囊泡庫的循環(huán)·綜述2013.6.24

1、囊泡庫的循環(huán)葛建龍2013-6-24神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸囊泡循環(huán)囊泡庫及其可塑性突觸囊泡以及其和其他對象相互作用的分子結(jié)構突觸囊泡攝取神經(jīng)遞質(zhì)胞吐時的膜融合及調(diào)控SV2s對鈣濃度水平的調(diào)節(jié)突觸蛋白對囊泡庫的調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸囊泡循環(huán)鈣誘導的神經(jīng)遞質(zhì)釋放鈣內(nèi)流觸發(fā)快速的同步釋放和慢速的非同步釋放花萼狀突觸：研究在一個動作電位就能觸發(fā)的同步釋放的最好例子花萼的terminal有600個突觸連接，而一個動作電位就能觸發(fā)200個突觸連接產(chǎn)生釋放鈣電流開始于動作電位的峰值之前，并在完全再極化之前結(jié)束鈣內(nèi)流導致胞內(nèi)0.5ms左右的濃度瞬變，使動作電位和囊泡釋放之間只有一個短暫的延時（0.05ms-0.5

2、ms），然后鈣很快消散，能及時阻止囊泡的繼續(xù)釋放需要多少的鈣能導致釋放？20M:飽和因此鈣高效快速的結(jié)合到鈣感受蛋白是很有必要的依賴鈣的釋放的假說Bollmann：一個動作電位產(chǎn)生一個大致的鈣離子瞬變持續(xù)時間的高斯分布，瞬變的平均持續(xù)時間為0.4ms，平均每一個待釋放囊泡（pool size = 800 vesicles）處于9um濃度的鈣環(huán)境中，并有25%的釋放概率現(xiàn)在更多的研究表明：釋放與鈣離子濃度呈線性關系鈣通道如何被組織？EGTA阻斷50%釋放：大多數(shù)囊泡并不連在鈣通道上囊泡在活性區(qū)隨機成簇分布，囊泡離鈣通道距離30-300nm不等不同的囊泡不同的釋放概率，但不能排除囊泡異質(zhì)性影響釋放

3、概率的可能性鈣與鈣感受蛋白的結(jié)合導致融合孔打開 鈣觸發(fā)的快速釋放預示著鈣結(jié)合到鈣感受蛋白僅僅觸發(fā)融合孔的打開而不是復雜的級聯(lián)效應 融合孔的開放概率決定于相應細胞膜的張力和構成：高滲和拉伸細胞膜都影響了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放突觸小泡內(nèi)吞與循環(huán)胞吐之后的內(nèi)吞能有多塊？單個囊泡胞吐（自發(fā)放）后的內(nèi)吞回收值約56ms一個或低頻率的多個動作電位導致的約兩百或上千囊泡釋放后的值約115msAt 20Hz或333Hz的值分別為2.3s和8.3s刺激的頻率增加內(nèi)吞速率顯著減慢，但減慢的速度依賴于凈的膜面積的增加未回收的囊泡數(shù)量決定了內(nèi)吞的速率，預示著局部膜的張力不僅驅(qū)動胞吐，也驅(qū)動內(nèi)吞參與內(nèi)吞體回收的一些蛋白的介紹

4、Vti1a：參與反式高爾基體網(wǎng)絡和內(nèi)吞體中的融合反應，但不參與細胞膜的融合 Rab5：招募效應蛋白（例如磷脂酰激酶3，它的阻斷導致神經(jīng)遞質(zhì)釋放受損）運輸囊泡使其與內(nèi)吞體融合。網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞體的存在價值？為什么需要高頻刺激的誘導？ 假設1：局部快速循環(huán)容量有限，不能維持在高頻率刺激下的持續(xù)穩(wěn)定的釋放，而內(nèi)吞體的循環(huán)容量大而彌補了速度的不足 假設2：內(nèi)吞體作為囊泡好壞的分選站囊泡庫及其可塑性 循環(huán)庫：在長刺激的情況下參與胞吐與內(nèi)吞的所有囊泡，包括可釋放囊泡庫（RRP）和儲備庫（RP），RP用來填充可RRP 海馬神經(jīng)元熒光標記實驗顯示每一個突觸的循環(huán)庫有21-25個囊泡，RRP只有4-8個囊泡

