xì)胞生長時，當(dāng)宿主細(xì)胞生長時，lac I基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因操縱基因結(jié)合，阻礙外源