5、不同的突觸中囊泡庫的數(shù)量和大小不同突觸前的可塑性調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放的兩個要點：動作電位引導的最大鈣濃度在給定鈣濃度下的釋放概率 鈣離子最高濃度依賴于動作電位形狀（例如動作電位的持續(xù)時間），鈣通道打開概率和鈣通道打開時的胞外鈣濃度 對應鈣濃度下的釋放概率主要依賴于可釋放囊泡數(shù)量，以及他們對鈣的響能力 例如在重復刺激時可釋放囊泡庫的減少會 導致短時程抑制研究突觸功能的方法研究突觸傳遞可以通過生理學描述和分子生物學鑒定的方法相結(jié)合生理學描述現(xiàn)象，分子生物學試圖對其解釋，因此生理學往往處于發(fā)展的最前端。生理學發(fā)展可以讓我們看到突觸的很多現(xiàn)象，但是分子機制往往并不清楚突觸前生理的分子機制解釋重要的分子需要在生

6、化特征和結(jié)構特征上被鑒定，例如蛋白-蛋白的相互作用，細胞的亞定位重要分子的功能需要通過體內(nèi)擾亂來研究1：過表達2：加入化學藥劑來干擾3：遺傳修飾，如基因敲除突觸囊泡的分子結(jié)構以及和它相互作用的成分突觸囊泡 囊泡非常小，大概20nm的半徑，蛋白與磷脂的構成比例為1:3。 包含兩類必要的成分：1，轉(zhuǎn)運蛋白，涉及遞質(zhì)的攝取，它又由質(zhì)子泵和遞質(zhì)轉(zhuǎn)運子組成；2，交易蛋白質(zhì)組（trafficking proteome），包括內(nèi)在膜蛋白和周邊蛋白等等活性區(qū)和突觸前膜活性區(qū)：活性區(qū)由定位于突觸前膜的高電子密度的非可溶性物質(zhì)組成有多個大的蛋白質(zhì)在活性區(qū)形成了極大的單復合體，他們包括：Munc13，RIM，ERC

7、（(ELKS/Rab3-interacting molecule/CAST)），RIM-BP，Piccolo， Bassoon等。RIM（Rab3-interacting molecule ）RIM是活性區(qū)的中心成分，它直接或間接連接到囊泡膜蛋白，結(jié)構包括 1，N端的鋅指結(jié)構域，和囊泡蛋白Rab3及活性區(qū)蛋白Munc13-1相互作用2，一個中心PDZ區(qū)域，連接ERC的C端3，兩個C端結(jié)構域與囊泡蛋白的2種相互作用方式：1，GTP依賴的與Rab3的結(jié)合2，鈣依賴的與syt1的結(jié)合囊泡對神經(jīng)遞質(zhì)的攝取 神經(jīng)遞質(zhì)的攝取由質(zhì)子泵驅(qū)動，它是一個大的多蛋白復合體，主要由具有ATP酶活性的外周復合體V1和介

8、導質(zhì)子移位的內(nèi)源性膜復合體V0組成 質(zhì)子泵產(chǎn)生的電化學梯度驅(qū)動所有神經(jīng)遞質(zhì)的攝取，囊泡攝取由代表4個攝取系統(tǒng)的7個轉(zhuǎn)運子所介導 谷氨酸鹽：3種轉(zhuǎn)運子 一元胺：2種轉(zhuǎn)運子 GABA和甘氨酸：1種轉(zhuǎn)運子 乙酰膽堿：1種轉(zhuǎn)運子特定轉(zhuǎn)運子的表達是特定神經(jīng)遞質(zhì)存在的決定因素，而神經(jīng)遞質(zhì)可以共表達在神經(jīng)遞質(zhì)中每個突觸中遞質(zhì)釋放的數(shù)量不一樣，一個解釋是囊泡大小的差異，另外質(zhì)子泵和轉(zhuǎn)運子的表達情況也可能影響單個囊泡的遞質(zhì)釋放數(shù)量胞吐時的膜融合 胞內(nèi)膜融合涉及到SNARE蛋白形成核心緊密復合體。 SNARE蛋白由一個70殘基序列的稱作SNARE基序的結(jié)構所界定。當4類SNARE基序被組成一個平行4螺旋束時核心復

9、合體就形成，可以促使相應的膜靠得更近而融合 4類SNARE 基序：R，Qa，Qb，Qc ，當4類基序都存在時穩(wěn)定的核心復合體才會形成 囊泡與前膜的融合就由3種SNARE蛋白介導：囊泡膜上的Synaptobrevin（R-SNARE 基序）以及前膜上Syntaxin 1（ Qa-SNARE 基序）和SNAP-25（ Qb，Qc-SNARE 基序） Complexins：一種小神經(jīng)蛋白，結(jié)合到核心復合體上，對突觸囊泡的融合并不必須，但可以增強syt1的作用 SNARE復合體的形成由稱作SM的蛋白控制，他們與syntaxin-like SNARE蛋白相互作，例如Munc18-1結(jié)合到syntaxin

10、的關閉構象上，阻止它的基序參與復合體的形成SM （Sec1/Munc18-like）另外幾種突觸蛋白調(diào)節(jié)復合體的組裝，如tomosyn能取代synaptobrevin，干擾其行為阻斷胞吐。synaptophysin作為囊泡膜蛋白。直接結(jié)合到synaptobrevin，而結(jié)合了synaptophysin的synaptobrevin又不能參與復合體的形成是否僅憑SNARE基序就可以驅(qū)動膜融合？ 當消除synaptobrevin，引起了胞吐的大部分損傷，但留下10%的完整胞吐，預示著還有別的蛋白參與，SNAP-25KO也是如此 消除Munc18-1可以完全阻斷胞吐，而消除synaptobrevin不

11、會完全阻斷胞吐 目前數(shù)據(jù)都支持SNARE是最好的觸發(fā)融合的因子，但是使膜靠得更近或許要被別的細胞機制所取代 除了synaptobrevin，囊泡還存在具有Qb基序的SNARE蛋白Vtila，它在內(nèi)吞體和高爾基體的融合反應中起作用，不需要與synaptobrevin作用，說明復合體的形成并不是都一定要SNARE基序介導鈣結(jié)合到synaptotagmin（Syt）觸發(fā)的融合 快速的胞吐涉及到鈣結(jié)合到鈣感受蛋白上，Syt1和Syt2是作為鈣的感受蛋白的囊泡蛋白synaptotagmin（Syt） Syt由一個短的胞內(nèi)氮端序列，一個單次跨膜區(qū)，一個短的連接區(qū)和兩個C2區(qū)（the C2A and C2B

12、 domains）組成。Syt1和Syt2有高度相似的序列，但他們與鈣的結(jié)合能力不同，相差了2倍。 Syt1對于快速胞吐是必須的 Syt1KO mice產(chǎn)生一個致命表型，該表型包含了鈣激發(fā)的快速胞吐的消失 C2A的突變改變了Syt1與快速胞吐的鈣結(jié)合力 Syt1的C2A，C2B可以分別結(jié)合3,2個鈣，他們在平時與鈣的結(jié)合力差，但是當C2結(jié)構域結(jié)合到磷脂時與鈣的結(jié)合力會攀升Syt1的活動機制 Syt1能夠部分鈣依賴性的與SNARE結(jié)合，是否鈣依賴的Syt1與SNARE的結(jié)合對于鈣觸發(fā)的胞吐是必須的？ Sr2+能夠取代鈣觸發(fā)胞吐，但它無法使SNARE與Syt1結(jié)合，因此，即使SNARE與Syt1不

13、結(jié)合，細胞也會發(fā)生胞吐 非依賴鈣的Syt1與SNARE的結(jié)合的作用：1，在融合孔打開之前，SNARE復合體組裝之后能使Syt1與SNARE復合體靠得更近2，招募更多的囊泡到RRPSNARE，Syt，complexin的囊泡胞吐模型 SNARE復合體的形成促使囊泡與前膜形成一個不穩(wěn)定的融合態(tài)，可通過complexin結(jié)合到SNARE復合體而變得穩(wěn)定，Syt1可在缺乏鈣的情況下結(jié)合到SNARE，但是一旦結(jié)合鈣，就會迅速結(jié)合到磷脂膜上，使融合中間體不穩(wěn)定，于是打開融合孔 非同步釋放的鈣感受蛋白 Syt家族中的Syt3,6,7等成員可以作為胞吐慢成分的鈣感受蛋白，他們有很強的鈣親和力，可以在低鈣濃度下

14、觸發(fā)非同步釋放Rab3對胞吐的調(diào)節(jié)Rab蛋白形成一個大的GTP結(jié)合蛋白家族，它們可以調(diào)控細胞內(nèi)的運輸。突觸囊泡至少包含3個Rab家族的成員：Rab3，Rab5和Rab11，而Rab3A占了所有Rab蛋白的25%Rab3的循環(huán)結(jié)合GTPRab3-GTP與囊泡結(jié)合囊泡與前膜融合GTP水解成為GDP，Rab3-GDP被GDI從囊泡解離Rab3再次結(jié)合GTPRab3-GTP重新結(jié)合到囊泡Rab3A KO表型1，海馬CA1區(qū)域的Rab3A KO表現(xiàn)出短時程可塑性的改變2，CA3區(qū)域的KO則剝奪了mossy-fiber LTP，LTP受PKA激活，而Rab3A不是PKA的底物，因此，LTP并不是簡單地由R

15、ab3A的磷酸化而被激活從以上Rab3的KO表型表明Rab3在不同區(qū)域有不同的功能，而興奮性突觸由此可分為兩類，1，可以依賴PKA的LTP，但是還需要Rab3的介導；2，沒有LTP，但是依賴Rab3的短程可塑性。Rab3的效應蛋白有2類Rab3的效應蛋白，他們只結(jié)合到Rab3-GTP：Rabphilin：使Rab3結(jié)合到突觸囊泡上，并可結(jié)合鈣RIM1/2：屬于活性區(qū)蛋白，沒有鈣結(jié)合位點Rabphilin敲除小鼠沒有引起很大的損傷，也沒有表現(xiàn)出Rab3A敲除的表現(xiàn)RIM1 KO卻引起突觸強度很大的下降，在短程可塑性中引起了很大的改變，在CA3區(qū)域也沒有了LTP，Munc13-1水平下降（Rab3

16、A中Munc13-1不變）Rab3A結(jié)合到RIM1可以使囊泡?？?，但是RIM1 KO沒有改變?？磕遗莸臄?shù)量，與Rab3A KO表型一致RIM1調(diào)節(jié)囊泡釋放，通過它的N端與Rab3和Munc13-1連接，通過PDZ區(qū)域與ERC連接，通過C端與-liprins及Syt1相連Betz et al. 2001, Ohtsuka et al. 2002, Schoch et al. 2002, Wang et al. 2002Rab3與RIM1如何參與mossy fiber-type LTP？LTP的出現(xiàn)需要2個信號的一致：1，GTP依賴的Rab3A結(jié)合到RIM12， RIM1通過PKA的磷酸化這個機制

17、也許引起活性區(qū)的重構導致了可釋放囊泡數(shù)量或鈣所觸發(fā)的釋放的概率的增加。Munc13-1和Rab3競爭性結(jié)合到RIM1的N端，Rab3結(jié)合到RIMs就會失活Munc13，可能然后允許Munc13招募更多的RIN到活性區(qū)而增加了活性區(qū)的面積導致釋放增加。SV2s也許調(diào)節(jié)鈣水平SV2s是囊泡的組成部分，包括SV2A，SV2B和SV2C。SV2蛋白有12個跨膜結(jié)構域，N端和C端都在胞質(zhì)中SV2A或SV2B缺陷的細胞沒有表現(xiàn)出釋放的下降或RRP的減小，若兩個亞型都缺乏，則鈣依賴的突觸傳遞增加，它可被EGTA逆轉(zhuǎn)，表明缺失SV2引起鈣在突觸前膜的累積SV2缺陷突觸預示著SV2也許是鈣的轉(zhuǎn)運者，但是在嗜鉻細胞中SV2缺乏卻表現(xiàn)出了胞吐的減小。一個可能的假說是囊泡腔內(nèi)的鈣可以穩(wěn)定嗜鉻顆粒結(jié)構，鈣的減小導致囊泡的不穩(wěn)定，導致RRP的缺失synapsins對囊泡庫的控制synapsin：非常豐富的突觸囊泡蛋白，作為一種周邊膜蛋白包被在囊泡表面，是cAMP,Ca2+/calmodulin激活酶的底物，確切功能還不十分清楚3種synapsin有類似的N端和中心結(jié)構域，但是C端序列不同synapsin1：僅在有鈣的條